不同浓度的尼可地尔对心肌细胞膜KATP通道的影响
作者：冯力 刘伊丽 刘杰 邓英姿 袁勇 马立勤 赖文岩
单位：冯力(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)；刘伊丽(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)；刘杰(第一军医大学病理生理教研室，广东 广州 510515)；邓英姿(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)；袁勇(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)；马立勤(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)
关键词：尼可地尔；心肌细胞；KATP通道
第一军医大学学报000111 摘要：本实验在急性分离的豚鼠心肌细胞上，用膜片钳技术单通道记录的内面向外记录模式研究了不同浓度的尼可地尔对细胞膜KATP通道的影响。结果证实：0.1 mM的该药物不能激活KATP通道，而1 mM 的药物可明显激活细胞膜KATP通道。其电导为92.7 pS，通道的开放时间常数τO2 和开放概率较对照组(加入0 .5 mM ATP)明显增加，并可诱发通道出现二级开放。表明尼可地尔对心肌细胞膜KATP通道呈剂量依赖性激活。
, 百拇医药
中图分类号：Q493 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)01-0032-04
The effect of different dose of KATP channel opener on the cardiac plasma membrane KATP channel nicorandil
FENG Li LIU Yi-li DENG Ying-zi YUAN Yong MA Li-qin LAI Wen-yan
(Department of cardiology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
LIU Jie
, 百拇医药
(Department of pathophysiology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective To study the effect on cardiac plasma membrane (CPM) KATP channel of isolated ventricular myocytes of different dose of KATP channel opener, nicorandil (NIC). Method Single channel patch clamp technique was used. Result It was showed that CPM KATP channel current could not be activated by 0.1 mM NIC, but which could be remarkably induced by 1mM NIC, and the conductance of KATP channel current activated by NIC was 92.7 pS. The slow time constant of the open time (τO2 ) and the open state probability ( Po) were increased compared with control group, and the secondary opening of KATP channel was induced by NIC. Conclusion NIC can affect CPM in a dose-dependent manner.
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Key words: nicorandi; ventricular myocytes; KATP channel
尼可地尔是一种同时具备KATP 通道开放剂和硝酸盐两种属性的物质。尼可地尔作为血管扩张剂，已在临床上广泛应用于心绞痛、高血压等疾病的治疗[1]，但其作为KATP 通道开放剂的研究尚少。最近发现尼可地尔在动物体内可以明显减少心肌梗塞的范围，此作用与KATP 通道激活密切相关[2]。故本实验利用膜片钳技术进一步研究不同浓度的尼可地尔对心肌细胞膜上KATP 通道的作用，明确尼可地尔保护缺血心肌的机制，为该药的临床应用增加新的内容。
1 材料和方法
1.1 实验试剂
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链酶蛋白酶E(Sigma)，尼可地尔(Tocris)，优降糖(Sigma)。优降糖用二甲亚枫(DMSO, Sigma)配成浓度为0.2 mM的母液，实验前用HPSS液稀释，溶液中DMSO的最终浓度小于0.01%，此浓度的DMSO对KATP通道没有影响[3]。
