HCV编码病毒结构蛋白的DNA免疫研究
作者：单梅梅 刘克洲 陈智
单位：浙江大学医学院附属一院传染病研究所，杭州 310031
关键词：丙型肝炎病毒；病毒结构区蛋白；DNA免疫
中国病毒学000104 摘 要：应用HCV C (pC)和HCV CE1E2(pCE1E2)重组体转染真核细胞并且通过肌注免疫BALB/C小鼠，对其体液免疫和细胞免疫进行检测。所用的pC和pCE1E2均可在真核细胞内表达出特异性HCV C蛋白；肌注DNA免疫后均可诱导出BALB/C小鼠的体液和细胞免疫反应，抗体反应的A值：pC组为0.358±0.096，pCE1E2组为0.415±0.127；CTL活力pC组为18.65%±5.72%，pCE1E2组为20.07%±11.11%；通过免疫鼠荷瘤检测体内CTL反应，可观察到免疫组鼠发瘤时间滞后，发瘤部位减少和存活时间延长。在开发和研制HCV疫苗的过程中，DNA免疫是在快速构建、评价和筛选免疫原方面的有效办法。
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分类号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0014-08
DNA Vaccination of the Induction of Immune Responses
by Hepatitis C Strutural Antigens
SHAN Mei-mei, LIU Ke-zhou, CHEN Zhi
(Institute of Infectious Disease, The First Affiliated Hosp ital, Medical School of Zhejiang University, Hangzhou 310006,China)
, 百拇医药
Abstract：Two recombinant plasmids were constructed. These include the coding regions for the core protein (pC) and for the core, E1 and E2 toget her (pCE1E2). These plasmids were transfected into mammalian cells to test t heir protein expression and injected into the quadriceps muscles of BALB/C mice to measure specific antibodies and cytotoxic T-lymphocyte responses. All there combinant plasmids were shown to express specific antigens transiently and stablyin cells and elicited both specific antibody responses and specific cytotoxic T lymphocyte responses. The A value of anticore were 0.358±0.096 (pC) and 0.415 ±0.127 (pCE1E2). The CTL activity of pC was 18.65%±5.71% and 20.07%±11.11% of pCE1E2. Genetic immunization can aid the development of hepatitis C virus vaccines by allowing for the rapid construction and evaluation of different expression plasmids as potential immunogens.
, 百拇医药
Key words：Hepatitis C Virus; Viral protein of structural regions; DNA immunization▲
近来一些实验结果提示DNA免疫能诱导针对HCV的特异性抗体和CTL反应，并在黑猩猩模型上 亦显示一定的保护作用[1～3]，说明发展HCV DNA疫苗是可行的。在HCV众多基因 型中，HCV C蛋白相对保守，并且针对C蛋白的细胞免疫，即CTL反应可减低感染者的慢性化 比率，因此在慢性感染者中HCV C区基因是诱导抗病毒免疫的主要候补基因。
本研究从我国输血后抗-HCV阳性病人血清中，采用RT-PCR法克隆出HCV C和CE1E2区基 因片段(测序证实为HCV Ⅱ/1b型)，构建高效真核细胞表达载体，建立起稳定表达HCV C蛋白 SP2/0和P815细胞系。用上述重组体免疫BALB/C小鼠，对其体液免疫和细胞免疫进行检测， 探讨HCV结构区抗原DNA免疫的可能性，进而推测其有效性，为今后HCV DNA疫苗的研制提供 实验和理论基础。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂 pcDNA3.1/His真核细胞表达载体购自美国Inv itrogen (San Diego,CA) Bluescript SK载体(华东制药厂徐放博士惠赠)，pCE1E2(浙 江医科大学传染病研究所窦骏博士惠赠)，MMLV逆转录酶(Promega),DNA聚合酶(Pow DNA Pol ymerase, Boe hringer Mannheim)，快速DNA连接试剂盒(Boehringer Mannheim)，立可读EIA(TMB-快速法 )检测抗-HCV试剂盒(上海科华生物技术有限公司)，Cyto To×96R Non-Radioactive Cy totoxicity Assay (Promega)。
