鼻咽癌细胞中MDM2基因扩增与表达的研究
作者：罗均利 肖健云 田勇泉 赵素萍 刘季威 王行炜 陶正德
单位：罗均利(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；肖健云(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；田勇泉(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；赵素萍(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；刘季威(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；王行炜(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；陶正德(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)
关键词：鼻咽肿瘤；癌；MDM2基因*；多聚酶链反应
湖南医科大学学报000106 摘 要：应用斑点杂交和半定量逆转录-多聚酶链反应技术 对32例鼻咽癌(NPC)标本、10例慢性鼻咽炎症粘膜(CINE)标本、NPC细胞株HONE1进行MDM2基因扩增与表达的检测。结果显示：1例NPC有MDM2基因的扩增，NPC细胞株HONE1和10例NPC有MDM2 mRNA高表达，CINE无MDM2基因的扩增及mRNA的高表达。MDM2基因的高表达与NPC颈淋巴结转移有关(P<0.05)，而与NPC的T分期无关。提示MDM2基因在NPC中的主要活化方式是高表达而不是扩增，MDM2基因的高表达可能在NPC的发生和转移过程中起着重要作用。
, http://www.100md.com
分类号：R739.63R730.231 文献标识码：A
文章编号：1000-5625(2000)01-0018-03
MDM2 gene amplification and overexpression in nasopharyngeal carcinoma
LUO Jun-li, XIAO Jian-yun, TIAN Yong-quan
(Department of Otolaryngology, Xiangya Hospital, Hunan Medical University Changsha 410008)
Abstract：MDM2 gene amplification and overexpression were det ected by DNA dot blot analysis and reverse transcription-polymerase chai n react ion(RT-PCR) in 32 cases of nasopharyngeal carcinoma(NPC), 10 cases of chro nic i nflammation of nasopharyngeal epithelium(CINE) and NPC cell line HONE1. One case of NPC showed MDM2 gene amplification, NPC cell line HONE1 and ten cases of NPC showed MDM2 mRNA overexpression. No MDM2 gene amplification and overexpression were found in CINE. MDM2 mRNA overexpression was significantly related to cervic al lymph node metastasis, but not to T stage of NPC. The results indicate that M DM2 gene may play an important role in the pathogenesis and the process of meta stasis of NPC.
, 百拇医药
Key words：nasopharyngeal neoplasm;carcinoma;MDM2 gene; ploymerase chain reaction▲
小鼠双微粒体基因(murine double minute 2, MDM 2)是一个成瘤性很强的癌基因，其蛋白产物能与p53蛋白、Rb蛋白、核糖体L5蛋白和转录因 子E2F1结合并相互作用而发挥一系列病理生理作用[1]。本文运用斑点杂交、半定 量逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术对鼻咽癌细胞进行MDM2基因扩增和表达的检测，旨 在明确MDM2基因在鼻咽癌(NPC)细胞中的扩增、表达及其意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 32例NPC，10例慢性鼻咽炎症粘膜(CINE)活检组织取自本 科门诊。HONE1细胞株由本校肿瘤所提供。MDM2 cDNA探针购自北京医科大学病理系，探针 长931bp；β-actin探针购自北京中山公司，探针长为590bp。同位素[α-3 2P]-dCTP购自北京福瑞公司。MDM2，β-actin引物由北京仪诚公司合成。MDM2序列为 ：5′-TTATTAAAGTCTGTTGGTGCA-3′，5′-TGAAGGTTTCTCTTCCTGAAG-3′；β-actin序 列为：5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′。详细收集 各病例的临床资料，NPC临床分期按92年福州会议推荐分期法进行。
, 百拇医药
