人可溶性IL-6R及其突变体基因在COS7细胞中的表达及活性分析①
作者：宋伦 任蕴芳 王建安 沈倍奋
单位：宋 伦 任蕴芳 王建安 沈倍奋 (军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)
关键词：人可溶性IL-6R(hsIL-6R)；突变体；生物学活性
中国免疫学杂志/990505 摘 要 目的：研究人可溶性IL-6R(hsIL-6R)的空间构效关系，为小分子拮抗剂设计提供理论依据。方法：首先利用PCR技术扩增天然人sIL-6R基因片段，然后将第280位His残基突变成Ile。天然基因和突变体基因分别转染COS7细胞，经ELISA和Western blot检测证实转染细胞上清中的表达产物，并利用Binding assay ELISA和生物学功能分析法检测表达产物与IL-6的结合能力以及它们所介导的IL-6信号转导功能的差异。结果：突变体H280I比天然sIL-6R具有更高的IL-6结合能力，但拮抗IL-6在两种效应细胞系上的信号传递功能。结论：第280位His残基对sIL-6R发挥正常生物学功能具有重要影响，是符合拮抗剂设计要求的一个很好的候选位点。
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中国图书分类号 R392.11
Expression and biological activity analysis of human soluble IL-6R and its mutant
SONG Lun，REN Yun-Fang，WANG Jian-An et al.
Institute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850
Abstract Objective:To study the structure-function relationship of human soluble IL-6 receptor(hsIL-6R) and lay a foundation to design the antagonists.Methods:The sIL-6R gene was obtained by PCR and then histine 280 was mutanted into isolucine with site-directed mutagenesis system.The expression plasmids of the two genes were introduced into COS7 cells and then the expressed products were confirmed by ELISA and Western blot.IL-6 binding abilities were measured by binding assay ELISA.The biological function analysis of the expressed products on the IL-6 responsive cells indicated their different abilities of signal transduction.Results:The mutant H280I had higher IL-6 binding ability than that of wtsIL-6R,but showed antagonistic function on IL-6 signal transdution.Conclusion:H280 played an important role in the function of sIL-6R and might be used as a target site for the antagonist design.
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Key words Human soluble IL-6R Mutant Biological activity
IL-6是一种多功能的细胞因子，它的多功能性是由其受体介导的。IL-6R由α、β两条链组成，二者都具有膜结合性和可溶性受体两种形式，α链为配基特异性受体(一般称IL-6R)，β链是IL-6类型的细胞因子的公用转导子，也称GP130[1]，α链具有同IL-6结合并进一步与GP130偶联的能力，它的这种生物学功能是由其胞外区细胞因子结合功能域(也称CBD区)执行的[2]。目前，对CBD区的结构和功能的研究国外已取得了一定进展，并分别确定了该区域中与IL-6结合以及与GP130结合有关的一些氨基酸残基，其中第280位的His残基是影响sIL-6R与GP130结合能力的决定性因素之一，但基本不影响其与 IL-6 的结合能力[2，3]。在本文中，我们首先克隆了天然人sIL-6R基因，并进而将第280位的His突变成Ile，即同时改变氨基酸的电荷性质及大小，将二者同时在COS7细胞中表达后，分析它们的生物学性质，为进一步研究sIL-6R空间构效关系打下了基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 酶和试剂 所用工具酶分别购自Promega公司、Gibco公司。LIPOFECTIN\,DMEM\,1640为Gibco公司产品。DNA序列分析试剂盒为USB公司产品。“DNA 体外突变系统”(Alters Sites II in vitro Mutagenesis System)为Promega公司产品。sIL-6R抗血清为本室自制。Bio-SAR-IgG、Avidin-HRP购自华美公司。