1.2 细菌和细胞株 E.coli DH-5α，JM109，E.coli Top10’；小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)和小鼠肥大细胞瘤细胞(P815)购自中国科学 院上海细胞研究所。
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1.3 实验动物 BALB/C鼠，H-2d雄性，6～8周龄， 购于北京中国实验动物中心，属二级动物。
1.4 HCV C区基因的克隆 收集输血 后抗-HCV阳性病人血清，以Trizol Reagent抽提总RNA， MMLV逆转录酶合成第一链，以其 为模板进行HCV C的PCR扩增。上游引物为5′-CGAGGATCCAGCACAAATCCTAAACCTCAAAG-3′， 下游引物为5′-CTATCTAGAAGCGGAAGCTGGGATGGTCA-3′，上游引物设计了Bam HI酶切位点 ，下游引物设计了Xba I酶切位点，产物预计587bp。PCR反应体积为50μL，引物浓度0. 2μmol/L，扩增参数94℃ 1min，56℃ 1min,72℃ 1min，30个循环后产物进 行1%琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物经酶切后，克隆至pBluescript-SK载体上(pSK HCV-C) ，用T3和T7为引物进行双向测序。
1.5 HCV C真核表达载体的构建 按文献[4]提供的方法，pSK-HCV-C经Bam HI和Xba I双酶切后的片段定向插入pcDNA 3.1/H is中的相同位点，得到重组体pC。pC重组体含有CMV启动子、HCV C cDNA和BGH的PolyA终止 序列。pC大量制备，经纯化后备用。
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1.6 HCV C蛋白在真核细胞中表达 用Lipofectamine分别将pcDNA3.1/His (pBLANK)和pC转染P815和SP2/0细胞，G418压力筛选 ，用有限稀释法筛选出阳性细胞克隆。P815细胞系作为检测体外CTL反应的靶细胞，SP2/0细 胞作为检测体内CTL反应的靶细胞。
1.7 BALB/C鼠的DNA免疫及荷瘤实验 BALB/C小鼠，随机分为3组，每组均为10只，1组为对照组，注射pBLANK，2组注射pC，3组注射pCE1E2。质粒载体于小鼠股四头肌进行多点注射，首次均为200微克.次-1.只-1，以后改为100微克.次-1.只-1，每只小鼠免疫3次，间隔2周免疫一次。于最后一次免疫后4周，上述各组均有5只鼠用于荷瘤试验，5×105细胞/100μLSP2/0细胞分四点双胁部皮下注射，每隔3～5d观察记录肿瘤大小，发瘤部位和存活时间等，直至对照组全部死亡为止。
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1.8 BLAB/C鼠的血清抗-HCV检测 小鼠接受免疫后0、3、5、8周采血，无菌断尾取血，置4℃过夜，4000r/min，20min，收集上清，-20℃保存。用ELISA法检测抗-HCV，操作按立可读(TMB-ELISA)抗-HCV检测试剂盒操作指南进行。
1.9 体外CTL活力检测 最后一次免疫后两周，断颈处死，无菌取脾，灌洗法分离脾细胞，然后进行梯度密度离心，分离脾淋巴细胞，计数，用作效应细胞(Effector)用于CTL活力检测。同时收集稳定表达HCVC蛋白的P815细胞作为靶细胞(Target)，调整细胞浓度为5000细胞/50μL。分别调E∶T比例为50∶1和100∶1。检测培养上清中LDH浓度，计算CTL活力。操作按CytoTox96R Non-Radioactiv e Cytotoxicity Assay说明书进行。
1.10 统计学方法 比较两组之间的差异，用t检验。
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2 结果
2.1 HCV C区基因真核细胞表达载体的构建及鉴定 (见图1、图2)
用RT-PCR法从输血后抗-HCV阳性病人血清中扩增出预计大小的产物，测序证实为HCVII型/1bC区基因片段。以BamHI和XbaI为酶切位点定向插入真核表达载体pcDNA3.1/His中，经酶切证实为重组体，定名为pC。
图1 质粒pC和pCE1E2的简单物理图谱
Fig.1 Simple maps of the pC and pCE1E2
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图2 抗-HCV阳性病人血清中HCV C 区基因RT-PCR扩增产物和真核细胞重组体pC酶切鉴定
Fig.2 PCR amplification of HCV C cDNA fragment in blood samples
of HCV Infected patients and enzyme digestion of pC.
