新的手性铂络合物与DNA两种不同结合方式中的分子识别
作者：杨铭 肖苏龙 周田彦 张家美 王保怀 李芝芬 孟兴莲 王夔
单位：杨铭 肖苏龙 周田彦 张家美(北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室,北京 100083)；王保怀 李芝芬(北京大学化学与分子工程学院物理化学研究所)；孟兴莲(山西省大同市药检所)；王夔(北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室,北京 100083)
关键词：铂络合物；DNA；分子结构；抗肿瘤药；化学；药物设计
北京医科大学学报000302 摘 要 目的：深入探讨手性铂络合物与DNA作用的分子机制，寻找抗癌铂络合物的设计规律。方法：用生物量热技术、DNA Tm测量、粘度滴定及NMR技术研究了手性不同的环方铂及环斑铂与CT-DNA的作用。结果：发现环方铂是通过方酸根的离去与DNA碱基之间形成共价键而结合的,而环斑铂是通过嵌插到DNA碱基对之间以非共价方式与DNA结合的。通过HPLC研究发现这两类铂络合物与DNA结合的碱基特异性完全不同。结论：本研究发现铂络合物对DNA的识别作用是手性相关的，这与癌细胞体外筛选的结果一致。通过计算机分子图形学对以上实验结果从理论上进行了初步分析。
, 百拇医药
中图分类号 R979.1 文献标识码 A
文章编号 1000-1530(2000)03-0198-05
Molecular recognition of two binding modes
of DNA with novel chiral Pt-complexes
YANG Ming，XIAO Su-Long， ZHOU Tian-Yan，ZHANG Jia-Mei，WANG Kui
(National Research Laboratory of Natural and Biomimetic
Drugs, Peking University, Beijing 100083, China)
, 百拇医药
WANG Bao-Huai， LI Zhi-Fen
(Institute of Physical Chemistry, College of Chemistry and Molecular Engineer, Peking University)
MENG Xing-Lian
(Drug Quality Control Institute, DaTong, Shanxi Province)
ABSTRACT Objective: To study the molecular mechanism of the interaction between DNA and chiral Pt-complexes. Methods: Two kinds of binding modes between DNA and the chiral isomers were evaluated by bio-microcalorimetric techniques and DNA Tm measurements. The binding molecular mechanism of R,R-SA-Pt and DNA was investigated by 13CNMR and DNA viscosity titrations. The binding specificity study of DNA base with the two kinds of novel Pt-complexes was conducted by HPLC. Results: Covalent binding and noncovalent binding interaction were evaluated, and DNA binding specificity differences between R,R and S,S-isomers were found. Conclusion: The effects of the chirality of the 1,2-diaminocyclohexane isomers and stereochemistry of the whole complexes on their anticancer activities and DNA molecular recognition have been discussed.
, 百拇医药
KEY WORDS Platinum complexes; DNA; Molecular structure; Antineoplastics agents/chem; Drug design▲
自1969年顺铂出现至现在成为临床上广泛应用的一类抗癌药，其飞速的发展虽标志着无机药物的复兴，但后来研制的上千种铂络合物中抗癌活性能超过顺铂的并不多见[1]。这说明仅靠机遇筛选来发现药物的旧模式极待改进。在抗癌铂络合物的设计中迫切需要以深入的药物作用分子机制研究为基础，寻找抗癌铂络合物的设计规律，开展以生物大分子为靶的理性药物设计。
