PCR-SSP在异基因造血干细胞移植供体选择中的应用
作者:涂正坤 廖灿 包蓉 吴雄文 龚非力
单位:涂正坤 廖灿 包蓉 广州市妇婴医院医学遗传研究所*;吴雄文 龚非力 同济医科大学免疫学教研室**
关键词:PCR-SSP造血干细胞移植;HLA;供体
临床血液学杂志990505摘要 目的:建立常规的PCR-SSP基因分型方法。方法:对16名患者及其家系HLA-DR进行血清学和PCR-SSP分型。结果:血清学分型7对供、受体相合,而PCR-SSP基因分型只有其中5对相合,另外2对1对为错判、1对为DR2两个亚型DR15、DR16间的错判。结论:PCR-SSP基因分型是一种快速、准确和可行的HLA分型方法,具有广阔的临床应用前景。
Role of PCR-SSP HLA-typing in the Donor Selection of Allogeneic Stem Cell
, 百拇医药
Tu Zhengkun,Liao Can,Bao Rong,et al
Maternal Neonatal Hospital of Guangzhou,510180
Abstract Objective:To build frequent method of HLA DNA typing by PCR-SSP.Methods:16 patients and their families were done for HLA-DR typing by serology and PCR-SSP respectively.Results:The serology HLA-typig showed that 7 pairs of donors and receipts were HLA-matched,however,PCR-SSP HLA-typing showed that 5 pairs of donors and receipts are HLA-matched,among other 2 pairs,one was wrong HLA-typing,one was wrong HLA-typing between DR15 and DR16 subtype of DR2 by serology.Conclusions:PCR-SSP is a rapid,precise and reliablc HLA-typing mothod,it have very wide prospect in clinical HLA-typing.
, 百拇医药
Key words PCR-SSP Stem cell transplanation HLA Donor
近20年来,异基因造血干细胞移植用于治疗再生障碍性贫血、白血病、恶性肿瘤及其他造血系统疾病得到很大的发展,其造血干细胞来源于不同组织,包括:骨髓、外周血、脐血以及胎肝等。HLA配型是提高异基因造血干细胞移植长期存活率,减少移植物抗宿主病(GVHD)发生的关键因素之一。其中HLA-DR位点在移植中的作用尤为重要。近年来我们主要采用血清学方法(HLA单克隆干板)进行HLA-DR分型。为了配合临床异基因造血干细胞移植,快速准确地为患者提供供体,我们建立了PCR-SSP(序列特异性引物)法。
1 材料和方法
1.1 病例 16名患者的诊断分别为β-珠蛋白生成障碍性贫血、慢性粒细胞性白血病、淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病。
, 百拇医药 1.2 方法 ①模板DNA的制备:取供、受者外周血2~3 ml,经2%EDTA抗凝,按常规快速提取基因组DNA法提取,提取后溶于100 μl TE溶液中。②PCR扩增:引物参照国外文献设计〔1〕,合成序列见表2,引物由德国Essen大学Grosso-Wildo教授合成。每个PCR反应体系为20 μl,其中包含60~100 ng模板DNA;1XPCR缓冲液(5 mmol/L KCl,0.15 mmol/L MgCl2,1 mmol/L Tris-HCI pH 8.3,0.001%明胶);200 μmol/L dNTP,1 U Taq酶;引物各2 pmol,应用Perkin Elmer 9700型扩增仪进行PCR反应,预变性94℃5 min后,循环参数为94℃1 min,65℃1 min,72℃1 min,共30个循环。③特异性扩增产物的检测:用1XTBE配制2%琼脂糖凝胶,电压10-15 V/CM、电泳20 min,电泳结束后EB染色,自动凝胶成象仪分析结果。④HLA-DR的血清学分型:采用美国莱姆德公司HLA-DR单克隆分型干板。
, 百拇医药
2 结果
16名患者及其家系共61名个体HLA-DR位点的血清学分型和基因分型结果见附表。从表中可以看出:血清学分型7对供、受体相合,而PCR-SSP基因分型只有其中5对相合,另外1对为错判,1对为DR2两个亚型DR15、DR16间的错判。