1.2 实验用液体配制
无钙台氏液(mmol/L)：NaCl 116.0，KCl 5.4，NaH2PO4 1.4，NaHCO3 15.0，MgSO4 1.0，Glucose 15.0，pH 7.3～7.4。台氏液(mmol/L)：NaCl 150.0，K Cl 5.4，MgCl2 2.0，Glucose 10.0，HEPES 5.0，CaCl2 1.8，pH 7.3～7.4。浴槽液(mmol/L)：KCl 120.0，KOH 20.0，EGTA 5.0，Mg Cl2 1.0，TTX 0.001，HEPES 10.0，pH 7.3。电极液(mmol/L)：KCl 140.0，MgCl2 1.0，CaCl2 2.0，CdCl2 0.3，TTX 0.001，HEPES 10.0，pH 7.3。
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1.3 心室肌细胞的急性分离
健康豚鼠250～350 g，雌雄不拘，猛击其枕部致昏，迅速打开胸腔，取出心脏，置于4℃无钙台氏液中冲洗，剪开心包，主动脉插管后固定于Langendoff 灌流架上，用无钙台氏液经主动脉逆行灌注离体心脏6～8 min，将冠状动静脉中的血液冲净，后改用含链酶蛋白酶E 0.1 g/L，CaCl2 150 μmol/L的无钙台氏液灌流2～3 min，可见心脏膨大30～50%，心肌呈粉红色半透明；立即切下心室肌，剪开心室腔并将心室肌切碎，在上述酶液中温孵3～5 min，同时搅拌酶液。用细尼龙网过滤，去掉心室肌碎块，将上清液稀释5倍至含钙1.8 mmol/L的无钙台氏液(保育液)中，室温下保存，待用。
1.4 单离子通道记录
本实验采用膜片钳技术的内面向外式记录模式。记录用玻璃微电极的尖端直径约为0.5～1.5 μm，充灌液体后电阻约为8～16 MΩ。内插乏极化氯化银电极与膜片钳放大器探头相连。单通道电流经膜片钳放大器放大，放大器探头反馈电阻为10 GΩ。低通滤波频率为3 kHz，经Digidata转换，在Fetchex下采样。
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1.5 资料分析
用pCLAMP分析程序Fetchan进行开关事件的测量，设定通道的开、关事件的时间分辨率为200 μs，测量幅度的时间分辨率为500μs，本文时间资料分析只选用单级开放的资料。将测量结果用pSTAT程序进行统计分析，如幅度分布直方图和高斯拟合，事件开放及关闭的时间由呈指数下降的概率密度函数(pdf)的和来拟合，通道活动时间分布直方图用最小平方法(The least squares method)进行拟合，拟合指数成分的数目由似然率测验(Likelihood ratio test)决定。
2 结果
2.1 分离心肌细胞的形态学
用上述方法分离的细胞，在光学显微镜下有30%～40%呈条柱状，细胞边界清楚，横纹排列清楚，胎盘蓝染色为活细胞(图1)。在实验中我们采用这些条柱状细胞进行细胞膜的离子通道研究，发现封接较容易，封接成功率为84%。
图1 急性分离的心肌细胞形态
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Fig.1 Acutely isolated cardiac myocyte 2.2 0.1 mmol的尼可地尔对通道的作用
用内面向外式记录时，因浴槽液即相当于细胞内液，故当浴槽液不含有ATP时，KATP通道一般均处于开放状态。在封接成功的40例细胞中，有25例具有 KATP通道电流特性，通道开放概率为0.91。向浴槽液中加入0.5 mmol的ATP，通道开放受到抑制，开放概率明显下降为0.28。在浴槽液中加入0.1 mmol的尼可地尔，观察10 min，发现通道开放没有增加，反而随着时间的延长而显著减少(开放概率 0.03)。这说明0.1 mmol的尼可地尔不能激活 KATP通道。在细胞内ATP浓度较低的情况下，KATP通道随着时间延长而通道开放减少的过程为run -down。
2.3 1 mmol的尼可地尔对通道的作用
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2.3.1 单通道电流幅度 与上述步骤相同，在记录到有KATP通道电流时，用0.5 mmol的ATP抑制通道的开放，在浴槽液中加入1 mmol尼可地尔，1～3 min后，观察到通道开放明显增加，而加入3 μM的优降糖可完全抑制通道的活性(图2)。在相同的钳制电压下，1 mmol尼可地尔诱导的单通道电流幅度与正常对照组(加有0.5 mmol的ATP)诱导的通道电流幅度相比，均无显著性差异(P>0.05，表1)，表明尼可地尔对电流幅度没有影响。
表1 电流辐度(pA)的比较
Tab.1 The comparison of current amplitude Voltage(mV)
Control
Nicorandil
-20
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2.19±0.23
2.20±0.24
-40
3.75±0.37
3.77±0.43
-60
5.97±0.40
6.22±0.38
图2 1 mmol尼可地尔对KATP 通道的激活作用