1.1.2 质粒、菌种 携带有人IL-6R cDNA的质粒由日本大阪大学Hirano教授惠赠。克隆质粒pALTER-1、菌种JM109由“DNA体外突变系统”提供。表达质粒pSVL、pCMV4为本室保存。
1.1.3 细胞株 COS7细胞用含10%FCS的DMEM培养基传代培养；7TD1为IL-6依赖的小鼠杂交瘤细胞系，用含10%FCS，5×10-5mol/L 2-ME的1640培养基传代培养，并添加2 ng/ml的IL-6；R2细胞为LT12细胞(大鼠急性髓系白血病细胞系)转染了人IL-6R基因后建立的细胞系[4]，对IL-6的反应为生长抑制性，用含10%FCS的1640培养基传代培养。以上细胞系均由本室保存。
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1.2 方法
1.2.1 DNA重组技术 参照文献[5]。
1.2.2 DNA序列分析 采用USB公司Sequence Version 2.0 DNA Sequence Kit，并按其说明书进行。
1.2.3 DNA定点突变 按Promega公司“DNA体外突变系统”说明书进行并略加改动。
1.2.4 脂质体介导DNA转染COS7细胞 按Gibco公司的LIPOFECTIN使用说明书进行。
1.2.5 sIL-6R的ELISA检测及定量 用梯度稀释的标准 sIL-6R(每孔100 μl)包被酶联板，4℃过夜，经1%BSA 37℃封闭2 h后，依次加入sIL-6R抗血清、Biotin标记的SAR-IgG和Avidin-HRP,OPD显色10～15 min，1 mol/L H2SO4终止反应。表达上清50 μl与等体积包被液混匀后包被酶联板进行检测。
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1.2.6 Western blot检测 转染细胞上清于20% PEG溶液中，浓缩4～5 h(约15倍)后，取20 μl走SDS-PAGE电泳，经转印、封闭、抗体结合等步骤后显色。
1.2.7 Binding assay ELISA法检测sIL-6R与IL-6的结合能力 用IL-6(10 μg/ml)包被酶联板(每孔100 μl)，经1%BSA 37℃封闭2 h后，加入梯度稀释的标准sIL-6R，于37℃作用3 h或4℃过夜，再加入sIL-6R抗血清和HRP-SAR-IgG，分别于37℃作用1 h，OPD显色，1 mol/L H2SO4终止反应。sIL-6R及突变体基因转染的COS7细胞培养上清经ELISA定量后，以等量水平加入酶联板，稀释液采用无血清DMEM培养基。
1.2.8 sIL-6R的生物学活性测定 7TD1细胞：参考文献[6]，测试前，用无血清1640培养基洗3次，37℃ 5%CO2孵箱中饥饿1～2 h后，以5×104 ml-1的浓度悬浮并接种入96孔板中(每孔100 μl)，每孔加入不同浓度IL-6及等量的天然sIL-6R或其突变体表达上清，按终体积为200 μl在每孔中补加适当体积的10%FCS-140，72 h后加入MTT(5 mg/ml，每孔15 μl)，继续孵育5 h，用10%酸性SDS溶解沉淀过夜，并于570 nm处测定光密度值。R2细胞：细胞按1×105 ml-1接种入96孔板中(每孔100 μl)，每孔加入不同浓度的IL-6及等量的天然sIL-6R或其突变体表达上清，48 h后加入MTT，以下步骤同上。
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2 结果
2.1 人sIL-6R基因的PCR扩增和克隆 分别设计了起始于sIL-6R起始密码子ATG并带有BamHI位点的1号上游引物(5′ATGGATCCATGCTGGCCGTCG-GC 3′)和终止于IL-6R胞外区近膜侧第354位氨基酸残基并带有终止密码子和BamHI位点的2号下游引物(5′TCGGATCCTAGAGGCTTGTCGCATTTGC 3′)；用这对引物以含有人IL-6R cDNA的质粒为模板扩增全长为1 062 bp的sIL-6R基因片段(电泳鉴定结果略)。扩增条件：95℃ 10 min，72℃ 2 min，进入以下5个循环：95℃ 1 min,52℃ 1 min，72℃ 2 min;进入下20个循环：94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 2 min。