pCE1E2为窦骏博士构建[5]，包括HCV C、E1有部分E2区基因，核苷酸序 号为317～2009nt，基因片段长度为1.73kb，以EcoR I为酶切位点插入pCD-Sα1中，带 有SV40早期启动子、HTLV-1的重复长末端R-U5片段。
2.2 HCV结构蛋白在真核细胞中的表达
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pCE1E2转染Hela细胞并可表达出约110kD的特异性蛋白(见窦骏[5]另文发表)。
分别提取pC转染SP2/0和P815阳性细胞克隆内蛋白，经SDS-PAGE电泳后，一块胶做转膜，另一块胶染色固定；转膜后经Westernblot分析，出现约31kD的特异性条带(如图3，4)，从而证实所筛选的SP2/0和P815可正确、稳定地表达HCVC蛋白，并且该蛋白为胞内蛋白，非分泌型。
图3 HCVC蛋白在P815细胞中稳定表达
Fig.3 Stable expression in P815 cells of HCV C protein
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图4 HCV C蛋白在SP2/0细胞内稳 定表达
Fig.4 Stable expression in SP2/0 cells of HCV C protein
Lane 1. Mid-range protein molecular weight makers
Lane 2. The extract from SP2/0 cells without transfection
Lane 4. The extract from SP2/0 cells transfected with pBLANK
Lane 5. The extract from SP2/0 cells transfected with pC
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Lane 6. The result of Western blot of lane 5
在图3中，Lane 1为蛋白中分子量标准，Lane 2未加样品，Lane 3为pC转染P815细胞上清，L ane 4为pBLANK转染P815细胞阳性克隆细胞提取物电泳，Lane 5为pC转染P815阳性克隆的电 泳，Lane 6为pC转染P815细胞阳性克隆细胞内提取物的Westernblot结果。
在图4中，Lane1为蛋白中分子量标准，Lane2为SP2/0空白细胞抽提物对照，Lane3为pBLANK转染SP2/0阳性细胞克隆抽提物电泳，Lane4为pC转染SP2/0阳性克隆细胞提取物电泳，Lane6为pC转染SP2/0细胞阳性克隆细胞内提取物的Westernblot结果。
2.3 DNA免疫后BALB/C鼠抗-HCV检测 (见图5)
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第一次免疫后一周，除对照组外，实验组中均有4～6只鼠抗-HCV阳转，5周达8只，但至8周仍未全部阳转(表1)。各组抗-HCV平均A值为：pBLANK组为0.101±0.042，pC组为0.358±0.096，pCE1E2组为0.415±0.127。第一次免疫后8周达高峰(图5)。
表1 ELISA法检测抗-HCV阳性鼠数
Table1 Number of antiboddy-positive mice by ELISA Antibody
Plasmid
pBLANK
(n=10)
pC
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(n=10)
pCE1E2
(n=10)
Anti-HCV
O(0)*
8(4)
8(6)
*The antibody responses were detectable after the first or third or third boos t. Values in parentheses indicate the number of mice seroconverted by the first boost.
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图5 第八周各组免疫鼠抗-HCV 水平
Fig.5 Antibody responses at eighth week in every group of mice immunized w ith HCV structural region expression plasmids
2.4 体外CTL检测
用定量乳酸脱氢酶(LDH)法测定CTL活力，各组CTL反应平均值：对照组为8.26%±4.44%，pC 组为18.65%±5.71%，pCE1E2为29.97%±11.11%，最适效、靶细胞比例为100∶1(见图6) 。
图6 HCV结构区抗原DNA实验鼠的CTL 反应
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Fig.6 CTL responses in mice immunized with the HCV structural protein expressio n plasmids