1.2 MDM2 mRNA的RT-PCR半定量检测 用Trizol试剂盒抽提RNA。 按作者已 建立的半定量RT-PCR方法对NPC，CINE中MDM2 mRNA的表达进行半定量检测[2]。 参照Bueso-Ramos的评判标准[3]，选定MDM2与β-actin比值大于16%者为MDM2 m RNA高表达。
1.3 MDM2扩增的斑点杂交检测 用酚、氯仿、乙醇抽提并纯化DNA，利用多 孔过滤加样器将10μg变性的DNA点样于尼龙膜上。杂交炉内68℃预杂交2h，与[α- 32P]-dCTP标记的MDM2或β-actin探针杂交24h。-70℃放射自显影1周。密度 扫描仪进行面积密度扫描，以每个杂交信号扫描的峰面积反映DNA含量，再根据MDM2/β-ac tin的比值(比值>1.2为MDM2基因扩增)判断有无MDM2基因的扩增。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 斑点杂交 32例NPC组织中仅有1例有MDM2基因扩增，扩增倍数为11。1 0例CINE，NPC细胞株HONE1均无MDM2基因的扩增(图1)。
图1 MDM2点杂交 a/d 为慢性鼻咽炎症粘膜组织，b/e，c/f为鼻咽癌，标本c3有MDM2基因扩增，扩增倍数为11。
Fig. 1 DNA Dot Blot analysis. One ca se of NPC showing MDM2 gene amplification with copies being eleven (c3). a/d: CINE; b/e,c/f:NPC.
2.2 RT-PCR检测 32例NPC中有10例为MDM2 mRNA高表达，其中包括有M DF M2基因扩增的1例NPC组织。6例CINE虽也表现为MDM2 mRNA RT-PCR阳性，但MDM2/β -actin比值均未超过10%(图2)。
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图2 MDM2 mRNA RT-PCR半定量分析 1：分子 量标准；2～6：HONE1；3：只加MDM2引物；4：只加β-actin引物；5，6：直接以DNA行PCR ；7～10：鼻咽癌；11，12：慢性鼻咽炎症粘膜
Fig. 2 MDM2 mRNA expression detected by RT-PCR. 1: Marker;2～6:HONE1;3:only MDM2 primers used; 4:only β-actin primers used; 5,6:PCR using DNA as template; 7～10:NPC; 11,12: CINE
2.3 MDM2基因高表达与NPC临床TNM分期的关系 MDM2基因的高表达与NPC 的临床T分期无关，而与NPC有无淋巴结转移有关(P<0.05)(附表)。
附表 MDM2 mRNA的表达水平与鼻咽癌颈淋巴结转移及TNM分期 的关系①
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例数
mRNA高表达
有
无
鼻咽癌原发灶
T1-2
18
6
12
T3-4
14
4②
10②
, 百拇医药
颈部淋巴结转移②
N0
15
2
13
N1-3
17
8③
9③
①T表示TNM分期，N0表示无淋巴结转移，N1-3表示有淋巴结转移；②与T 1-2比较P>0.05；③与N0比较P<0.05
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3 讨 论
MDM2基因在细胞中的高度扩增和/或高表达可使细胞发生转化，因而具有成瘤性。在人类肿 瘤中，约1/3的肉瘤有MDM2基因的扩增，扩增的肿瘤组织中有MDM2 mRNA和蛋白的高表达 [1]。在白血病、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤中，虽很少有MDM2基因的扩增， 但MDM2基因的高表达则较为常见[3，4]。与软组织肿瘤相比，上皮源性肿瘤组织 中MDM2基因的扩增和/或高表达相对少见。已发现乳腺癌、膀胱癌、肺腺癌中存在着一定程 度的MDM2基因扩增和/或高表达[5]。本研究发现只有3.1% NPC组织有MDM2基因的 扩增，而31.25% NPC组织有MDM2 mRNA的高表达。这类同于MDM2基因在白血病、淋巴瘤中的 扩增和表达情况。至于MDM2基因扩增与表达不一致的原因，目前尚不清楚，可能与其在转录 水平中存在着某种调节机制有关。
6例(60%)CINE表现为MDM2 mRNA RT-PCR阳性，但MDM2/β-actin比值均未超过10%。这一方 面说明在非癌变鼻咽上皮细胞中存在着一定水平的MDM2 mRNA，这种低水平的MDM2 mRNA可能 是细胞正常生命活动所必需；另一方面，这种表达水平远比MDM2 mRNA在NPC中的表达水平低 。提示MDM2基因的高表达可能在NPC的发生和/或发展过程中起着某种作用。
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随着研究的深入，有作者发现肉瘤中MDM2基因的扩增和高表达与肿瘤的复发、转移及病人的 预后相关[1]；白血病中MDM2基因的高表达与异常染色体的出现、对化疗的敏感性 及病人的预后有关[3，4]。本研究发现，NPC组织中MDM2基因的高表达与NPC有无 颈淋巴结转移有关，而与T分期无关。说明MDM2基因表达水平的上调可能在NPC的转移过程中 起着某种作用。有关MDM2基因高表达与NPC病人预后的关系，笔者在随访中。
作者简介：罗均利(1969-)，男，主治医师
参考文献：