Fig.2 Effects of nicorandil on activation of KATP channel
, 百拇医药
2.3.2 单通道电导 以钳制膜片电位(V)水平为横坐标，相应通道外向电流幅值(A)为纵坐标，可见钳制电位在-60～0 V范围内，各点排列基本成线性，位于一倾斜的直线上，此即电流-电压关系曲线(I-V C)，直线说明通道无整流，电导值为该曲线斜率。该通道的电导值为 92.7 pS，I-V曲线与X轴相交处的电压值为翻转电位，本组通道的翻转电位为22 V，与K的平衡电位0 V极为接近，证明记录到的通道电流为钾离子通道电流(图3)。从I-V曲线可以看出，尼可地尔没有明显改变正常对照组(电导为90.12 pS) 通道的电导,因此1 mmol尼可地尔对通道电导没有影响。
图3 KATP通道电流-电压曲线(I-V曲线)
Fig. 3 Current-voltage relation curve
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2.3.3 通道的动力学变化 尼可地尔诱导的通道开放以Burst 和Cluster开放为主, 通道开放时程直方图符合双指数拟合(图9 )。与对照组相比开放时间常数τ01之间没有显著性差异(P>0.05)，而τ02较正常对照组明显延长(P<0.01，表2)。在不同钳制电压下尼可地尔诱导的通道开放概率与对照组相比有显著差异(P<0.01)，(表2 )
表2 通道动力学变化
Tab. 2 The change of the kinetics of KATP channels (n=8)
-20 mV
-40 mV
-60 mV
, 百拇医药
Control
Nic
Control
Nic
Control
Nic
t o1 (ms)
1.21±0.21
1.52±0.21
1.14±0.22
1.43±0.29
1.17±0.15
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1.28±0.25
t o2 (ms)
6.74±1.14
44.29±4.71*
10.01±0.98
53.67±5.74*
19.99±1.49
71.14±6.58*
Tom
1.79±0.28
4.18±0.30*
2.92±0.28
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5.09±0.47*
3.91±0.33
6.16±0.78*
Po(%)
19.73±1.68
41.61±3.99*
30.80±3.49
48.76±2.45*
31.95±3.05
51.64±3.96*
*P<0.01 vs control
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图4 KATP通道开放时间图
Fig.4 Distribution of open time of KATP channel
3 讨论
1995年12月Hearse[4]首次从 离子通道水平阐述心肌缺血的定义，认为心肌缺血就是指细胞膜上慢钙离子通道开始关闭，受ATP调节的KATP通道开始解除抑制，使钾大量外流，减少了钙内流及收缩,保全了ATP。这说明KATP通道在心肌缺血过程中起着重要的作用。特别是近年来膜片钳技术的应用，为在细胞水平进行离子通道的研究提供了广阔的天地。不同的KATP通道开放剂对不同组织的细胞膜上KATP通道存在着不同的敏感性。关于尼可地尔对离体心肌细胞膜的KATP通道的作用，一直存有争议[5，6]。我们用膜片钳技术观察了不同浓度的KATP通道开放剂尼可地尔对KATP通道的影响，发现低浓度的尼可地尔(0.1 mmol)对KATP通道没有激活作用，高浓度的尼可地尔(1 mM)可以使通道明显激活。根据以下四点可以说明我们实验中记录的是KATP通道，表明尼可地尔(1mM)可激活KATP通道，进而发挥其保护心肌的作用，即(1)本实验加入毫摩尔浓度的ATP可使通道失活；(2)此通道I-V曲线与X轴交于静息膜电位(0 mV)附近，其翻转电位与钾离子平衡电位(EK)很接近，表明此通道对钾离子有选择性通透；(3)电极液和浴槽液内含CdCl2 和TTX阻断了 Ca2+ 通道和Na+通道；(4)通道电导为92.7 pS。
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本实验为便于观察药物作用，采用内膜向外式记录，因心肌细胞表面KATP通道密度较高,用内膜向外式记录时浴槽液即相当于细胞内液，而此液中没有ATP，故此方式记录时通道处于高度开放状态，我们用0.5 mM ATP使通道的开放概率降到了0.19(钳制电压 20 mV)，加入1 mM的尼可地尔可使开放概率增至0.41(钳制电压 20 mV)，通道开放时间常数τ01没有变化，τ02显著延长，通道平均开放时间也增加。但通道的电导92.7 pS，与用0.5 m MATP时相比没有显著性差异，但与以往报道的该通道的电导(80 pS)稍有不同[7]，考虑是用不同的膜片钳放大器系统所致。尼可地尔对通道电流幅度没有影响。说明此开放剂是通过增加开放时间常数τ02值，使Burst开放间期增加，从而使通道开放概率增加，尼可地尔激活的通道可以被优降糖所阻断，进一步说明此通道是KATP通道。