2.5 体内CTL活力检测
荷瘤实验对照组较实验组鼠肿瘤出现早(平均12±3d)，注射pC和pCE1E2组为17±5d ；对照组肿瘤生长速度快，死亡时肿瘤一般>20mm；对照组较实验组存活时间短，一般于 肿瘤发生后10d内死亡，而实验组一般于15～20d后死亡。
3 讨论
近年来研究发现，应用带有外源基因的重组质粒DNA肌注小鼠，可以诱导针对该表达抗原的体液和细胞免疫。
我们的研究结果证明，pC和pCE1E2DNA免疫后，均能产生对HCVC区的特异性抗体，平均光密度(A值)分别为0.358±0.096和0.415±0.127，两组比较无显著差异(P>0.05)，提示联合E1E2的DNA免疫不能增强HCVC区诱导体液免疫反应的能力。但是对于pCE1E2免疫后是否可产生抗E1和抗E2，由于实验条件所限未予检测。同类研究报道，pCE1E2免疫后，可分别产生针对C、E1和E2的抗体，抗-E1和抗-E2的滴度分别较单纯pE1、pE2免疫的滴度为低，前者最高值(A值)为0.15和0.28，而后者可达0.48和0.38[6]。
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若要探讨DNA免疫所诱导的抗体有否中和作用，则需要建立起HCV的体外复制表达系统和简单、敏感的检测方法，目前尚无法做到。更进一步的研究则要证实DNA免疫产生的抗体能否在体外阻止HCV与细胞的结合，及对感染动物模型的保护作用。
对于疫苗免疫策略而言，若要对突变后的毒株产生保护性免疫，既需要诱导出交叉免疫的中和抗体，也要有识别突变株CTL反应。目前，DNA免疫诱导的CTL反应在一些病毒感染模型中介导出保护性免疫，可保护致死量的病毒对感染模型的攻击[7]。
既然HCV感染者体内存在的抗-HCV不对宿主产生免疫保护，由突变株而诱导的抗体亦无保护作用，那么细胞免疫能否在抵御感染和病毒清除中起作用
在我们的实验中，pC和pCE1E2均可诱导BALB/C鼠产生针对HCVC区的CTL反应，因为BALB/C鼠属H-2dⅠ类，靶细胞P815上仅表达MHCⅠ类分子，而不表达MHCⅡ类分子，所以上述结果提示HCVC区可能存在着受BALB/C鼠MHCⅠ类分子限制的CTL抗原表位。同时我们的实验结果提示pCE1E2免疫组小鼠的CTL反应(平均值29.97%±11.11%)较pC组(18.65%±5.71%)为高。但是我们无法得知E区是否也有可供BALB/C鼠识别的抗原表位，因为我们没有单独表达E区蛋白的靶细胞。而且在我们的实验中，针对C抗原的CTL反应较低是否由于检测方法不够敏感，或是通过肌注技术导入的DNA在抗原提呈，在免疫效率上较弱等所致，尚需进一步探讨。如若对于DNA免疫所诱导出的CTL反应有否保护性进行探讨，则需建立有效的动物模型进行验证，这在目前尚未具备条件。
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我们通过荷瘤的方法试图对体内CTL活力进行检测，结果对照组小鼠存活时间明显短于实验组，且肿瘤出现早，生长快。提示HCVDNA免疫可有效诱导体内CTL反应。
在我们的实验中，不是每只实验鼠都可产生抗体和CTL反应，但是我们无法确定这种反应的不一致性是由于近交系鼠属遗传上的免疫弱反应性还是我们技术上的不够完善。而且，若要研制广泛适用的DNA疫苗，则MHC的限制性亦将是难以愈越的障碍。所以提高免疫效率和增进免疫反应的一致性是目前急需解决的问题之一。
目前已经有了一些提高DNA免疫效率的方法，如设计嵌合基因免疫原，将多个T、B细胞表位组合在一起[8]，或增加表达肽段在胞内降解[9]，或与其它免疫佐剂联合应用[10]等。但根本的办法应对DNA免疫进行更为系统的研究，如对使用的载体进行改进，对抗原提呈的机理作进一步探讨，对DNA免疫的途径和所用动物的品种进行改进等。我们今后将在增强DNA免疫效率及改变免疫反应类型上进行探讨。
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综上所述，我们的结论是：利用HCV结构区基因重组体免疫BALB/C小鼠，可以诱导出特异性的体液和细胞免疫反应，但其CTL反应较弱，而且DNA免疫结果呈非一致性，原因尚待进一步探讨。
总之，DNA免疫从技术上为HCV疫苗的研制提供了快速、便捷的方法，应用前景广阔，同时，对于预防和治疗高突变率、易成持续慢性化的病毒性感染而言，DNA免疫应是最有前途、最有潜力的方法之一。
致谢 感谢姚航平先生、陈洪先生、陈勇博士、窦骏博士为本实验提供技术帮助。■
基金项目：本文为国家和省自然科学基金资助项目 39670665，396461
作者简介：单梅梅，女，哈尔滨人，36岁，博士，主治医师，主要从事病毒性肝炎防治研究。
参考文献：
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[4] Ausubel FM, Brent R, Kingston RE et al. Short protocols in molecular biology [M]. 3rd ed. John Wiley & Sons Inc. 1995.