近来，生命过程中的手性特异性现象越来越受到人们的关注，手性药物的研究也引起了生物学家的极大兴趣[2]。但是对于手性药物分子与DNA的分子识别研究还很不充分。为了研究手性药物对DNA的分子识别作用，特别是为了深入探讨手性铂络合物与DNA作用的分子机制，为抗癌铂络合物的设计提供依据，在抗癌活性筛选的基础上[3]，我们对于新合成的两类铂络合物，环己二胺方酸合铂——环方铂(R,R-SA-Pt；R,S-SA-Pt；S,S-SA-Pt；结构式如图1左)及环己二胺去甲斑蝥酸合铂——环斑铂(R,R-DC-Pt；R,S-DC-Pt；S,S-DC-Pt；结构式如图1右)的手性和立体化学对DNA的分子识别及DNA结合的碱基特异性的影响进行了研究。
, 百拇医药
图1 新的铂络合物结构
Figure 1 Structures of the novel Pt-complexes
1 材料与方法
1.1 药品
环方铂及环斑铂均由邹娟博士惠赠。其它试剂均购于Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 微量量热 使用美国CSC公司4200型等温滴定量热计,其最低测量热功率为0.2 μW。实验平衡时间200 s,每滴15 μl，每滴间隔480 s，实验温度为298.15 K。
1.2.2 粘度滴定 CT-DNA及其与环斑铂或环方铂作用后的粘度测定是采用Cannon-Fenske改进的Ostwald粘度计，参照文献[4]方法在(30.2±0.05)℃在PIPES00缓冲液中进行。用于计算相对粘度平均值的每个时间数据至少要连续重复3次。
, 百拇医药
1.2.3 DNA解链温度(Tm)测定 DNA变性实验在法国Setaram公司产的微量显示扫描仪MicroDSC-Ⅲ上进行，实验温度为283.15～383.15 K，计温速度为1 K*min-1 [5]。
1.2.4 HPLC 用CS-1000型高效液相色谱柱，ODS-C18填料，柱压7.5×106～12.7×106 Pa，流速1 ml*min-1，检测波长254 nm。流动相Ⅰ: 5%(体积分数)MeOH+20 mmol*L-1KH2PO4，流动相Ⅱ:10%(体积分数)MeOH+20 mmol.L-1KH2PO4(溶剂均为双蒸水)。将药物与单个核苷酸按一定比例(摩尔比1∶1)进行混合，放置反应24 h后，进行测定，观察加药后保留时间。根据峰面积的改变及是否有新峰出现研究药物对碱基对特异性反应。
, 百拇医药
1.2.5 NMR研究 在Bruker ARX 400 MHz超导核磁谱仪上分别测定方酸、环方铂、环方铂-DNA溶液的13CNMR谱及去甲斑蝥酸、环斑铂、环斑铂-DNA溶液的1HNMR谱，测定温度为25℃。D2O磷酸缓冲液为溶剂。
1.2.6 分子图形学研究 R,R-SA-Pt 及S,S-SA-Pt分别与DNA G或C碱基形成的复合物时的能量计算是在SGI Indy工作站，使用Tripos Sybyl软件进行。
2 结果
2.1 微量量热
表1列出了环方铂及环斑铂的3种不同构型化合物与CT-DNA作用的摩尔焓变值。
表1 新的手性铂络合物与CT-DNA作用的摩
, 百拇医药
尔焓变 (ΔrHm)及结合位点数(n)
Table 1 The enthalpy changes(ΔrHm) and binding site numbers (n) for
the binding of the new chiral Pt-complexes with CT-DNA at 298.15 K Complexes
ΔrHm(kJ.mol-1)
n
R,R-SA-Pt
-338.1
, 百拇医药
0.34
R,S-SA-Pt
-79.0
0.18
S,S-SA-Pt
0
0
R,R-DC-Pt
-7.2
1.10
R,S-DC-Pt
-1.1
0.98
, 百拇医药
S,S-DC-Pt
16.0
1.00
微量量热实验测定的是体系所有热效应的总和，从量热数据可以看出环方铂与DNA之间发生了较强的作用，所测得的标准焓变值属于共价键的范围，而环斑铂与DNA相互作用的标准焓变值均小于50 kJ.mol-1,属于非共价键的范围。这在顺铂类配合物中比较少见。
2.2 Tm的测定
为了进一步证实新的铂络合物与DNA的相互作用及考察其对DNA双螺旋氢键的影响，又进行了DNA解链温度的测定。表2列出了CT-DNA及加入铂络合物后，解链温度的变化ΔTm及相应解链摩尔焓变ΔmHm值。表2 CT-DNA及加入铂络合物后的ΔTm及相应ΔmHm
, http://www.100md.com
Table 2 ΔTm and ΔmHm of DNA in the presence and absence of
1,2-cyclohexanediamino-Pt complexes Complexes
ΔTm(K)
ΔmHm(kJ.mol-1)
DNA
0
15.70
R,R-SA-Pt
-2.20
, 百拇医药
11.00
R,S-SA-Pt
-1.40
10.20
S,S-SA-Pt
-0.60
13.30
R,R-DC-Pt
7.66
9.26
R,S-DC-Pt
3.56
, 百拇医药
10.70
S,S-DC-Pt
8.53
16.60
2.3 粘度滴定
图2为R,R-DC-Pt，R,S-DC-Pt，S,S -DC-Pt及R,S-SA-Pt对 DNA的粘度滴定曲线，显示出3种构型的环斑铂的加入均使DNA的相对粘度明显增加，而环方铂R,S-SA-Pt对DNA的粘度滴定曲线则为一直线，显示了铂络合物与DNA两种完全不同的结合方式。