我们选择了由“DNA体外突变系统”提供的能够直接进行定点突变操作的pALTER-1质粒作为克隆载体，将sIL-6R基因片段经BamHI酶切后连入BamHI -CIP处理的pALTER-1载体，获得克隆质粒PA6R，经酶切鉴定PA6R构建正确(电泳结果略)。目的基因片段的全序列(氨基酸序列)分析结果与文献报道一致[7]。图1A所示为部分核苷酸序列分析结果，其它序列分析结果略。
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2.2 突变引物设计和目的基因突变 第280位的His残基是影响sIL-6R生物学功能的几个关键氨基酸残基之一[2]，因此我们首先选择该位点进行突变。突变引物设计如下：
(Ile)
5′CATCACTGTGTCATCATCGACGCCTGGAGCGG 3′。
原序列 CAC
在该引物的中间位置引入突变核苷酸AT代替原序列CA以实现His→Ile的定点突变，其余序列与原序列相同。该引物加入到突变反应体系后，使目的基因实现了第280位His→Ile的定点突变，该突变体命名为H280I。图1B所示为H280I的部分序列分析结果(突变位置箭头所示)，目的突变位点以外的其余核苷酸序列与天然基因相同。
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图1 天然sIL-6R及其突变体H280I的部分核苷酸序列分析结果
Fig.1 Sequencing of wtsIL-6R and its mutant H280I gene
Note:A:wtsIL-6R gene;B:sIL-6R H280I gene
2.3 表达质粒的构建及鉴定 pSVL和pCMV4真核表达载体分别由SV40晚期启动子和人CMV启动子启动外源基因表达。我们将wtsIL-6R及H280I基因片段分别从克隆载体中切下，以相应位点连入pSVL和pCMV4载体中，获得了两个天然基因表达质粒pSVL6R、pCMV6R和两个突变体基因表达质粒pSVL6RM、pCMV6RM(构建过程及酶切电泳鉴定结果略)。
2.4 目的基因转染COS7细胞及表达产物的ELISA定量 我们将wtsIL-6R及突变体H280I基因的表达质粒分别转染COS7细胞，在48～50 h后收获培养上清进行ELISA检测，并参照标准sIL-6R的检测结果对表达产物进行了初步定量。结果如下：pSVL用于表达天然sIL-6R基因的表达量约为25 ng/ml，而用于表达突变体H280I基因时，表达量上升为60～70 ng/ml；同样pCMV4载体用于表达天然基因的表达量分别为80、140、220 ng/ml，而表达突变体基因的表达量上升至140、270、400 ng/ml。由此可见，sIL-6R在第280位突变成Ile后，可使表达量升高约2倍左右。
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2.5 表达产物的Western blot检测 转染细胞上清经PEG浓缩后，取20 μl走SDS-PAGE电泳，经转印、封闭、抗体结合等步骤后显色。结果天然sIL-6R及突变体H280I的表达上清中都可检测到一条分子量为50 kD的特异性表达条带(Western结果略)，与预期结果吻合。
2.6 天然sIL-6R及突变体H280I的IL-6 结合能力比较 我们自行建立了一个Binding assay ELISA的方法用来检测sIL-6R与配基IL-6的结合能力，即以IL- 6包被酶联板，依次加入不同量的标准sIL-6R、sIL-6R抗血清、酶标二抗SAR-HRP及其底物并显色。结果显示在一定量范围内，标准sIL-6R与IL-6的结合能力具有较好的线性相关关系(标准曲线略)。我们在这个线性范围内加入等量的天然sIL-6R或H280I的表达产物进行检测，结果表明，天然sIL-6R和突变体H280I与IL-6的结合能力存在显著差异(P<0.01，数据未显示)。图2所示的是两批表达产物的检测结果，可见sIL-6R H280I与IL-6的结合能力比同等量的天然sIL-6R有明显提高。
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图2 sIL-6R及其突变体H280I与IL-6结合能力比较
Fig.2 IL-6 binding assay ELISA of wtsIL-6R and its mutant H280I
Note:A1～A8：standard sIL-6R(0.000,0.084,0.320,1.600,8.000,40.000,200.000,1 000.000 ng)；B1～B3：first transfected supernatant;B4～B6：second transfected supernatant；B1、B4：mock control;B2、B5：sIL-6R(100.000 ng);B4、B6:sIL-6R H280I(100.000 ng)