[5] 窦骏，刘克洲，陈智等.HCV结构区重组质粒建蛋白表达及小鼠对重组质粒抗体反应 [J].中华实验临床免疫学杂志，1998，10(3)：150～155
[6] Saito T, Sherman, GJ, Kurokohchi K et al. Plasmid DNA-based immuniza tion for hepatitis C virus structural proteins: immune responses in mice [J]. Gast roenterology, 1997,112:1321～1330
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[9] Tobery TW, Siliciano RF. Targeting of HIV-1 antigens for rapid intracel lular degradation enhances cytotoxic T lymphocyte (CTL) recognition and the indu ction of de novo CTL responses in vivo after immunization [J].J Exp Med, 1997,185 :909
[10] Irvine KR, Rao JB, Rosenberg SA et al. Cytokine enhancement of DNA immunization leads to effective treatment of established pulmonary metastases [J]. J Immunol, 1996,156:238～245
收稿日期：1998-11-09
修稿日期：1999-05-06, http://www.100md.com
单位：浙江大学医学院附属一院传染病研究所，杭州 310031
关键词：丙型肝炎病毒；病毒结构区蛋白；DNA免疫
中国病毒学000104 摘 要：应用HCV C (pC)和HCV CE1E2(pCE1E2)重组体转染真核细胞并且通过肌注免疫BALB/C小鼠，对其体液免疫和细胞免疫进行检测。所用的pC和pCE1E2均可在真核细胞内表达出特异性HCV C蛋白；肌注DNA免疫后均可诱导出BALB/C小鼠的体液和细胞免疫反应，抗体反应的A值：pC组为0.358±0.096，pCE1E2组为0.415±0.127；CTL活力pC组为18.65%±5.72%，pCE1E2组为20.07%±11.11%；通过免疫鼠荷瘤检测体内CTL反应，可观察到免疫组鼠发瘤时间滞后，发瘤部位减少和存活时间延长。在开发和研制HCV疫苗的过程中，DNA免疫是在快速构建、评价和筛选免疫原方面的有效办法。
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分类号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0014-08
DNA Vaccination of the Induction of Immune Responses
by Hepatitis C Strutural Antigens
SHAN Mei-mei, LIU Ke-zhou, CHEN Zhi
(Institute of Infectious Disease, The First Affiliated Hosp ital, Medical School of Zhejiang University, Hangzhou 310006,China)
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Abstract：Two recombinant plasmids were constructed. These include the coding regions for the core protein (pC) and for the core, E1 and E2 toget her (pCE1E2). These plasmids were transfected into mammalian cells to test t heir protein expression and injected into the quadriceps muscles of BALB/C mice to measure specific antibodies and cytotoxic T-lymphocyte responses. All there combinant plasmids were shown to express specific antigens transiently and stablyin cells and elicited both specific antibody responses and specific cytotoxic T lymphocyte responses. The A value of anticore were 0.358±0.096 (pC) and 0.415 ±0.127 (pCE1E2). The CTL activity of pC was 18.65%±5.71% and 20.07%±11.11% of pCE1E2. Genetic immunization can aid the development of hepatitis C virus vaccines by allowing for the rapid construction and evaluation of different expression plasmids as potential immunogens.
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Key words：Hepatitis C Virus; Viral protein of structural regions; DNA immunization▲
近来一些实验结果提示DNA免疫能诱导针对HCV的特异性抗体和CTL反应，并在黑猩猩模型上 亦显示一定的保护作用[1～3]，说明发展HCV DNA疫苗是可行的。在HCV众多基因 型中，HCV C蛋白相对保守，并且针对C蛋白的细胞免疫，即CTL反应可减低感染者的慢性化 比率，因此在慢性感染者中HCV C区基因是诱导抗病毒免疫的主要候补基因。