附表 16名患者及其家系共61人HLA-DR位点血清学和基因分型结果 编号
血清分型
基因分型
编号
血清分型
基因分型
970030
, 百拇医药 DR14 DR12
DRB1140X 120X
980038
DR8 DR7
DRB1080X 070X
F
DR12 DR4
DRB1120X 040X
F
DR9
DRB10901
M
, 百拇医药
DR15 DR14
DRB1150X 140X
M
DR9 DR12
DRB10901 120X
S
DR15 DR12
DRB1150X 120X
S
DR9 DR7
DRB10901 070X
970031
, http://www.100md.com
DR15 DR9
DRB1150X 0901
980039
DR15 DR9
DRB1150X 0901
F
DR16 DR9
DRB1160X 0901
F
DR15 DR12
DRB1150X
M
, 百拇医药
DR15 DR14
DRB1150X 1410
M
DR3 DR9
DRB10301 0901
S
DR14 DR16
DRB11410 160X
S
DR15 DR9
DRB1150X 0901
970032
, http://www.100md.com
DR8 DR3
DRB1080X 0301
980040#
DR16 DR8
DRB1160X 080X
F
DR15 DR3
DRB1150X 0301
F
DR16
DRB1150X 160X
M
, http://www.100md.com
DR8 DR15
DRB1080X 150X
M
DR8 DR16
DRB1080X 070X
S
DR15 DR8
DRB1150X 080X
S
DR16 DR8
DRB1150X 080X
970033
, http://www.100md.com
DR12 DR15
DRB1120X 150X
980041
DR7 DR8
DRB1070X 080X
F
DR15
DRB1150X
S
DR7 DR8
DRB1070X 080X
M
, 百拇医药
DR12 DR9
DRB1120X 0901
980042
DR9 DR7
DRB1090X 070X
S
DR15 DR12
DRB1150X 120X
F
DR3 DR7
DRB10301 070X
970034
, 百拇医药
DR4
DRB1040X
M
DR9
DRB1090X
F
DRB1040X 120X
S
DR9 DR3
DRB1090X 0301
M
DRB1040X 150X
, 百拇医药
980043#
DR10 DR1
DRB11001 0103
S
DR4
DRB1040X
S
DR4 DR12
DRB1040X 120X
970035
DR14 DR13
DRB1140X 130X
, 百拇医药
S
DR10 DR1
DRB11001 040X
F
DR14 DR15
DRB1140X 150X
S
DR1 DR12
DRB10103 120X
M
DR13 DR9
DRB1130X 0901
, 百拇医药
970044
DR16 DR7
DRB1160X 070X
S
DR15 DR9
DRB1150X 0901
F
DR16 DR9
DRB1160X 0901
970036
DR8 DR4
DRB1080X 040X
, 百拇医药
M
DR7 DR8
DRB1070X 080X
F
DR15 DR4
DRB1150X 040X
S
DR8 DR9
DRB1080X 0901
M
DR9 DR8
DRB10901 080X
, 百拇医药
970045
DR3 DR14
DRB10301 140X
S
DR4 DR9
DRB1040X 0901
F
DR3 DR15
DRB10301 150X
970037
DR16 DR12
DRB1160X 120X
, 百拇医药
F
DR12 DR7
DRB1120X 070X
M
DR16 DR7
DRB1160X 070X
S
DR16 DR7
DRB1160X 070X
S
DR16 DR12
DRB1160X 120X
, 百拇医药
F:Father M:Mother S:Sobbing
:血清学分型和基因分型供、受者HLA-DR相合
#:血清学分型相合,而基因分型不合。
3 讨论