2.7 sIL-6R及其突变体H280I的生物学活性比较 我们在7TD1、R2两种IL-6效应细胞系上检测了wtsIL-6R及H280I介导的IL-6信号传递效应。与空载体对照相比，wtsIL-6R可明显增强IL-6对7TD1的生长促进作用，而突变体蛋白却拮抗了IL-6对7TD1的生长促进作用(图3)。同样wtsIL-6R可加强IL-6对R2细胞的生长抑制作用，而突变体H280I却可部分拮抗IL-6对R2细胞的生长抑制性(图4)。
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图3 sIL-6R及其突变体H280I对7TD1细胞生长的影响(x±s,n=6)
Fig.3 Effect of sIL-6R and its mutant H280I on the growth of 7TD1 cells in the presence of IL-6(x±s,n=6)
图4 sIL-6R及其突变体H280I对R2细胞生长的影响(x±s,n=5)
Fig.4 Effect of sIL-6R and its mutant H280I on the growth of R2 cells in the presence of IL-6(x±s,n=5)
3 讨论
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COS7细胞作为一种真核瞬时表达系统，是研究蛋白质结构与功能的有利工具，多种载体可用于在COS7细胞中表达外源基因。pSVL载体含有SV40晚期启动子和加poly A信号，文献中曾采用此载体成功地进行了sIL-6R在COS7细胞中的表达工作[8]。我们同时选择的另一表达载体pCMV4，由人巨细胞病毒(CMV)启动子启动目的基因表达，并具有hGH转录终止信号，使sIL-6R在COS7细胞中的表达量比pSVL载体有显著提高，这无疑对利用瞬时表达系统研究sIL-6R的结构与功能是十分有利的。
第280位的His残基是sIL-6R发挥正常生物学功能的几个关键氨基酸残基之一[2，3]，但该位点突变成Ile后不但未降低其在COS7细胞中的表达，反而使表达量提高约两倍，这说明这种突变可能导致sIL-6R在空间结构上产生一定变化，更有利于该蛋白在COS7细胞中的分泌表达。
IL-6系统的信号传递功能依赖于IL-6、IL-6R及GP130三个分子的顺次结合。我们构建的突变体H280I仍具有与IL-6结合的能力，说明它对IL-6信号传递功能的拮抗作用体现在其与GP130的结合这一过程中。我们分析可能是这点突变减弱了sIL-6R与GP130的结合能力，也可能该点突变虽不影响IL-6/sIL-6R复合物同GP130的结合能力，却使三分子复合物的空间构象发生了某种改变，从而阻断了GP130后续的胞内信号传导途径。
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IL-6及sIL-6R在体内的异常表达与多种疾病密切相关，因此IL-6系统拮抗剂的研究具有潜在的临床应用前景。我们所构建的突变体H280I在体外能够与IL-6结合，并可部分拮抗IL-6所介导的生物学功能，是符合拮抗剂设计要求的一个很好的候选对象。
①本课题由国家自然科学基金资助(No.39480025)
作者简介：宋 伦，女，25岁，生物化学专业硕士生；
指导教师，任蕴芳，女，副研究员，主要从事生物化学和发展免疫学等方向的研究
4 参考文献
[1] Hirano T,Matsuda T,Nakajima K et al.Signal transduction through gp130 that is shared among the receptors for the IL-6 related cytokine subfamily.Stem Cell,1994；12(3):262
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[2] Yawata H,Yasukawa K,Natsuka S et al.Structure-function analysis of human IL-6R:dissociation of amino acid residues required for IL-6 binding and for IL-6 signal transduction through gp130.EMBO J,1993；12(4):1705
[3] Salvati A L,Lahm A,Paonessa G et al.IL-6 antagonism by soluble IL-6 receptor α mutanted in the predicated gp130 binding surface.J Bio Chem,1995;270:12242
[4] 任蕴芳，郭 宁，张贺秋 et al.重组人白细胞介素6(IL-6)受体基因导入大鼠白血病细胞及基因表达.中国实验血液学杂志，1994;2(1)：35
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[5] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T. Molecular cloning.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratary Press,1989: 16-68