1 mM的尼可地尔可以明显激活心肌细胞膜上的KATP通道，其使通道活化的机制目前还不十分清楚，可能的调节机制是：KATP通道由两种蛋白组成：一种为磺酰脲类化合物受体(SUR)；另一种为内向整流性钾通道蛋白(K)[8，9]。KATP通道开放剂与SUR蛋白上相应位点结合后，可促使通道开放；而通道阻滞剂与SUR上其相应位点结合后，可阻断通道的开放[10]。值得注意的是由于目前KATP通道开放剂在针对组织特异性方面尚存有不足，因此在临床方面的应用受到限制，所以发展特异性强的KATP通道开放剂，成为目前研究的焦点。而本研究证实尼可地尔可激活心肌细胞膜KATP通道，为将其作为KATP通道开放剂用于临床提供了实验依据。
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作者单位：赖文岩(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)
参考文献
[1]Mizumura T, Nithipatikom K, Gross GJ. Effects of nicorandil and glyceryl trinitrate on infarct size, adenosine release, and neutrophil infiltration in the dog[J]. Cardiovasc Res, 1995, 29:48～9.
[2]Tsuneo M, Kasem N, Garrett J. Gross:infarct size-reducing effect of nicorandil is mediated by the KATP channel but not by its nitrate-like properties in dogs[J]. Cardiovasc Res, 1996, 32:274～85.
, 百拇医药
[3]Nakayama K, Fan Z, Marumo F et al. Interrelation between pinacidil and intracellular ATP concentrations on activation of the ATP-sensitive K+ current in guinea pig ventricular myocytes[J]. Circ Res, 1990, 67:1124～33.
[4]Hearse DJ. Myocardial ischemia: Can we agree on a definition for the 21st century[J]. Cardiovasc Res, 1994, 28:1737～44.
[5]Galie N, Traini AM, Ussia GP et al. Limitation of myocardial infarct size by nicorandil in open chest pigs[J]. J Mol Cell Cardiol, 1993, 25(Suppl 1):S53～5.
, 百拇医药
[6]Critz SD, Liu GS, Chujo M et al. Pinacidil but not nicorandil opens ATP-sensitive K+ channels and protects against simulated ischemia in rabbit myocytes[J]. J Mol Cell Cradiol, 1997, 29:1123～30.
[7]Fan Z, Nakayama KM. Pinacidil activates the ATP sensitive K+c hannels in inside-out and cell-attached patch membranes of guinea-pig ventricular myocytes[J]. Pflügers Arch,1988,415:387～94.
[8]Gribble FM, Ashfield R, Ammala C et al. Properties of cloned ATP-sensitive K+ channels expressed in Xenopus oocytes[J]. J Physiol (Lond), 1997, 498: 87～98.
, 百拇医药
[9]Gribble FM, Tucker SJ, Ashcroft FM. The essential role of the walker a motisa of SUR1 in K-ATP channel activation by Mg-ADP and diazoxide[J]. EMBO J ,1997, 16:1145～52.
[10]Inagaki NT. Gonoi J.P. Clement IV et al. A family of sulfonylurea receptors determines the pharmacological properties of ATP-sensitive K+ channel[J]. Neuron, 1996, 16:101～7.