[1]McCann AH, Kirlcy A, Carncy DN, et al. Amplification of the MDM2 gene in human brest cancer and its association with MDM2 and p53 status[J]. Br J Cancer, 1995,71:981-985.
, 百拇医药
[2]罗均利，肖健云，田勇泉，等.鼻咽癌细胞中MDM2表达的逆转录多聚酶链反应半定 量方法的建立[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，1998，4：60-61.
[3]Bueso-Ramos CE, Yang Y, Deleon E, et al. The human MDM2 oncogene is overexpressed in leukemias[J]. Blood, 1993,82:2617-2623.
[4]Ladannyi M, Cha C, Lewis R, et al. MDM2 gene amplification in metastatic osteosarcoma[J]. Cancer Res, 1993,53:16-18.
[5]Gunther T, Schneider-Stock R, Rys J, et al. p53 gene mutations and expression of p53 and MDM2 proteins in invasive breast carcinoma: A comparative a nalysis with clinico-pathological factors[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 1997,1 23:388-394.
收稿日期：1997-11-23, 百拇医药
单位：罗均利(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；肖健云(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；田勇泉(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；赵素萍(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；刘季威(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；王行炜(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)；陶正德(附属湘雅医院耳鼻咽喉科 长沙 410008)
关键词：鼻咽肿瘤；癌；MDM2基因*；多聚酶链反应
湖南医科大学学报000106 摘 要：应用斑点杂交和半定量逆转录-多聚酶链反应技术 对32例鼻咽癌(NPC)标本、10例慢性鼻咽炎症粘膜(CINE)标本、NPC细胞株HONE1进行MDM2基因扩增与表达的检测。结果显示：1例NPC有MDM2基因的扩增，NPC细胞株HONE1和10例NPC有MDM2 mRNA高表达，CINE无MDM2基因的扩增及mRNA的高表达。MDM2基因的高表达与NPC颈淋巴结转移有关(P<0.05)，而与NPC的T分期无关。提示MDM2基因在NPC中的主要活化方式是高表达而不是扩增，MDM2基因的高表达可能在NPC的发生和转移过程中起着重要作用。
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分类号：R739.63R730.231 文献标识码：A
文章编号：1000-5625(2000)01-0018-03
MDM2 gene amplification and overexpression in nasopharyngeal carcinoma
LUO Jun-li, XIAO Jian-yun, TIAN Yong-quan
(Department of Otolaryngology, Xiangya Hospital, Hunan Medical University Changsha 410008)
Abstract：MDM2 gene amplification and overexpression were det ected by DNA dot blot analysis and reverse transcription-polymerase chai n react ion(RT-PCR) in 32 cases of nasopharyngeal carcinoma(NPC), 10 cases of chro nic i nflammation of nasopharyngeal epithelium(CINE) and NPC cell line HONE1. One case of NPC showed MDM2 gene amplification, NPC cell line HONE1 and ten cases of NPC showed MDM2 mRNA overexpression. No MDM2 gene amplification and overexpression were found in CINE. MDM2 mRNA overexpression was significantly related to cervic al lymph node metastasis, but not to T stage of NPC. The results indicate that M DM2 gene may play an important role in the pathogenesis and the process of meta stasis of NPC.