[6] Snick V,Cayphas S,Vink A et al.Purification and NH2-terminal of amino acid sequence of a T-cell-derived lymphokine for B-cell-hybridomas.Proc Natl Acad Sci USA,1986;83:7679
[7] Yamasaki K,Taga T,Hirata Y et al.Cloning and expression of the human IL-6R (BSF-2/IFNβ-2).Science,1988;241:825
[8] Tasukawa K,Saito T,Fukunaga T et al.Purification and characterization of soluble human IL-6 receptor expressed in CHO cells.J Biochem,1990;108:673
〔收稿1997-01-27 修回1998-03-20〕, 百拇医药
单位：宋 伦 任蕴芳 王建安 沈倍奋 (军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)
关键词：人可溶性IL-6R(hsIL-6R)；突变体；生物学活性
中国免疫学杂志/990505 摘 要 目的：研究人可溶性IL-6R(hsIL-6R)的空间构效关系，为小分子拮抗剂设计提供理论依据。方法：首先利用PCR技术扩增天然人sIL-6R基因片段，然后将第280位His残基突变成Ile。天然基因和突变体基因分别转染COS7细胞，经ELISA和Western blot检测证实转染细胞上清中的表达产物，并利用Binding assay ELISA和生物学功能分析法检测表达产物与IL-6的结合能力以及它们所介导的IL-6信号转导功能的差异。结果：突变体H280I比天然sIL-6R具有更高的IL-6结合能力，但拮抗IL-6在两种效应细胞系上的信号传递功能。结论：第280位His残基对sIL-6R发挥正常生物学功能具有重要影响，是符合拮抗剂设计要求的一个很好的候选位点。
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SONG Lun，REN Yun-Fang，WANG Jian-An et al.
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Abstract Objective:To study the structure-function relationship of human soluble IL-6 receptor(hsIL-6R) and lay a foundation to design the antagonists.Methods:The sIL-6R gene was obtained by PCR and then histine 280 was mutanted into isolucine with site-directed mutagenesis system.The expression plasmids of the two genes were introduced into COS7 cells and then the expressed products were confirmed by ELISA and Western blot.IL-6 binding abilities were measured by binding assay ELISA.The biological function analysis of the expressed products on the IL-6 responsive cells indicated their different abilities of signal transduction.Results:The mutant H280I had higher IL-6 binding ability than that of wtsIL-6R,but showed antagonistic function on IL-6 signal transdution.Conclusion:H280 played an important role in the function of sIL-6R and might be used as a target site for the antagonist design.
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Key words Human soluble IL-6R Mutant Biological activity