图2 R,R-DC-Pt, R,S-DC-Pt, S,S-DC-Pt
, 百拇医药 及R，S-SA-Pt对DNA的粘度滴定曲线
Figure 2 Reduced viscosity vs mole ratio
of Pt-complexes to DNA base paris
2.4 NMR研究
以R,R-SA-Pt为代表，用13CNMR研究了环方铂与DNA的作用机制。方酸的4个碳原子均位于低场，因而表3列出了游离方酸、方酸合铂及加入DNA后，在96～206范围内所出现的13C峰的化学位移值。
表3 方酸(SA) 、SA-Pt、SA-Pt-DNA的13CNMR化学位移值
Table 3 13CNMR chemical shifts of squaric acid (SA),SA-Pt, SA-Pt-DNA Samples
, http://www.100md.com
Chemical shifts
Number of peaks in
96-206 region
SA
197.24
1
SA-Pt
196.53,202.16,205.48
3
SA-Pt-DNA
203.79
1
, 百拇医药
以S,S-DC-Pt为代表，用1HNMR研究了环斑铂与DNA的作用机制。表4列出了游离去甲斑蝥酸(DC)，去甲斑蝥酸合铂及加入DNA后，去甲斑蝥酸2位和3位H的化学位移值。结果表明去甲斑蝥酸络合前后2位和3位H的化学位移值变化较大，而加入DNA后去甲斑蝥酸合铂2位和3位H的化学位移值仅发生微小的变化。表4 去甲斑蝥酸(DC)、DC-Pt、DC-Pt-DNA
的1HNMR化学位移值
Table 4 1HNMR chemical shifts of demethyleantharidin(DC)，DC-Pt，DC-Pt-DNA Samples
H
Chemical shifts
DC
, 百拇医药
H-2
1.376
H-3
1.495
DC-Pt
H-2
1.351
H-3
1.463
DC-Pt-DNA
H-2
1.345
H-3
, http://www.100md.com
1.464
2.5 HPLC测定
药物与DNA作用的特异性识别包括碱基特异性及序列特异性识别，我们用HPLC研究了铂络合物对DNA 4种单核苷酸的选择性作用。表5为dAMP, dTMP, dCMP, dGMP加入R,R构型的环方铂前后保留时间、峰面积及其改变(ΔS)的数据汇总。
表6为dAMP, dTMP, dCMP, dGMP加入R,R构型的环斑铂前后保留时间、峰面积及其改变的数据汇总。
从表5及表6的数据可以看出，当dAMP,dTMP加环方铂后原保留时间无明显变化，峰面积无明显的下降，而加入环斑铂后却变化显著，dGMP,dCMP加环斑铂后原保留时间及峰面积都无显著变化，而加环方铂后原特征峰面积明显减少，且有新峰出现，说明有新的共价化合物生成。表5 HPLC测定的dAMP、dTMP、dCMP、dGMP加环方铂前后保留时间、峰面积及其改变值
, 百拇医药
Table 5 The HPLC data of dNMP and dNMP+R,R-SA-Pt Sampls
t/min
Area
Area%
ΔS
New peak appearance
dGMP
4.78
166 012
18.870
dGMP+(R,R-SA-Pt)
, 百拇医药
4.81
109 572
6.943
56 440
7.72
11 804
0.748
new peak
dCMP
4.01
234 544
100.000
dCMP+(R,R-SA-Pt)
, http://www.100md.com
4.01
204 259
20.231
30 285
6.53
24 874
2.464
new peak
dTMP
4.51
46 564
12.255
dTMP+(R,R-SA-Pt)
, 百拇医药
4.48
66 535
15.572
dAMP
14.76
503 576
29.949
dAMP+(R,R-SA-Pt)
14.70
575 840
21.399
表6 dAMP，dTMP，dCMP，dGMP加环斑铂前后保留时间、峰面积及其改变值
, 百拇医药
Table 6 HPLC data for dNMP and dNMP with R,R-DC-Pt Samples
t/min
Area
Area%
Δs
dAMP
12.52
484 106
93.325
-
dAMP+(R,R-DC-Pt)
, http://www.100md.com
12.52
267 725
100.000
216 381
dTMP
6.04
191 232
100.000
-
dTMP+(R,R-DC-Pt)
6.02
174 646
, 百拇医药
100.000
16 586
dCMP
3.47
327 755
64.478
-
dCMP+(R,R-DC-Pt)
3.45
331 004
74.341
-
, http://www.100md.com dGMP
6.65
238 486
100.000
-
dGMP+(R,R-DC-Pt)
6.63
294 602
78.313
-
There is no new peak appearance in HPLC data.