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Key words：nasopharyngeal neoplasm;carcinoma;MDM2 gene; ploymerase chain reaction▲
小鼠双微粒体基因(murine double minute 2, MDM 2)是一个成瘤性很强的癌基因，其蛋白产物能与p53蛋白、Rb蛋白、核糖体L5蛋白和转录因 子E2F1结合并相互作用而发挥一系列病理生理作用[1]。本文运用斑点杂交、半定 量逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)技术对鼻咽癌细胞进行MDM2基因扩增和表达的检测，旨 在明确MDM2基因在鼻咽癌(NPC)细胞中的扩增、表达及其意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 32例NPC，10例慢性鼻咽炎症粘膜(CINE)活检组织取自本 科门诊。HONE1细胞株由本校肿瘤所提供。MDM2 cDNA探针购自北京医科大学病理系，探针 长931bp；β-actin探针购自北京中山公司，探针长为590bp。同位素[α-3 2P]-dCTP购自北京福瑞公司。MDM2，β-actin引物由北京仪诚公司合成。MDM2序列为 ：5′-TTATTAAAGTCTGTTGGTGCA-3′，5′-TGAAGGTTTCTCTTCCTGAAG-3′；β-actin序 列为：5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′。详细收集 各病例的临床资料，NPC临床分期按92年福州会议推荐分期法进行。
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1.2 MDM2 mRNA的RT-PCR半定量检测 用Trizol试剂盒抽提RNA。 按作者已 建立的半定量RT-PCR方法对NPC，CINE中MDM2 mRNA的表达进行半定量检测[2]。 参照Bueso-Ramos的评判标准[3]，选定MDM2与β-actin比值大于16%者为MDM2 m RNA高表达。
1.3 MDM2扩增的斑点杂交检测 用酚、氯仿、乙醇抽提并纯化DNA，利用多 孔过滤加样器将10μg变性的DNA点样于尼龙膜上。杂交炉内68℃预杂交2h，与[α- 32P]-dCTP标记的MDM2或β-actin探针杂交24h。-70℃放射自显影1周。密度 扫描仪进行面积密度扫描，以每个杂交信号扫描的峰面积反映DNA含量，再根据MDM2/β-ac tin的比值(比值>1.2为MDM2基因扩增)判断有无MDM2基因的扩增。
2 结 果
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2.1 斑点杂交 32例NPC组织中仅有1例有MDM2基因扩增，扩增倍数为11。1 0例CINE，NPC细胞株HONE1均无MDM2基因的扩增(图1)。
图1 MDM2点杂交 a/d 为慢性鼻咽炎症粘膜组织，b/e，c/f为鼻咽癌，标本c3有MDM2基因扩增，扩增倍数为11。
Fig. 1 DNA Dot Blot analysis. One ca se of NPC showing MDM2 gene amplification with copies being eleven (c3). a/d: CINE; b/e,c/f:NPC.