IL-6是一种多功能的细胞因子，它的多功能性是由其受体介导的。IL-6R由α、β两条链组成，二者都具有膜结合性和可溶性受体两种形式，α链为配基特异性受体(一般称IL-6R)，β链是IL-6类型的细胞因子的公用转导子，也称GP130[1]，α链具有同IL-6结合并进一步与GP130偶联的能力，它的这种生物学功能是由其胞外区细胞因子结合功能域(也称CBD区)执行的[2]。目前，对CBD区的结构和功能的研究国外已取得了一定进展，并分别确定了该区域中与IL-6结合以及与GP130结合有关的一些氨基酸残基，其中第280位的His残基是影响sIL-6R与GP130结合能力的决定性因素之一，但基本不影响其与 IL-6 的结合能力[2，3]。在本文中，我们首先克隆了天然人sIL-6R基因，并进而将第280位的His突变成Ile，即同时改变氨基酸的电荷性质及大小，将二者同时在COS7细胞中表达后，分析它们的生物学性质，为进一步研究sIL-6R空间构效关系打下了基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 酶和试剂 所用工具酶分别购自Promega公司、Gibco公司。LIPOFECTIN\,DMEM\,1640为Gibco公司产品。DNA序列分析试剂盒为USB公司产品。“DNA 体外突变系统”(Alters Sites II in vitro Mutagenesis System)为Promega公司产品。sIL-6R抗血清为本室自制。Bio-SAR-IgG、Avidin-HRP购自华美公司。
1.1.2 质粒、菌种 携带有人IL-6R cDNA的质粒由日本大阪大学Hirano教授惠赠。克隆质粒pALTER-1、菌种JM109由“DNA体外突变系统”提供。表达质粒pSVL、pCMV4为本室保存。
1.1.3 细胞株 COS7细胞用含10%FCS的DMEM培养基传代培养；7TD1为IL-6依赖的小鼠杂交瘤细胞系，用含10%FCS，5×10-5mol/L 2-ME的1640培养基传代培养，并添加2 ng/ml的IL-6；R2细胞为LT12细胞(大鼠急性髓系白血病细胞系)转染了人IL-6R基因后建立的细胞系[4]，对IL-6的反应为生长抑制性，用含10%FCS的1640培养基传代培养。以上细胞系均由本室保存。
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1.2 方法
1.2.1 DNA重组技术 参照文献[5]。
1.2.2 DNA序列分析 采用USB公司Sequence Version 2.0 DNA Sequence Kit，并按其说明书进行。
1.2.3 DNA定点突变 按Promega公司“DNA体外突变系统”说明书进行并略加改动。
1.2.4 脂质体介导DNA转染COS7细胞 按Gibco公司的LIPOFECTIN使用说明书进行。
1.2.5 sIL-6R的ELISA检测及定量 用梯度稀释的标准 sIL-6R(每孔100 μl)包被酶联板，4℃过夜，经1%BSA 37℃封闭2 h后，依次加入sIL-6R抗血清、Biotin标记的SAR-IgG和Avidin-HRP,OPD显色10～15 min，1 mol/L H2SO4终止反应。表达上清50 μl与等体积包被液混匀后包被酶联板进行检测。
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1.2.6 Western blot检测 转染细胞上清于20% PEG溶液中，浓缩4～5 h(约15倍)后，取20 μl走SDS-PAGE电泳，经转印、封闭、抗体结合等步骤后显色。
1.2.7 Binding assay ELISA法检测sIL-6R与IL-6的结合能力 用IL-6(10 μg/ml)包被酶联板(每孔100 μl)，经1%BSA 37℃封闭2 h后，加入梯度稀释的标准sIL-6R，于37℃作用3 h或4℃过夜，再加入sIL-6R抗血清和HRP-SAR-IgG，分别于37℃作用1 h，OPD显色，1 mol/L H2SO4终止反应。sIL-6R及突变体基因转染的COS7细胞培养上清经ELISA定量后，以等量水平加入酶联板，稀释液采用无血清DMEM培养基。
1.2.8 sIL-6R的生物学活性测定 7TD1细胞：参考文献[6]，测试前，用无血清1640培养基洗3次，37℃ 5%CO2孵箱中饥饿1～2 h后，以5×104 ml-1的浓度悬浮并接种入96孔板中(每孔100 μl)，每孔加入不同浓度IL-6及等量的天然sIL-6R或其突变体表达上清，按终体积为200 μl在每孔中补加适当体积的10%FCS-140，72 h后加入MTT(5 mg/ml，每孔15 μl)，继续孵育5 h，用10%酸性SDS溶解沉淀过夜，并于570 nm处测定光密度值。R2细胞：细胞按1×105 ml-1接种入96孔板中(每孔100 μl)，每孔加入不同浓度的IL-6及等量的天然sIL-6R或其突变体表达上清，48 h后加入MTT，以下步骤同上。
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2 结果