1999-01-20, 百拇医药
单位：冯力(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)；刘伊丽(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)；刘杰(第一军医大学病理生理教研室，广东 广州 510515)；邓英姿(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)；袁勇(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)；马立勤(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)
关键词：尼可地尔；心肌细胞；KATP通道
第一军医大学学报000111 摘要：本实验在急性分离的豚鼠心肌细胞上，用膜片钳技术单通道记录的内面向外记录模式研究了不同浓度的尼可地尔对细胞膜KATP通道的影响。结果证实：0.1 mM的该药物不能激活KATP通道，而1 mM 的药物可明显激活细胞膜KATP通道。其电导为92.7 pS，通道的开放时间常数τO2 和开放概率较对照组(加入0 .5 mM ATP)明显增加，并可诱发通道出现二级开放。表明尼可地尔对心肌细胞膜KATP通道呈剂量依赖性激活。
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中图分类号：Q493 文献标识码：A 文章编号：1000-2588(2000)01-0032-04
The effect of different dose of KATP channel opener on the cardiac plasma membrane KATP channel nicorandil
FENG Li LIU Yi-li DENG Ying-zi YUAN Yong MA Li-qin LAI Wen-yan
(Department of cardiology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)
LIU Jie
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(Department of pathophysiology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China)Abstract: Objective To study the effect on cardiac plasma membrane (CPM) KATP channel of isolated ventricular myocytes of different dose of KATP channel opener, nicorandil (NIC). Method Single channel patch clamp technique was used. Result It was showed that CPM KATP channel current could not be activated by 0.1 mM NIC, but which could be remarkably induced by 1mM NIC, and the conductance of KATP channel current activated by NIC was 92.7 pS. The slow time constant of the open time (τO2 ) and the open state probability ( Po) were increased compared with control group, and the secondary opening of KATP channel was induced by NIC. Conclusion NIC can affect CPM in a dose-dependent manner.
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Key words: nicorandi; ventricular myocytes; KATP channel
尼可地尔是一种同时具备KATP 通道开放剂和硝酸盐两种属性的物质。尼可地尔作为血管扩张剂，已在临床上广泛应用于心绞痛、高血压等疾病的治疗[1]，但其作为KATP 通道开放剂的研究尚少。最近发现尼可地尔在动物体内可以明显减少心肌梗塞的范围，此作用与KATP 通道激活密切相关[2]。故本实验利用膜片钳技术进一步研究不同浓度的尼可地尔对心肌细胞膜上KATP 通道的作用，明确尼可地尔保护缺血心肌的机制，为该药的临床应用增加新的内容。
1 材料和方法
1.1 实验试剂
, 百拇医药
链酶蛋白酶E(Sigma)，尼可地尔(Tocris)，优降糖(Sigma)。优降糖用二甲亚枫(DMSO, Sigma)配成浓度为0.2 mM的母液，实验前用HPSS液稀释，溶液中DMSO的最终浓度小于0.01%，此浓度的DMSO对KATP通道没有影响[3]。
1.2 实验用液体配制