应该指出在研究这两类新的铂络合物中发现其对DNA碱基选择性作用最强的都是RR构型的,为了深刻认识这一实验结果，我们进行了环方铂与单核苷酸计算机分子摸拟的docking理论计算。表7列出了dGMP或dCMP与R,S-SA-Pt或S,S-SA-Pt作用的能量优化结果。
, 百拇医药
3 讨论
首先从本实验中所得到的量热数据可以看出，两类新的铂络合物都是以DNA为靶的，环方铂与DNA之间有共价生成，而环斑铂与DNA之间结合的热效应均小于50 kJ*mol-1, 说明仅有弱作用，属于非共价键结合，与一般的顺铂类络合物与DNA的作用方式完全不同。在同一配体中环己二胺合铂的3种不同立体构型化合物与CT-DNA作用的摩尔焓变值之间的显著差异，从宏观上预示了化合物手性对其与DNA作用的影响。
表7 dGMP或dCMP与R,S-SA-Pt或
S,S-SA-Pt作用的能量优化数据
Table 7 The energy minimized data of dGMP or dCMP with
R,R-SA-Pt(R,R) or S,S-SA-Pt(S,S) Samples
, http://www.100md.com
Out of
plane
Energy/(kJ.mol-1)
1-4 van der
Waals
van der
Waals
Total
dGMP-R,R
0.004
-3.281
-36.47
, 百拇医药
209.7
dGMP-S,S
0.004
3.954
-40.53
237.1
dCMP-R,R
0.079
9.338
-50.08
225.3
dCMP-S,S
, 百拇医药 0.113
6.655
-46.44
255.8
由于铂络合物的加入所导致的DNA解链温度(Tm)的改变更直接证实了络合物存在对DNA双螺旋结构的影响，DNA Tm改变值(ΔTm)的数据不仅说明了两类新的铂络合物的存在对DNA双螺旋构象的影响，而且说明了非共价结合对DNA双螺旋结构的影响远远大于共价结合。 同时，由于手性不同所引起的DNA ΔTm值的差异,说明了手性特征在铂络合物与DNA结合时起了很重要的作用。此实验结果也与量热的结果一致。
由表3可以清楚地看出R,R-环方铂与DNA的作用的分子机制，可以初步判定环方铂与DNA的作用方式与顺铂有类似性。方酸的4个碳原子中，有两个是羰基碳，两个是烯醇式碳。方酸在溶液中存在着酮式和烯醇式的快速互变。在对方酸的溶液测试中，每个碳原子得出的信号实际上是烯醇式和酮式信号的平均值。因此在对方酸测试中只显示1个单峰信号。而在对方酸-Pt测试中,由于两个氧原子与Pt配位,烯醇式和酮式之间不能发生交换,显示出3个信号，烯醇式碳位于略低场处, 由于受到附近不对称因素的影响裂分为两个小峰。略高场处峰高为小峰两倍的单峰是羰基碳的信号。DNA加入后，Pt-O键断裂，方酸根游离至溶液中，烯醇式和酮式之间恢复了交换，如在对方酸-Pt-DNA测试中所示, 在低场变为1个信号。与单纯的方酸对比，此峰有6.55的位移,这是由于溶液的不同pH值造成的。在方酸-Pt与DNA的接近中性的混合溶液中，方酸的浓度很低,解离度比纯方酸溶液的大，以酸根离子形态存在的比例较多,碳核附近的电子云密度较大,所以信号向低场方向移动。而对
, 百拇医药
13 CNMR化学位移值的分析证明了环方铂是通过方酸根的离去与DNA结合的, 其与DNA的作用方式和顺铂有类似性。而环斑铂与DNA作用的
1 HNMR研究结果告诉我们，DNA的加入未使环斑铂的1H峰的化学位移及峰型出现明显的变化,说明去甲斑蝥酸根在与DNA的作用中不是作为离去基团存在的，环斑铂与DNA的作用方式和顺铂及环方铂完全不同。
NMR研究揭示了环方铂与DNA作用的分子机制，证明新的环方铂络合物的作用是随着方酸根的离去，进而形成了新的共价键来与DNA结合的。而环斑铂与DNA的作用却无离去基团的存在，呈现了与传统的顺铂完全不同的结合方式。DNA粘度滴定的结果说明3种构型的环斑铂的加入均使DNA的相对粘度明显增加，这是由于环斑铂嵌插入DNA碱基对之间造成的，由此证实了环斑铂与DNA之间的嵌插结合方式。我们注意到图2中环方铂R,S-SA-Pt对DNA的粘度滴定曲线是一条水平的直线，说明它们与DNA之间不存在嵌插作用。DNA粘度滴定的结果同样显示了铂络合物与DNA两种完全不同的结合方式。
, 百拇医药
从HPLC结果中，表5及表6的数据可以看出铂络合物对4种单核苷酸具有结合特异性。当dAMP,dTMP加环方铂后原保留时间无明显变化，峰面积无明显的下降，而加入环斑铂后却变化显著，dGMP,dCMP加环斑铂后原保留时间及峰面积都无显著变化，而加环方铂后原特征峰面积明显减少，且有新峰出现，说明有新的共价化合物生成。dAMP, dTMP在加了环斑铂之后虽变化显著但无新峰出现，是由于单核苷酸与环斑铂之间是弱键结合，这正说明环斑铂是一类与DNA非共价结合的新的铂配合物。
我们发现在这两类新的铂络合物中，对DNA碱基选择性作用最强的都是RR构型的。表7列出的环方铂与单核苷酸计算机分子模拟的docking能量优化数据表明，RR构型的铂络合物与dGMP或dCMP作用的能量均低于SS构型的铂络合物。这从能量的角度为新的手性铂络合物与DNA的分子识别作用提供了理论计算的依据。
对于环方铂抗癌作用的分子机制研究说明新的铂络合物是以DNA为靶分子的，同时不同配体的顺铂类络合物与DNA的结合，有两种完全不同的方式。并揭示了在共价结合中，铂络合物与DNA通过离去基团效应而结合的分子机制；非共价结合中通过嵌插作用与DNA形成复合物的作用机制。它们与DNA结合的热效应不同，对DNA双螺旋结构的影响也不同。在两种不同方式的结合中，DNA碱基结合特异性明显不同。而且RR构型的铂络合物对DNA 的作用最强，对DNA双螺旋构象影响最大，碱基特异性最明显，体外筛选也表现出最强的抗癌活性，充分说明药物的手性特征在与DNA识别结合过程中起着很重要的作用。■基金项目：国家自然科学基金(39870183)和高等学校博士学科点专项科研基金资助项目。
, 百拇医药
参考文献
[1]Aletras V, Hadjiliadis D, Hadjiliadis N. On the mechanism of action of the antitumor drug cis-Platin (cisDDP) and its second generation derivatives[J]. Metal Based Drugs, 1995,2(3): 153-178