2.1 人sIL-6R基因的PCR扩增和克隆 分别设计了起始于sIL-6R起始密码子ATG并带有BamHI位点的1号上游引物(5′ATGGATCCATGCTGGCCGTCG-GC 3′)和终止于IL-6R胞外区近膜侧第354位氨基酸残基并带有终止密码子和BamHI位点的2号下游引物(5′TCGGATCCTAGAGGCTTGTCGCATTTGC 3′)；用这对引物以含有人IL-6R cDNA的质粒为模板扩增全长为1 062 bp的sIL-6R基因片段(电泳鉴定结果略)。扩增条件：95℃ 10 min，72℃ 2 min，进入以下5个循环：95℃ 1 min,52℃ 1 min，72℃ 2 min;进入下20个循环：94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃ 2 min。
我们选择了由“DNA体外突变系统”提供的能够直接进行定点突变操作的pALTER-1质粒作为克隆载体，将sIL-6R基因片段经BamHI酶切后连入BamHI -CIP处理的pALTER-1载体，获得克隆质粒PA6R，经酶切鉴定PA6R构建正确(电泳结果略)。目的基因片段的全序列(氨基酸序列)分析结果与文献报道一致[7]。图1A所示为部分核苷酸序列分析结果，其它序列分析结果略。
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2.2 突变引物设计和目的基因突变 第280位的His残基是影响sIL-6R生物学功能的几个关键氨基酸残基之一[2]，因此我们首先选择该位点进行突变。突变引物设计如下：
(Ile)
5′CATCACTGTGTCATCATCGACGCCTGGAGCGG 3′。
原序列 CAC
在该引物的中间位置引入突变核苷酸AT代替原序列CA以实现His→Ile的定点突变，其余序列与原序列相同。该引物加入到突变反应体系后，使目的基因实现了第280位His→Ile的定点突变，该突变体命名为H280I。图1B所示为H280I的部分序列分析结果(突变位置箭头所示)，目的突变位点以外的其余核苷酸序列与天然基因相同。
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图1 天然sIL-6R及其突变体H280I的部分核苷酸序列分析结果
Fig.1 Sequencing of wtsIL-6R and its mutant H280I gene
Note:A:wtsIL-6R gene;B:sIL-6R H280I gene
2.3 表达质粒的构建及鉴定 pSVL和pCMV4真核表达载体分别由SV40晚期启动子和人CMV启动子启动外源基因表达。我们将wtsIL-6R及H280I基因片段分别从克隆载体中切下，以相应位点连入pSVL和pCMV4载体中，获得了两个天然基因表达质粒pSVL6R、pCMV6R和两个突变体基因表达质粒pSVL6RM、pCMV6RM(构建过程及酶切电泳鉴定结果略)。
2.4 目的基因转染COS7细胞及表达产物的ELISA定量 我们将wtsIL-6R及突变体H280I基因的表达质粒分别转染COS7细胞，在48～50 h后收获培养上清进行ELISA检测，并参照标准sIL-6R的检测结果对表达产物进行了初步定量。结果如下：pSVL用于表达天然sIL-6R基因的表达量约为25 ng/ml，而用于表达突变体H280I基因时，表达量上升为60～70 ng/ml；同样pCMV4载体用于表达天然基因的表达量分别为80、140、220 ng/ml，而表达突变体基因的表达量上升至140、270、400 ng/ml。由此可见，sIL-6R在第280位突变成Ile后，可使表达量升高约2倍左右。
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2.5 表达产物的Western blot检测 转染细胞上清经PEG浓缩后，取20 μl走SDS-PAGE电泳，经转印、封闭、抗体结合等步骤后显色。结果天然sIL-6R及突变体H280I的表达上清中都可检测到一条分子量为50 kD的特异性表达条带(Western结果略)，与预期结果吻合。
2.6 天然sIL-6R及突变体H280I的IL-6 结合能力比较 我们自行建立了一个Binding assay ELISA的方法用来检测sIL-6R与配基IL-6的结合能力，即以IL- 6包被酶联板，依次加入不同量的标准sIL-6R、sIL-6R抗血清、酶标二抗SAR-HRP及其底物并显色。结果显示在一定量范围内，标准sIL-6R与IL-6的结合能力具有较好的线性相关关系(标准曲线略)。我们在这个线性范围内加入等量的天然sIL-6R或H280I的表达产物进行检测，结果表明，天然sIL-6R和突变体H280I与IL-6的结合能力存在显著差异(P<0.01，数据未显示)。图2所示的是两批表达产物的检测结果，可见sIL-6R H280I与IL-6的结合能力比同等量的天然sIL-6R有明显提高。
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图2 sIL-6R及其突变体H280I与IL-6结合能力比较