本研究从我国输血后抗-HCV阳性病人血清中，采用RT-PCR法克隆出HCV C和CE1E2区基 因片段(测序证实为HCV Ⅱ/1b型)，构建高效真核细胞表达载体，建立起稳定表达HCV C蛋白 SP2/0和P815细胞系。用上述重组体免疫BALB/C小鼠，对其体液免疫和细胞免疫进行检测， 探讨HCV结构区抗原DNA免疫的可能性，进而推测其有效性，为今后HCV DNA疫苗的研制提供 实验和理论基础。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂 pcDNA3.1/His真核细胞表达载体购自美国Inv itrogen (San Diego,CA) Bluescript SK载体(华东制药厂徐放博士惠赠)，pCE1E2(浙 江医科大学传染病研究所窦骏博士惠赠)，MMLV逆转录酶(Promega),DNA聚合酶(Pow DNA Pol ymerase, Boe hringer Mannheim)，快速DNA连接试剂盒(Boehringer Mannheim)，立可读EIA(TMB-快速法 )检测抗-HCV试剂盒(上海科华生物技术有限公司)，Cyto To×96R Non-Radioactive Cy totoxicity Assay (Promega)。
1.2 细菌和细胞株 E.coli DH-5α，JM109，E.coli Top10’；小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)和小鼠肥大细胞瘤细胞(P815)购自中国科学 院上海细胞研究所。
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1.3 实验动物 BALB/C鼠，H-2d雄性，6～8周龄， 购于北京中国实验动物中心，属二级动物。
1.4 HCV C区基因的克隆 收集输血 后抗-HCV阳性病人血清，以Trizol Reagent抽提总RNA， MMLV逆转录酶合成第一链，以其 为模板进行HCV C的PCR扩增。上游引物为5′-CGAGGATCCAGCACAAATCCTAAACCTCAAAG-3′， 下游引物为5′-CTATCTAGAAGCGGAAGCTGGGATGGTCA-3′，上游引物设计了Bam HI酶切位点 ，下游引物设计了Xba I酶切位点，产物预计587bp。PCR反应体积为50μL，引物浓度0. 2μmol/L，扩增参数94℃ 1min，56℃ 1min,72℃ 1min，30个循环后产物进 行1%琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物经酶切后，克隆至pBluescript-SK载体上(pSK HCV-C) ，用T3和T7为引物进行双向测序。
1.5 HCV C真核表达载体的构建 按文献[4]提供的方法，pSK-HCV-C经Bam HI和Xba I双酶切后的片段定向插入pcDNA 3.1/H is中的相同位点，得到重组体pC。pC重组体含有CMV启动子、HCV C cDNA和BGH的PolyA终止 序列。pC大量制备，经纯化后备用。
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1.6 HCV C蛋白在真核细胞中表达 用Lipofectamine分别将pcDNA3.1/His (pBLANK)和pC转染P815和SP2/0细胞，G418压力筛选 ，用有限稀释法筛选出阳性细胞克隆。P815细胞系作为检测体外CTL反应的靶细胞，SP2/0细 胞作为检测体内CTL反应的靶细胞。
1.7 BALB/C鼠的DNA免疫及荷瘤实验 BALB/C小鼠，随机分为3组，每组均为10只，1组为对照组，注射pBLANK，2组注射pC，3组注射pCE1E2。质粒载体于小鼠股四头肌进行多点注射，首次均为200微克.次-1.只-1，以后改为100微克.次-1.只-1，每只小鼠免疫3次，间隔2周免疫一次。于最后一次免疫后4周，上述各组均有5只鼠用于荷瘤试验，5×105细胞/100μLSP2/0细胞分四点双胁部皮下注射，每隔3～5d观察记录肿瘤大小，发瘤部位和存活时间等，直至对照组全部死亡为止。
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1.8 BLAB/C鼠的血清抗-HCV检测 小鼠接受免疫后0、3、5、8周采血，无菌断尾取血，置4℃过夜，4000r/min，20min，收集上清，-20℃保存。用ELISA法检测抗-HCV，操作按立可读(TMB-ELISA)抗-HCV检测试剂盒操作指南进行。
1.9 体外CTL活力检测 最后一次免疫后两周，断颈处死，无菌取脾，灌洗法分离脾细胞，然后进行梯度密度离心，分离脾淋巴细胞，计数，用作效应细胞(Effector)用于CTL活力检测。同时收集稳定表达HCVC蛋白的P815细胞作为靶细胞(Target)，调整细胞浓度为5000细胞/50μL。分别调E∶T比例为50∶1和100∶1。检测培养上清中LDH浓度，计算CTL活力。操作按CytoTox96R Non-Radioactiv e Cytotoxicity Assay说明书进行。
1.10 统计学方法 比较两组之间的差异，用t检验。
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2 结果
2.1 HCV C区基因真核细胞表达载体的构建及鉴定 (见图1、图2)
用RT-PCR法从输血后抗-HCV阳性病人血清中扩增出预计大小的产物，测序证实为HCVII型/1bC区基因片段。以BamHI和XbaI为酶切位点定向插入真核表达载体pcDNA3.1/His中，经酶切证实为重组体，定名为pC。
图1 质粒pC和pCE1E2的简单物理图谱
Fig.1 Simple maps of the pC and pCE1E2
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图2 抗-HCV阳性病人血清中HCV C 区基因RT-PCR扩增产物和真核细胞重组体pC酶切鉴定
Fig.2 PCR amplification of HCV C cDNA fragment in blood samples
of HCV Infected patients and enzyme digestion of pC.