在异基因造血干细胞移植中,HLA某些关键位点错配都将增加GVHD的发生率,从而导致移植失败。因此,对HLA基因位点的正确识别是移植成败的关键。目前国际仍普遍沿用血清学分型,是一种成熟而且具有广泛临床应用价值的HLA配型方法,但它有其明显的不足之处:①标本必须为活细胞。②血清学反应有时不强,结果难以判断,因此有较大的主观性。③血清学对Ⅱ类抗原指定的正确率低于Ⅰ类抗原。目前,多数HLA-Ⅱ类基因配型方法均是PCR扩增之后,再用其他方法进行检测。而PCR-SSP将PCR扩增和检测两个步骤合为一次完成,无需探针杂交和任何内切酶消化,使操作过程简便、快速,是目前HLA-DNA分型最常采用的技术〔2~4〕。本文对16名患者及其家属61人进行了HLA-DR血清学分型和基因分型,结果表明,血清学分型7名患者在家系中找到HLA-DR相合的供体,而PCR-SSP基因分型只有其中5对相合,另外2对1对为错判、1对DR2两个亚型DR15、DR16间的错判。两种分型方法符合率为90%,因此我们认为PCR-SSP基因分型是一种更为快速、准确的分型方法,具有广阔的应用前景。
, http://www.100md.com
*邮政编码:广州,5108180
**武汉,430030
参考文献
[1] Olerup O,Zetterguist H.HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers(PCR-SSP) in zhaours.Tissue Antigens,1992,39(5):225~35
[2] Bunce M,O′Ncil CM,Barnardo MC,et al.Photoyping:comprhensive DNA typing for HLA-A、B、C、DKB1、DRB3、DRB4、DRB5 and DQB1 by PCR with 144 primers mixes utilizing sequence-specific rpimers (PCR-SSP).Tissuc Antigens,1995,46(5):355~67
[3] Bune M,Welsh KI.Rapid DNA typing for HLA-C using sequence-specific primers (PCR-SSP).Tissue Antigens,1994,43:7~17
[4] Krausa P,Bodmer JG,Browning MJ,et al.Defining the common subtypes of HLA A9、A10、A28 and A1g by use of (APMS/PCR).Tissue Antigens,1993,43:91~9
1998-11-26 收稿 1999-02-13修回, 百拇医药
单位:涂正坤 廖灿 包蓉 广州市妇婴医院医学遗传研究所*;吴雄文 龚非力 同济医科大学免疫学教研室**
关键词:PCR-SSP造血干细胞移植;HLA;供体
临床血液学杂志990505摘要 目的:建立常规的PCR-SSP基因分型方法。方法:对16名患者及其家系HLA-DR进行血清学和PCR-SSP分型。结果:血清学分型7对供、受体相合,而PCR-SSP基因分型只有其中5对相合,另外2对1对为错判、1对为DR2两个亚型DR15、DR16间的错判。结论:PCR-SSP基因分型是一种快速、准确和可行的HLA分型方法,具有广阔的临床应用前景。
Role of PCR-SSP HLA-typing in the Donor Selection of Allogeneic Stem Cell
, 百拇医药
Tu Zhengkun,Liao Can,Bao Rong,et al
Maternal Neonatal Hospital of Guangzhou,510180
Abstract Objective:To build frequent method of HLA DNA typing by PCR-SSP.Methods:16 patients and their families were done for HLA-DR typing by serology and PCR-SSP respectively.Results:The serology HLA-typig showed that 7 pairs of donors and receipts were HLA-matched,however,PCR-SSP HLA-typing showed that 5 pairs of donors and receipts are HLA-matched,among other 2 pairs,one was wrong HLA-typing,one was wrong HLA-typing between DR15 and DR16 subtype of DR2 by serology.Conclusions:PCR-SSP is a rapid,precise and reliablc HLA-typing mothod,it have very wide prospect in clinical HLA-typing.