Fig.2 IL-6 binding assay ELISA of wtsIL-6R and its mutant H280I
Note:A1～A8：standard sIL-6R(0.000,0.084,0.320,1.600,8.000,40.000,200.000,1 000.000 ng)；B1～B3：first transfected supernatant;B4～B6：second transfected supernatant；B1、B4：mock control;B2、B5：sIL-6R(100.000 ng);B4、B6:sIL-6R H280I(100.000 ng)
2.7 sIL-6R及其突变体H280I的生物学活性比较 我们在7TD1、R2两种IL-6效应细胞系上检测了wtsIL-6R及H280I介导的IL-6信号传递效应。与空载体对照相比，wtsIL-6R可明显增强IL-6对7TD1的生长促进作用，而突变体蛋白却拮抗了IL-6对7TD1的生长促进作用(图3)。同样wtsIL-6R可加强IL-6对R2细胞的生长抑制作用，而突变体H280I却可部分拮抗IL-6对R2细胞的生长抑制性(图4)。
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图3 sIL-6R及其突变体H280I对7TD1细胞生长的影响(x±s,n=6)
Fig.3 Effect of sIL-6R and its mutant H280I on the growth of 7TD1 cells in the presence of IL-6(x±s,n=6)
图4 sIL-6R及其突变体H280I对R2细胞生长的影响(x±s,n=5)
Fig.4 Effect of sIL-6R and its mutant H280I on the growth of R2 cells in the presence of IL-6(x±s,n=5)
3 讨论
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COS7细胞作为一种真核瞬时表达系统，是研究蛋白质结构与功能的有利工具，多种载体可用于在COS7细胞中表达外源基因。pSVL载体含有SV40晚期启动子和加poly A信号，文献中曾采用此载体成功地进行了sIL-6R在COS7细胞中的表达工作[8]。我们同时选择的另一表达载体pCMV4，由人巨细胞病毒(CMV)启动子启动目的基因表达，并具有hGH转录终止信号，使sIL-6R在COS7细胞中的表达量比pSVL载体有显著提高，这无疑对利用瞬时表达系统研究sIL-6R的结构与功能是十分有利的。
第280位的His残基是sIL-6R发挥正常生物学功能的几个关键氨基酸残基之一[2，3]，但该位点突变成Ile后不但未降低其在COS7细胞中的表达，反而使表达量提高约两倍，这说明这种突变可能导致sIL-6R在空间结构上产生一定变化，更有利于该蛋白在COS7细胞中的分泌表达。
IL-6系统的信号传递功能依赖于IL-6、IL-6R及GP130三个分子的顺次结合。我们构建的突变体H280I仍具有与IL-6结合的能力，说明它对IL-6信号传递功能的拮抗作用体现在其与GP130的结合这一过程中。我们分析可能是这点突变减弱了sIL-6R与GP130的结合能力，也可能该点突变虽不影响IL-6/sIL-6R复合物同GP130的结合能力，却使三分子复合物的空间构象发生了某种改变，从而阻断了GP130后续的胞内信号传导途径。
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IL-6及sIL-6R在体内的异常表达与多种疾病密切相关，因此IL-6系统拮抗剂的研究具有潜在的临床应用前景。我们所构建的突变体H280I在体外能够与IL-6结合，并可部分拮抗IL-6所介导的生物学功能，是符合拮抗剂设计要求的一个很好的候选对象。
①本课题由国家自然科学基金资助(No.39480025)
作者简介：宋 伦，女，25岁，生物化学专业硕士生；
指导教师，任蕴芳，女，副研究员，主要从事生物化学和发展免疫学等方向的研究
4 参考文献
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[4] 任蕴芳，郭 宁，张贺秋 et al.重组人白细胞介素6(IL-6)受体基因导入大鼠白血病细胞及基因表达.中国实验血液学杂志，1994;2(1)：35
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[8] Tasukawa K,Saito T,Fukunaga T et al.Purification and characterization of soluble human IL-6 receptor expressed in CHO cells.J Biochem,1990;108:673
〔收稿1997-01-27 修回1998-03-20〕, 百拇医药