无钙台氏液(mmol/L)：NaCl 116.0，KCl 5.4，NaH2PO4 1.4，NaHCO3 15.0，MgSO4 1.0，Glucose 15.0，pH 7.3～7.4。台氏液(mmol/L)：NaCl 150.0，K Cl 5.4，MgCl2 2.0，Glucose 10.0，HEPES 5.0，CaCl2 1.8，pH 7.3～7.4。浴槽液(mmol/L)：KCl 120.0，KOH 20.0，EGTA 5.0，Mg Cl2 1.0，TTX 0.001，HEPES 10.0，pH 7.3。电极液(mmol/L)：KCl 140.0，MgCl2 1.0，CaCl2 2.0，CdCl2 0.3，TTX 0.001，HEPES 10.0，pH 7.3。
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1.3 心室肌细胞的急性分离
健康豚鼠250～350 g，雌雄不拘，猛击其枕部致昏，迅速打开胸腔，取出心脏，置于4℃无钙台氏液中冲洗，剪开心包，主动脉插管后固定于Langendoff 灌流架上，用无钙台氏液经主动脉逆行灌注离体心脏6～8 min，将冠状动静脉中的血液冲净，后改用含链酶蛋白酶E 0.1 g/L，CaCl2 150 μmol/L的无钙台氏液灌流2～3 min，可见心脏膨大30～50%，心肌呈粉红色半透明；立即切下心室肌，剪开心室腔并将心室肌切碎，在上述酶液中温孵3～5 min，同时搅拌酶液。用细尼龙网过滤，去掉心室肌碎块，将上清液稀释5倍至含钙1.8 mmol/L的无钙台氏液(保育液)中，室温下保存，待用。
1.4 单离子通道记录
本实验采用膜片钳技术的内面向外式记录模式。记录用玻璃微电极的尖端直径约为0.5～1.5 μm，充灌液体后电阻约为8～16 MΩ。内插乏极化氯化银电极与膜片钳放大器探头相连。单通道电流经膜片钳放大器放大，放大器探头反馈电阻为10 GΩ。低通滤波频率为3 kHz，经Digidata转换，在Fetchex下采样。
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1.5 资料分析
用pCLAMP分析程序Fetchan进行开关事件的测量，设定通道的开、关事件的时间分辨率为200 μs，测量幅度的时间分辨率为500μs，本文时间资料分析只选用单级开放的资料。将测量结果用pSTAT程序进行统计分析，如幅度分布直方图和高斯拟合，事件开放及关闭的时间由呈指数下降的概率密度函数(pdf)的和来拟合，通道活动时间分布直方图用最小平方法(The least squares method)进行拟合，拟合指数成分的数目由似然率测验(Likelihood ratio test)决定。
2 结果
2.1 分离心肌细胞的形态学
用上述方法分离的细胞，在光学显微镜下有30%～40%呈条柱状，细胞边界清楚，横纹排列清楚，胎盘蓝染色为活细胞(图1)。在实验中我们采用这些条柱状细胞进行细胞膜的离子通道研究，发现封接较容易，封接成功率为84%。
图1 急性分离的心肌细胞形态, 百拇医药
Fig.1 Acutely isolated cardiac myocyte 2.2 0.1 mmol的尼可地尔对通道的作用
用内面向外式记录时，因浴槽液即相当于细胞内液，故当浴槽液不含有ATP时，KATP通道一般均处于开放状态。在封接成功的40例细胞中，有25例具有 KATP通道电流特性，通道开放概率为0.91。向浴槽液中加入0.5 mmol的ATP，通道开放受到抑制，开放概率明显下降为0.28。在浴槽液中加入0.1 mmol的尼可地尔，观察10 min，发现通道开放没有增加，反而随着时间的延长而显著减少(开放概率 0.03)。这说明0.1 mmol的尼可地尔不能激活 KATP通道。在细胞内ATP浓度较低的情况下，KATP通道随着时间延长而通道开放减少的过程为run -down。
2.3 1 mmol的尼可地尔对通道的作用
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2.3.1 单通道电流幅度 与上述步骤相同，在记录到有KATP通道电流时，用0.5 mmol的ATP抑制通道的开放，在浴槽液中加入1 mmol尼可地尔，1～3 min后，观察到通道开放明显增加，而加入3 μM的优降糖可完全抑制通道的活性(图2)。在相同的钳制电压下，1 mmol尼可地尔诱导的单通道电流幅度与正常对照组(加有0.5 mmol的ATP)诱导的通道电流幅度相比，均无显著性差异(P>0.05，表1)，表明尼可地尔对电流幅度没有影响。
表1 电流辐度(pA)的比较
Tab.1 The comparison of current amplitude Voltage(mV)
Control
Nicorandil
-20
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2.19±0.23
2.20±0.24
-40
3.75±0.37
3.77±0.43
-60
5.97±0.40
6.22±0.38
图2 1 mmol尼可地尔对KATP 通道的激活作用
Fig.2 Effects of nicorandil on activation of KATP channel