, 百拇医药
Key words PCR-SSP Stem cell transplanation HLA Donor
近20年来,异基因造血干细胞移植用于治疗再生障碍性贫血、白血病、恶性肿瘤及其他造血系统疾病得到很大的发展,其造血干细胞来源于不同组织,包括:骨髓、外周血、脐血以及胎肝等。HLA配型是提高异基因造血干细胞移植长期存活率,减少移植物抗宿主病(GVHD)发生的关键因素之一。其中HLA-DR位点在移植中的作用尤为重要。近年来我们主要采用血清学方法(HLA单克隆干板)进行HLA-DR分型。为了配合临床异基因造血干细胞移植,快速准确地为患者提供供体,我们建立了PCR-SSP(序列特异性引物)法。
1 材料和方法
1.1 病例 16名患者的诊断分别为β-珠蛋白生成障碍性贫血、慢性粒细胞性白血病、淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病。
, 百拇医药 1.2 方法 ①模板DNA的制备:取供、受者外周血2~3 ml,经2%EDTA抗凝,按常规快速提取基因组DNA法提取,提取后溶于100 μl TE溶液中。②PCR扩增:引物参照国外文献设计〔1〕,合成序列见表2,引物由德国Essen大学Grosso-Wildo教授合成。每个PCR反应体系为20 μl,其中包含60~100 ng模板DNA;1XPCR缓冲液(5 mmol/L KCl,0.15 mmol/L MgCl2,1 mmol/L Tris-HCI pH 8.3,0.001%明胶);200 μmol/L dNTP,1 U Taq酶;引物各2 pmol,应用Perkin Elmer 9700型扩增仪进行PCR反应,预变性94℃5 min后,循环参数为94℃1 min,65℃1 min,72℃1 min,共30个循环。③特异性扩增产物的检测:用1XTBE配制2%琼脂糖凝胶,电压10-15 V/CM、电泳20 min,电泳结束后EB染色,自动凝胶成象仪分析结果。④HLA-DR的血清学分型:采用美国莱姆德公司HLA-DR单克隆分型干板。
, 百拇医药
2 结果
16名患者及其家系共61名个体HLA-DR位点的血清学分型和基因分型结果见附表。从表中可以看出:血清学分型7对供、受体相合,而PCR-SSP基因分型只有其中5对相合,另外1对为错判,1对为DR2两个亚型DR15、DR16间的错判。
附表 16名患者及其家系共61人HLA-DR位点血清学和基因分型结果 编号
血清分型
基因分型
编号
血清分型
基因分型
970030
, 百拇医药 DR14 DR12
DRB1140X 120X
980038
DR8 DR7
DRB1080X 070X
F
DR12 DR4
DRB1120X 040X
F
DR9
DRB10901
M
, 百拇医药
DR15 DR14
DRB1150X 140X
M
DR9 DR12
DRB10901 120X
S
DR15 DR12
DRB1150X 120X
S
DR9 DR7
DRB10901 070X
970031
, http://www.100md.com
DR15 DR9
DRB1150X 0901
980039
DR15 DR9
DRB1150X 0901
F
DR16 DR9
DRB1160X 0901
F
DR15 DR12
DRB1150X
M
, 百拇医药
DR15 DR14
DRB1150X 1410
M
DR3 DR9
DRB10301 0901
S
DR14 DR16
DRB11410 160X
S
DR15 DR9
DRB1150X 0901
970032
, http://www.100md.com
DR8 DR3
DRB1080X 0301
980040#
DR16 DR8
DRB1160X 080X
F
DR15 DR3
DRB1150X 0301
F
DR16
DRB1150X 160X
M
, http://www.100md.com
DR8 DR15
DRB1080X 150X
M
DR8 DR16
DRB1080X 070X
S
DR15 DR8
DRB1150X 080X
S
DR16 DR8
DRB1150X 080X
970033
, http://www.100md.com
DR12 DR15
DRB1120X 150X
980041
DR7 DR8
DRB1070X 080X
F
DR15
DRB1150X
S
DR7 DR8
DRB1070X 080X
M
, 百拇医药
DR12 DR9
DRB1120X 0901
980042
DR9 DR7
DRB1090X 070X
S
DR15 DR12
DRB1150X 120X
F
DR3 DR7
DRB10301 070X
970034
, 百拇医药