[2]Yang M, HU QY, Li RC, et al. Chiral specificity of novel platinum complexes in their cross-membrane transport and DNA molecular recognition[J], S Afr J Chem, 1997, 50(4): 227-232
[3]Kidda Y, Noji M. Platinum and other metals coordination compounds in cancer chemotherapy[M]. New York： Plenum Press,1991.127-141
, 百拇医药
[4]Yang M, Wang K, Zang CB, et al. Binding of carboline derivatives to calf thymus DNA—determination of binding mode and binding strength[J]. J Chin Pharm Sci, 1994,3(1): 51-58
[5]Hopkins HP, Yang M, Wilson WD, et al. Intercalation binding of 6-substituted naphthothiopheneamides to DNA: Enthalpy and entropy components[J]. Biopolymers, 1991,31: 1105-1114
收稿日期：2000-01-25, 百拇医药
单位：杨铭 肖苏龙 周田彦 张家美(北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室,北京 100083)；王保怀 李芝芬(北京大学化学与分子工程学院物理化学研究所)；孟兴莲(山西省大同市药检所)；王夔(北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室,北京 100083)
关键词：铂络合物；DNA；分子结构；抗肿瘤药；化学；药物设计
北京医科大学学报000302 摘 要 目的：深入探讨手性铂络合物与DNA作用的分子机制，寻找抗癌铂络合物的设计规律。方法：用生物量热技术、DNA Tm测量、粘度滴定及NMR技术研究了手性不同的环方铂及环斑铂与CT-DNA的作用。结果：发现环方铂是通过方酸根的离去与DNA碱基之间形成共价键而结合的,而环斑铂是通过嵌插到DNA碱基对之间以非共价方式与DNA结合的。通过HPLC研究发现这两类铂络合物与DNA结合的碱基特异性完全不同。结论：本研究发现铂络合物对DNA的识别作用是手性相关的，这与癌细胞体外筛选的结果一致。通过计算机分子图形学对以上实验结果从理论上进行了初步分析。
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中图分类号 R979.1 文献标识码 A
文章编号 1000-1530(2000)03-0198-05
Molecular recognition of two binding modes
of DNA with novel chiral Pt-complexes
YANG Ming，XIAO Su-Long， ZHOU Tian-Yan，ZHANG Jia-Mei，WANG Kui
(National Research Laboratory of Natural and Biomimetic
Drugs, Peking University, Beijing 100083, China)
, 百拇医药
WANG Bao-Huai， LI Zhi-Fen
(Institute of Physical Chemistry, College of Chemistry and Molecular Engineer, Peking University)
MENG Xing-Lian
(Drug Quality Control Institute, DaTong, Shanxi Province)
ABSTRACT Objective: To study the molecular mechanism of the interaction between DNA and chiral Pt-complexes. Methods: Two kinds of binding modes between DNA and the chiral isomers were evaluated by bio-microcalorimetric techniques and DNA Tm measurements. The binding molecular mechanism of R,R-SA-Pt and DNA was investigated by 13CNMR and DNA viscosity titrations. The binding specificity study of DNA base with the two kinds of novel Pt-complexes was conducted by HPLC. Results: Covalent binding and noncovalent binding interaction were evaluated, and DNA binding specificity differences between R,R and S,S-isomers were found. Conclusion: The effects of the chirality of the 1,2-diaminocyclohexane isomers and stereochemistry of the whole complexes on their anticancer activities and DNA molecular recognition have been discussed.