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2.3.2 单通道电导 以钳制膜片电位(V)水平为横坐标，相应通道外向电流幅值(A)为纵坐标，可见钳制电位在-60～0 V范围内，各点排列基本成线性，位于一倾斜的直线上，此即电流-电压关系曲线(I-V C)，直线说明通道无整流，电导值为该曲线斜率。该通道的电导值为 92.7 pS，I-V曲线与X轴相交处的电压值为翻转电位，本组通道的翻转电位为22 V，与K的平衡电位0 V极为接近，证明记录到的通道电流为钾离子通道电流(图3)。从I-V曲线可以看出，尼可地尔没有明显改变正常对照组(电导为90.12 pS) 通道的电导,因此1 mmol尼可地尔对通道电导没有影响。
图3 KATP通道电流-电压曲线(I-V曲线)
Fig. 3 Current-voltage relation curve
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2.3.3 通道的动力学变化 尼可地尔诱导的通道开放以Burst 和Cluster开放为主, 通道开放时程直方图符合双指数拟合(图9 )。与对照组相比开放时间常数τ01之间没有显著性差异(P>0.05)，而τ02较正常对照组明显延长(P<0.01，表2)。在不同钳制电压下尼可地尔诱导的通道开放概率与对照组相比有显著差异(P<0.01)，(表2 )
表2 通道动力学变化
Tab. 2 The change of the kinetics of KATP channels (n=8)
-20 mV
-40 mV
-60 mV
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Control
Nic
Control
Nic
Control
Nic
t o1 (ms)
1.21±0.21
1.52±0.21
1.14±0.22
1.43±0.29
1.17±0.15
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1.28±0.25
t o2 (ms)
6.74±1.14
44.29±4.71*
10.01±0.98
53.67±5.74*
19.99±1.49
71.14±6.58*
Tom
1.79±0.28
4.18±0.30*
2.92±0.28
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5.09±0.47*
3.91±0.33
6.16±0.78*
Po(%)
19.73±1.68
41.61±3.99*
30.80±3.49
48.76±2.45*
31.95±3.05
51.64±3.96*
*P<0.01 vs control
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图4 KATP通道开放时间图
Fig.4 Distribution of open time of KATP channel
3 讨论
1995年12月Hearse[4]首次从 离子通道水平阐述心肌缺血的定义，认为心肌缺血就是指细胞膜上慢钙离子通道开始关闭，受ATP调节的KATP通道开始解除抑制，使钾大量外流，减少了钙内流及收缩,保全了ATP。这说明KATP通道在心肌缺血过程中起着重要的作用。特别是近年来膜片钳技术的应用，为在细胞水平进行离子通道的研究提供了广阔的天地。不同的KATP通道开放剂对不同组织的细胞膜上KATP通道存在着不同的敏感性。关于尼可地尔对离体心肌细胞膜的KATP通道的作用，一直存有争议[5，6]。我们用膜片钳技术观察了不同浓度的KATP通道开放剂尼可地尔对KATP通道的影响，发现低浓度的尼可地尔(0.1 mmol)对KATP通道没有激活作用，高浓度的尼可地尔(1 mM)可以使通道明显激活。根据以下四点可以说明我们实验中记录的是KATP通道，表明尼可地尔(1mM)可激活KATP通道，进而发挥其保护心肌的作用，即(1)本实验加入毫摩尔浓度的ATP可使通道失活；(2)此通道I-V曲线与X轴交于静息膜电位(0 mV)附近，其翻转电位与钾离子平衡电位(EK)很接近，表明此通道对钾离子有选择性通透；(3)电极液和浴槽液内含CdCl2 和TTX阻断了 Ca2+ 通道和Na+通道；(4)通道电导为92.7 pS。
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本实验为便于观察药物作用，采用内膜向外式记录，因心肌细胞表面KATP通道密度较高,用内膜向外式记录时浴槽液即相当于细胞内液，而此液中没有ATP，故此方式记录时通道处于高度开放状态，我们用0.5 mM ATP使通道的开放概率降到了0.19(钳制电压 20 mV)，加入1 mM的尼可地尔可使开放概率增至0.41(钳制电压 20 mV)，通道开放时间常数τ01没有变化，τ02显著延长，通道平均开放时间也增加。但通道的电导92.7 pS，与用0.5 m MATP时相比没有显著性差异，但与以往报道的该通道的电导(80 pS)稍有不同[7]，考虑是用不同的膜片钳放大器系统所致。尼可地尔对通道电流幅度没有影响。说明此开放剂是通过增加开放时间常数τ02值，使Burst开放间期增加，从而使通道开放概率增加，尼可地尔激活的通道可以被优降糖所阻断，进一步说明此通道是KATP通道。