DR4
DRB1040X
M
DR9
DRB1090X
F
DRB1040X 120X
S
DR9 DR3
DRB1090X 0301
M
DRB1040X 150X
, 百拇医药
980043#
DR10 DR1
DRB11001 0103
S
DR4
DRB1040X
S
DR4 DR12
DRB1040X 120X
970035
DR14 DR13
DRB1140X 130X
, 百拇医药
S
DR10 DR1
DRB11001 040X
F
DR14 DR15
DRB1140X 150X
S
DR1 DR12
DRB10103 120X
M
DR13 DR9
DRB1130X 0901
, 百拇医药
970044
DR16 DR7
DRB1160X 070X
S
DR15 DR9
DRB1150X 0901
F
DR16 DR9
DRB1160X 0901
970036
DR8 DR4
DRB1080X 040X
, 百拇医药
M
DR7 DR8
DRB1070X 080X
F
DR15 DR4
DRB1150X 040X
S
DR8 DR9
DRB1080X 0901
M
DR9 DR8
DRB10901 080X
, 百拇医药
970045
DR3 DR14
DRB10301 140X
S
DR4 DR9
DRB1040X 0901
F
DR3 DR15
DRB10301 150X
970037
DR16 DR12
DRB1160X 120X
, 百拇医药
F
DR12 DR7
DRB1120X 070X
M
DR16 DR7
DRB1160X 070X
S
DR16 DR7
DRB1160X 070X
S
DR16 DR12
DRB1160X 120X
, 百拇医药
F:Father M:Mother S:Sobbing
:血清学分型和基因分型供、受者HLA-DR相合
#:血清学分型相合,而基因分型不合。
3 讨论
在异基因造血干细胞移植中,HLA某些关键位点错配都将增加GVHD的发生率,从而导致移植失败。因此,对HLA基因位点的正确识别是移植成败的关键。目前国际仍普遍沿用血清学分型,是一种成熟而且具有广泛临床应用价值的HLA配型方法,但它有其明显的不足之处:①标本必须为活细胞。②血清学反应有时不强,结果难以判断,因此有较大的主观性。③血清学对Ⅱ类抗原指定的正确率低于Ⅰ类抗原。目前,多数HLA-Ⅱ类基因配型方法均是PCR扩增之后,再用其他方法进行检测。而PCR-SSP将PCR扩增和检测两个步骤合为一次完成,无需探针杂交和任何内切酶消化,使操作过程简便、快速,是目前HLA-DNA分型最常采用的技术〔2~4〕。本文对16名患者及其家属61人进行了HLA-DR血清学分型和基因分型,结果表明,血清学分型7名患者在家系中找到HLA-DR相合的供体,而PCR-SSP基因分型只有其中5对相合,另外2对1对为错判、1对DR2两个亚型DR15、DR16间的错判。两种分型方法符合率为90%,因此我们认为PCR-SSP基因分型是一种更为快速、准确的分型方法,具有广阔的应用前景。
, http://www.100md.com
*邮政编码:广州,5108180
**武汉,430030
参考文献
[1] Olerup O,Zetterguist H.HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers(PCR-SSP) in zhaours.Tissue Antigens,1992,39(5):225~35
[2] Bunce M,O′Ncil CM,Barnardo MC,et al.Photoyping:comprhensive DNA typing for HLA-A、B、C、DKB1、DRB3、DRB4、DRB5 and DQB1 by PCR with 144 primers mixes utilizing sequence-specific rpimers (PCR-SSP).Tissuc Antigens,1995,46(5):355~67
[3] Bune M,Welsh KI.Rapid DNA typing for HLA-C using sequence-specific primers (PCR-SSP).Tissue Antigens,1994,43:7~17
[4] Krausa P,Bodmer JG,Browning MJ,et al.Defining the common subtypes of HLA A9、A10、A28 and A1g by use of (APMS/PCR).Tissue Antigens,1993,43:91~9
1998-11-26 收稿 1999-02-13修回, 百拇医药