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KEY WORDS Platinum complexes; DNA; Molecular structure; Antineoplastics agents/chem; Drug design▲
自1969年顺铂出现至现在成为临床上广泛应用的一类抗癌药，其飞速的发展虽标志着无机药物的复兴，但后来研制的上千种铂络合物中抗癌活性能超过顺铂的并不多见[1]。这说明仅靠机遇筛选来发现药物的旧模式极待改进。在抗癌铂络合物的设计中迫切需要以深入的药物作用分子机制研究为基础，寻找抗癌铂络合物的设计规律，开展以生物大分子为靶的理性药物设计。
近来，生命过程中的手性特异性现象越来越受到人们的关注，手性药物的研究也引起了生物学家的极大兴趣[2]。但是对于手性药物分子与DNA的分子识别研究还很不充分。为了研究手性药物对DNA的分子识别作用，特别是为了深入探讨手性铂络合物与DNA作用的分子机制，为抗癌铂络合物的设计提供依据，在抗癌活性筛选的基础上[3]，我们对于新合成的两类铂络合物，环己二胺方酸合铂——环方铂(R,R-SA-Pt；R,S-SA-Pt；S,S-SA-Pt；结构式如图1左)及环己二胺去甲斑蝥酸合铂——环斑铂(R,R-DC-Pt；R,S-DC-Pt；S,S-DC-Pt；结构式如图1右)的手性和立体化学对DNA的分子识别及DNA结合的碱基特异性的影响进行了研究。
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图1 新的铂络合物结构
Figure 1 Structures of the novel Pt-complexes
1 材料与方法
1.1 药品
环方铂及环斑铂均由邹娟博士惠赠。其它试剂均购于Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 微量量热 使用美国CSC公司4200型等温滴定量热计,其最低测量热功率为0.2 μW。实验平衡时间200 s,每滴15 μl，每滴间隔480 s，实验温度为298.15 K。
1.2.2 粘度滴定 CT-DNA及其与环斑铂或环方铂作用后的粘度测定是采用Cannon-Fenske改进的Ostwald粘度计，参照文献[4]方法在(30.2±0.05)℃在PIPES00缓冲液中进行。用于计算相对粘度平均值的每个时间数据至少要连续重复3次。
, 百拇医药
1.2.3 DNA解链温度(Tm)测定 DNA变性实验在法国Setaram公司产的微量显示扫描仪MicroDSC-Ⅲ上进行，实验温度为283.15～383.15 K，计温速度为1 K*min-1 [5]。
1.2.4 HPLC 用CS-1000型高效液相色谱柱，ODS-C18填料，柱压7.5×106～12.7×106 Pa，流速1 ml*min-1，检测波长254 nm。流动相Ⅰ: 5%(体积分数)MeOH+20 mmol*L-1KH2PO4，流动相Ⅱ:10%(体积分数)MeOH+20 mmol.L-1KH2PO4(溶剂均为双蒸水)。将药物与单个核苷酸按一定比例(摩尔比1∶1)进行混合，放置反应24 h后，进行测定，观察加药后保留时间。根据峰面积的改变及是否有新峰出现研究药物对碱基对特异性反应。
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1.2.5 NMR研究 在Bruker ARX 400 MHz超导核磁谱仪上分别测定方酸、环方铂、环方铂-DNA溶液的13CNMR谱及去甲斑蝥酸、环斑铂、环斑铂-DNA溶液的1HNMR谱，测定温度为25℃。D2O磷酸缓冲液为溶剂。
1.2.6 分子图形学研究 R,R-SA-Pt 及S,S-SA-Pt分别与DNA G或C碱基形成的复合物时的能量计算是在SGI Indy工作站，使用Tripos Sybyl软件进行。
2 结果
2.1 微量量热
表1列出了环方铂及环斑铂的3种不同构型化合物与CT-DNA作用的摩尔焓变值。
表1 新的手性铂络合物与CT-DNA作用的摩
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尔焓变 (ΔrHm)及结合位点数(n)
Table 1 The enthalpy changes(ΔrHm) and binding site numbers (n) for
the binding of the new chiral Pt-complexes with CT-DNA at 298.15 K Complexes
ΔrHm(kJ.mol-1)
n
R,R-SA-Pt
-338.1
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0.34
R,S-SA-Pt
-79.0
0.18
S,S-SA-Pt
0
0
R,R-DC-Pt
-7.2
1.10
R,S-DC-Pt
-1.1
0.98
, 百拇医药
S,S-DC-Pt
16.0