pCE1E2为窦骏博士构建[5]，包括HCV C、E1有部分E2区基因，核苷酸序 号为317～2009nt，基因片段长度为1.73kb，以EcoR I为酶切位点插入pCD-Sα1中，带 有SV40早期启动子、HTLV-1的重复长末端R-U5片段。
2.2 HCV结构蛋白在真核细胞中的表达
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pCE1E2转染Hela细胞并可表达出约110kD的特异性蛋白(见窦骏[5]另文发表)。
分别提取pC转染SP2/0和P815阳性细胞克隆内蛋白，经SDS-PAGE电泳后，一块胶做转膜，另一块胶染色固定；转膜后经Westernblot分析，出现约31kD的特异性条带(如图3，4)，从而证实所筛选的SP2/0和P815可正确、稳定地表达HCVC蛋白，并且该蛋白为胞内蛋白，非分泌型。
图3 HCVC蛋白在P815细胞中稳定表达
Fig.3 Stable expression in P815 cells of HCV C protein
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图4 HCV C蛋白在SP2/0细胞内稳 定表达
Fig.4 Stable expression in SP2/0 cells of HCV C protein
Lane 1. Mid-range protein molecular weight makers
Lane 2. The extract from SP2/0 cells without transfection
Lane 4. The extract from SP2/0 cells transfected with pBLANK
Lane 5. The extract from SP2/0 cells transfected with pC
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Lane 6. The result of Western blot of lane 5
在图3中，Lane 1为蛋白中分子量标准，Lane 2未加样品，Lane 3为pC转染P815细胞上清，L ane 4为pBLANK转染P815细胞阳性克隆细胞提取物电泳，Lane 5为pC转染P815阳性克隆的电 泳，Lane 6为pC转染P815细胞阳性克隆细胞内提取物的Westernblot结果。
在图4中，Lane1为蛋白中分子量标准，Lane2为SP2/0空白细胞抽提物对照，Lane3为pBLANK转染SP2/0阳性细胞克隆抽提物电泳，Lane4为pC转染SP2/0阳性克隆细胞提取物电泳，Lane6为pC转染SP2/0细胞阳性克隆细胞内提取物的Westernblot结果。
2.3 DNA免疫后BALB/C鼠抗-HCV检测 (见图5)
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第一次免疫后一周，除对照组外，实验组中均有4～6只鼠抗-HCV阳转，5周达8只，但至8周仍未全部阳转(表1)。各组抗-HCV平均A值为：pBLANK组为0.101±0.042，pC组为0.358±0.096，pCE1E2组为0.415±0.127。第一次免疫后8周达高峰(图5)。
表1 ELISA法检测抗-HCV阳性鼠数
Table1 Number of antiboddy-positive mice by ELISA Antibody
Plasmid
pBLANK
(n=10)
pC
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(n=10)
pCE1E2
(n=10)
Anti-HCV
O(0)*
8(4)
8(6)
*The antibody responses were detectable after the first or third or third boos t. Values in parentheses indicate the number of mice seroconverted by the first boost.
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图5 第八周各组免疫鼠抗-HCV 水平
Fig.5 Antibody responses at eighth week in every group of mice immunized w ith HCV structural region expression plasmids
2.4 体外CTL检测
用定量乳酸脱氢酶(LDH)法测定CTL活力，各组CTL反应平均值：对照组为8.26%±4.44%，pC 组为18.65%±5.71%，pCE1E2为29.97%±11.11%，最适效、靶细胞比例为100∶1(见图6) 。
图6 HCV结构区抗原DNA实验鼠的CTL 反应
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Fig.6 CTL responses in mice immunized with the HCV structural protein expressio n plasmids