2.2 RT-PCR检测 32例NPC中有10例为MDM2 mRNA高表达，其中包括有M DF M2基因扩增的1例NPC组织。6例CINE虽也表现为MDM2 mRNA RT-PCR阳性，但MDM2/β -actin比值均未超过10%(图2)。
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图2 MDM2 mRNA RT-PCR半定量分析 1：分子 量标准；2～6：HONE1；3：只加MDM2引物；4：只加β-actin引物；5，6：直接以DNA行PCR ；7～10：鼻咽癌；11，12：慢性鼻咽炎症粘膜
Fig. 2 MDM2 mRNA expression detected by RT-PCR. 1: Marker;2～6:HONE1;3:only MDM2 primers used; 4:only β-actin primers used; 5,6:PCR using DNA as template; 7～10:NPC; 11,12: CINE
2.3 MDM2基因高表达与NPC临床TNM分期的关系 MDM2基因的高表达与NPC 的临床T分期无关，而与NPC有无淋巴结转移有关(P<0.05)(附表)。
附表 MDM2 mRNA的表达水平与鼻咽癌颈淋巴结转移及TNM分期 的关系①
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例数
mRNA高表达
有
无
鼻咽癌原发灶
T1-2
18
6
12
T3-4
14
4②
10②
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颈部淋巴结转移②
N0
15
2
13
N1-3
17
8③
9③
①T表示TNM分期，N0表示无淋巴结转移，N1-3表示有淋巴结转移；②与T 1-2比较P>0.05；③与N0比较P<0.05
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MDM2基因在细胞中的高度扩增和/或高表达可使细胞发生转化，因而具有成瘤性。在人类肿 瘤中，约1/3的肉瘤有MDM2基因的扩增，扩增的肿瘤组织中有MDM2 mRNA和蛋白的高表达 [1]。在白血病、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤中，虽很少有MDM2基因的扩增， 但MDM2基因的高表达则较为常见[3，4]。与软组织肿瘤相比，上皮源性肿瘤组织 中MDM2基因的扩增和/或高表达相对少见。已发现乳腺癌、膀胱癌、肺腺癌中存在着一定程 度的MDM2基因扩增和/或高表达[5]。本研究发现只有3.1% NPC组织有MDM2基因的 扩增，而31.25% NPC组织有MDM2 mRNA的高表达。这类同于MDM2基因在白血病、淋巴瘤中的 扩增和表达情况。至于MDM2基因扩增与表达不一致的原因，目前尚不清楚，可能与其在转录 水平中存在着某种调节机制有关。
6例(60%)CINE表现为MDM2 mRNA RT-PCR阳性，但MDM2/β-actin比值均未超过10%。这一方 面说明在非癌变鼻咽上皮细胞中存在着一定水平的MDM2 mRNA，这种低水平的MDM2 mRNA可能 是细胞正常生命活动所必需；另一方面，这种表达水平远比MDM2 mRNA在NPC中的表达水平低 。提示MDM2基因的高表达可能在NPC的发生和/或发展过程中起着某种作用。
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随着研究的深入，有作者发现肉瘤中MDM2基因的扩增和高表达与肿瘤的复发、转移及病人的 预后相关[1]；白血病中MDM2基因的高表达与异常染色体的出现、对化疗的敏感性 及病人的预后有关[3，4]。本研究发现，NPC组织中MDM2基因的高表达与NPC有无 颈淋巴结转移有关，而与T分期无关。说明MDM2基因表达水平的上调可能在NPC的转移过程中 起着某种作用。有关MDM2基因高表达与NPC病人预后的关系，笔者在随访中。
作者简介：罗均利(1969-)，男，主治医师
参考文献：
[1]McCann AH, Kirlcy A, Carncy DN, et al. Amplification of the MDM2 gene in human brest cancer and its association with MDM2 and p53 status[J]. Br J Cancer, 1995,71:981-985.
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[2]罗均利，肖健云，田勇泉，等.鼻咽癌细胞中MDM2表达的逆转录多聚酶链反应半定 量方法的建立[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，1998，4：60-61.
[3]Bueso-Ramos CE, Yang Y, Deleon E, et al. The human MDM2 oncogene is overexpressed in leukemias[J]. Blood, 1993,82:2617-2623.
[4]Ladannyi M, Cha C, Lewis R, et al. MDM2 gene amplification in metastatic osteosarcoma[J]. Cancer Res, 1993,53:16-18.
[5]Gunther T, Schneider-Stock R, Rys J, et al. p53 gene mutations and expression of p53 and MDM2 proteins in invasive breast carcinoma: A comparative a nalysis with clinico-pathological factors[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 1997,1 23:388-394.
收稿日期：1997-11-23, 百拇医药