1.00
微量量热实验测定的是体系所有热效应的总和，从量热数据可以看出环方铂与DNA之间发生了较强的作用，所测得的标准焓变值属于共价键的范围，而环斑铂与DNA相互作用的标准焓变值均小于50 kJ.mol-1,属于非共价键的范围。这在顺铂类配合物中比较少见。
2.2 Tm的测定
为了进一步证实新的铂络合物与DNA的相互作用及考察其对DNA双螺旋氢键的影响，又进行了DNA解链温度的测定。表2列出了CT-DNA及加入铂络合物后，解链温度的变化ΔTm及相应解链摩尔焓变ΔmHm值。表2 CT-DNA及加入铂络合物后的ΔTm及相应ΔmHm
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Table 2 ΔTm and ΔmHm of DNA in the presence and absence of
1,2-cyclohexanediamino-Pt complexes Complexes
ΔTm(K)
ΔmHm(kJ.mol-1)
DNA
0
15.70
R,R-SA-Pt
-2.20
, 百拇医药
11.00
R,S-SA-Pt
-1.40
10.20
S,S-SA-Pt
-0.60
13.30
R,R-DC-Pt
7.66
9.26
R,S-DC-Pt
3.56
, 百拇医药
10.70
S,S-DC-Pt
8.53
16.60
2.3 粘度滴定
图2为R,R-DC-Pt，R,S-DC-Pt，S,S -DC-Pt及R,S-SA-Pt对 DNA的粘度滴定曲线，显示出3种构型的环斑铂的加入均使DNA的相对粘度明显增加，而环方铂R,S-SA-Pt对DNA的粘度滴定曲线则为一直线，显示了铂络合物与DNA两种完全不同的结合方式。
图2 R,R-DC-Pt, R,S-DC-Pt, S,S-DC-Pt
, 百拇医药 及R，S-SA-Pt对DNA的粘度滴定曲线
Figure 2 Reduced viscosity vs mole ratio
of Pt-complexes to DNA base paris
2.4 NMR研究
以R,R-SA-Pt为代表，用13CNMR研究了环方铂与DNA的作用机制。方酸的4个碳原子均位于低场，因而表3列出了游离方酸、方酸合铂及加入DNA后，在96～206范围内所出现的13C峰的化学位移值。
表3 方酸(SA) 、SA-Pt、SA-Pt-DNA的13CNMR化学位移值
Table 3 13CNMR chemical shifts of squaric acid (SA),SA-Pt, SA-Pt-DNA Samples
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Chemical shifts
Number of peaks in
96-206 region
SA
197.24
1
SA-Pt
196.53,202.16,205.48
3
SA-Pt-DNA
203.79
1
, 百拇医药
以S,S-DC-Pt为代表，用1HNMR研究了环斑铂与DNA的作用机制。表4列出了游离去甲斑蝥酸(DC)，去甲斑蝥酸合铂及加入DNA后，去甲斑蝥酸2位和3位H的化学位移值。结果表明去甲斑蝥酸络合前后2位和3位H的化学位移值变化较大，而加入DNA后去甲斑蝥酸合铂2位和3位H的化学位移值仅发生微小的变化。表4 去甲斑蝥酸(DC)、DC-Pt、DC-Pt-DNA
的1HNMR化学位移值
Table 4 1HNMR chemical shifts of demethyleantharidin(DC)，DC-Pt，DC-Pt-DNA Samples
H
Chemical shifts
DC
, 百拇医药
H-2
1.376
H-3
1.495
DC-Pt
H-2
1.351
H-3
1.463
DC-Pt-DNA
H-2
1.345
H-3
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1.464
2.5 HPLC测定
药物与DNA作用的特异性识别包括碱基特异性及序列特异性识别，我们用HPLC研究了铂络合物对DNA 4种单核苷酸的选择性作用。表5为dAMP, dTMP, dCMP, dGMP加入R,R构型的环方铂前后保留时间、峰面积及其改变(ΔS)的数据汇总。
表6为dAMP, dTMP, dCMP, dGMP加入R,R构型的环斑铂前后保留时间、峰面积及其改变的数据汇总。
从表5及表6的数据可以看出，当dAMP,dTMP加环方铂后原保留时间无明显变化，峰面积无明显的下降，而加入环斑铂后却变化显著，dGMP,dCMP加环斑铂后原保留时间及峰面积都无显著变化，而加环方铂后原特征峰面积明显减少，且有新峰出现，说明有新的共价化合物生成。表5 HPLC测定的dAMP、dTMP、dCMP、dGMP加环方铂前后保留时间、峰面积及其改变值
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Table 5 The HPLC data of dNMP and dNMP+R,R-SA-Pt Sampls