2.5 体内CTL活力检测
荷瘤实验对照组较实验组鼠肿瘤出现早(平均12±3d)，注射pC和pCE1E2组为17±5d ；对照组肿瘤生长速度快，死亡时肿瘤一般>20mm；对照组较实验组存活时间短，一般于 肿瘤发生后10d内死亡，而实验组一般于15～20d后死亡。
3 讨论
近年来研究发现，应用带有外源基因的重组质粒DNA肌注小鼠，可以诱导针对该表达抗原的体液和细胞免疫。
我们的研究结果证明，pC和pCE1E2DNA免疫后，均能产生对HCVC区的特异性抗体，平均光密度(A值)分别为0.358±0.096和0.415±0.127，两组比较无显著差异(P>0.05)，提示联合E1E2的DNA免疫不能增强HCVC区诱导体液免疫反应的能力。但是对于pCE1E2免疫后是否可产生抗E1和抗E2，由于实验条件所限未予检测。同类研究报道，pCE1E2免疫后，可分别产生针对C、E1和E2的抗体，抗-E1和抗-E2的滴度分别较单纯pE1、pE2免疫的滴度为低，前者最高值(A值)为0.15和0.28，而后者可达0.48和0.38[6]。
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若要探讨DNA免疫所诱导的抗体有否中和作用，则需要建立起HCV的体外复制表达系统和简单、敏感的检测方法，目前尚无法做到。更进一步的研究则要证实DNA免疫产生的抗体能否在体外阻止HCV与细胞的结合，及对感染动物模型的保护作用。
对于疫苗免疫策略而言，若要对突变后的毒株产生保护性免疫，既需要诱导出交叉免疫的中和抗体，也要有识别突变株CTL反应。目前，DNA免疫诱导的CTL反应在一些病毒感染模型中介导出保护性免疫，可保护致死量的病毒对感染模型的攻击[7]。
既然HCV感染者体内存在的抗-HCV不对宿主产生免疫保护，由突变株而诱导的抗体亦无保护作用，那么细胞免疫能否在抵御感染和病毒清除中起作用
在我们的实验中，pC和pCE1E2均可诱导BALB/C鼠产生针对HCVC区的CTL反应，因为BALB/C鼠属H-2dⅠ类，靶细胞P815上仅表达MHCⅠ类分子，而不表达MHCⅡ类分子，所以上述结果提示HCVC区可能存在着受BALB/C鼠MHCⅠ类分子限制的CTL抗原表位。同时我们的实验结果提示pCE1E2免疫组小鼠的CTL反应(平均值29.97%±11.11%)较pC组(18.65%±5.71%)为高。但是我们无法得知E区是否也有可供BALB/C鼠识别的抗原表位，因为我们没有单独表达E区蛋白的靶细胞。而且在我们的实验中，针对C抗原的CTL反应较低是否由于检测方法不够敏感，或是通过肌注技术导入的DNA在抗原提呈，在免疫效率上较弱等所致，尚需进一步探讨。如若对于DNA免疫所诱导出的CTL反应有否保护性进行探讨，则需建立有效的动物模型进行验证，这在目前尚未具备条件。
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我们通过荷瘤的方法试图对体内CTL活力进行检测，结果对照组小鼠存活时间明显短于实验组，且肿瘤出现早，生长快。提示HCVDNA免疫可有效诱导体内CTL反应。
在我们的实验中，不是每只实验鼠都可产生抗体和CTL反应，但是我们无法确定这种反应的不一致性是由于近交系鼠属遗传上的免疫弱反应性还是我们技术上的不够完善。而且，若要研制广泛适用的DNA疫苗，则MHC的限制性亦将是难以愈越的障碍。所以提高免疫效率和增进免疫反应的一致性是目前急需解决的问题之一。
目前已经有了一些提高DNA免疫效率的方法，如设计嵌合基因免疫原，将多个T、B细胞表位组合在一起[8]，或增加表达肽段在胞内降解[9]，或与其它免疫佐剂联合应用[10]等。但根本的办法应对DNA免疫进行更为系统的研究，如对使用的载体进行改进，对抗原提呈的机理作进一步探讨，对DNA免疫的途径和所用动物的品种进行改进等。我们今后将在增强DNA免疫效率及改变免疫反应类型上进行探讨。
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综上所述，我们的结论是：利用HCV结构区基因重组体免疫BALB/C小鼠，可以诱导出特异性的体液和细胞免疫反应，但其CTL反应较弱，而且DNA免疫结果呈非一致性，原因尚待进一步探讨。
总之，DNA免疫从技术上为HCV疫苗的研制提供了快速、便捷的方法，应用前景广阔，同时，对于预防和治疗高突变率、易成持续慢性化的病毒性感染而言，DNA免疫应是最有前途、最有潜力的方法之一。
致谢 感谢姚航平先生、陈洪先生、陈勇博士、窦骏博士为本实验提供技术帮助。■
基金项目：本文为国家和省自然科学基金资助项目 39670665，396461
作者简介：单梅梅，女，哈尔滨人，36岁，博士，主治医师，主要从事病毒性肝炎防治研究。
参考文献：
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[5] 窦骏，刘克洲，陈智等.HCV结构区重组质粒建蛋白表达及小鼠对重组质粒抗体反应 [J].中华实验临床免疫学杂志，1998，10(3)：150～155
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收稿日期：1998-11-09
修稿日期：1999-05-06, http://www.100md.com