1 mM的尼可地尔可以明显激活心肌细胞膜上的KATP通道，其使通道活化的机制目前还不十分清楚，可能的调节机制是：KATP通道由两种蛋白组成：一种为磺酰脲类化合物受体(SUR)；另一种为内向整流性钾通道蛋白(K)[8，9]。KATP通道开放剂与SUR蛋白上相应位点结合后，可促使通道开放；而通道阻滞剂与SUR上其相应位点结合后，可阻断通道的开放[10]。值得注意的是由于目前KATP通道开放剂在针对组织特异性方面尚存有不足，因此在临床方面的应用受到限制，所以发展特异性强的KATP通道开放剂，成为目前研究的焦点。而本研究证实尼可地尔可激活心肌细胞膜KATP通道，为将其作为KATP通道开放剂用于临床提供了实验依据。
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作者单位：赖文岩(第一军医大学南方医院心内科，广东 广州 510515)
参考文献
[1]Mizumura T, Nithipatikom K, Gross GJ. Effects of nicorandil and glyceryl trinitrate on infarct size, adenosine release, and neutrophil infiltration in the dog[J]. Cardiovasc Res, 1995, 29:48～9.
[2]Tsuneo M, Kasem N, Garrett J. Gross:infarct size-reducing effect of nicorandil is mediated by the KATP channel but not by its nitrate-like properties in dogs[J]. Cardiovasc Res, 1996, 32:274～85.
, 百拇医药
[3]Nakayama K, Fan Z, Marumo F et al. Interrelation between pinacidil and intracellular ATP concentrations on activation of the ATP-sensitive K+ current in guinea pig ventricular myocytes[J]. Circ Res, 1990, 67:1124～33.
[4]Hearse DJ. Myocardial ischemia: Can we agree on a definition for the 21st century[J]. Cardiovasc Res, 1994, 28:1737～44.
[5]Galie N, Traini AM, Ussia GP et al. Limitation of myocardial infarct size by nicorandil in open chest pigs[J]. J Mol Cell Cardiol, 1993, 25(Suppl 1):S53～5.
, 百拇医药
[6]Critz SD, Liu GS, Chujo M et al. Pinacidil but not nicorandil opens ATP-sensitive K+ channels and protects against simulated ischemia in rabbit myocytes[J]. J Mol Cell Cradiol, 1997, 29:1123～30.
[7]Fan Z, Nakayama KM. Pinacidil activates the ATP sensitive K+c hannels in inside-out and cell-attached patch membranes of guinea-pig ventricular myocytes[J]. Pflügers Arch,1988,415:387～94.
[8]Gribble FM, Ashfield R, Ammala C et al. Properties of cloned ATP-sensitive K+ channels expressed in Xenopus oocytes[J]. J Physiol (Lond), 1997, 498: 87～98.
, 百拇医药
[9]Gribble FM, Tucker SJ, Ashcroft FM. The essential role of the walker a motisa of SUR1 in K-ATP channel activation by Mg-ADP and diazoxide[J]. EMBO J ,1997, 16:1145～52.
[10]Inagaki NT. Gonoi J.P. Clement IV et al. A family of sulfonylurea receptors determines the pharmacological properties of ATP-sensitive K+ channel[J]. Neuron, 1996, 16:101～7.
1999-01-20, 百拇医药