t/min
Area
Area%
ΔS
New peak appearance
dGMP
4.78
166 012
18.870
dGMP+(R,R-SA-Pt)
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4.81
109 572
6.943
56 440
7.72
11 804
0.748
new peak
dCMP
4.01
234 544
100.000
dCMP+(R,R-SA-Pt)
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4.01
204 259
20.231
30 285
6.53
24 874
2.464
new peak
dTMP
4.51
46 564
12.255
dTMP+(R,R-SA-Pt)
, 百拇医药
4.48
66 535
15.572
dAMP
14.76
503 576
29.949
dAMP+(R,R-SA-Pt)
14.70
575 840
21.399
表6 dAMP，dTMP，dCMP，dGMP加环斑铂前后保留时间、峰面积及其改变值
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Table 6 HPLC data for dNMP and dNMP with R,R-DC-Pt Samples
t/min
Area
Area%
Δs
dAMP
12.52
484 106
93.325
-
dAMP+(R,R-DC-Pt)
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12.52
267 725
100.000
216 381
dTMP
6.04
191 232
100.000
-
dTMP+(R,R-DC-Pt)
6.02
174 646
, 百拇医药
100.000
16 586
dCMP
3.47
327 755
64.478
-
dCMP+(R,R-DC-Pt)
3.45
331 004
74.341
-
, http://www.100md.com dGMP
6.65
238 486
100.000
-
dGMP+(R,R-DC-Pt)
6.63
294 602
78.313
-
There is no new peak appearance in HPLC data.
应该指出在研究这两类新的铂络合物中发现其对DNA碱基选择性作用最强的都是RR构型的,为了深刻认识这一实验结果，我们进行了环方铂与单核苷酸计算机分子摸拟的docking理论计算。表7列出了dGMP或dCMP与R,S-SA-Pt或S,S-SA-Pt作用的能量优化结果。
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3 讨论
首先从本实验中所得到的量热数据可以看出，两类新的铂络合物都是以DNA为靶的，环方铂与DNA之间有共价生成，而环斑铂与DNA之间结合的热效应均小于50 kJ*mol-1, 说明仅有弱作用，属于非共价键结合，与一般的顺铂类络合物与DNA的作用方式完全不同。在同一配体中环己二胺合铂的3种不同立体构型化合物与CT-DNA作用的摩尔焓变值之间的显著差异，从宏观上预示了化合物手性对其与DNA作用的影响。
表7 dGMP或dCMP与R,S-SA-Pt或
S,S-SA-Pt作用的能量优化数据
Table 7 The energy minimized data of dGMP or dCMP with
R,R-SA-Pt(R,R) or S,S-SA-Pt(S,S) Samples
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Out of
plane
Energy/(kJ.mol-1)
1-4 van der
Waals
van der
Waals
Total
dGMP-R,R
0.004
-3.281
-36.47
, 百拇医药
209.7
dGMP-S,S
0.004
3.954
-40.53
237.1
dCMP-R,R
0.079
9.338
-50.08
225.3
dCMP-S,S
, 百拇医药 0.113
6.655
-46.44
255.8
由于铂络合物的加入所导致的DNA解链温度(Tm)的改变更直接证实了络合物存在对DNA双螺旋结构的影响，DNA Tm改变值(ΔTm)的数据不仅说明了两类新的铂络合物的存在对DNA双螺旋构象的影响，而且说明了非共价结合对DNA双螺旋结构的影响远远大于共价结合。 同时，由于手性不同所引起的DNA ΔTm值的差异,说明了手性特征在铂络合物与DNA结合时起了很重要的作用。此实验结果也与量热的结果一致。
由表3可以清楚地看出R,R-环方铂与DNA的作用的分子机制，可以初步判定环方铂与DNA的作用方式与顺铂有类似性。方酸的4个碳原子中，有两个是羰基碳，两个是烯醇式碳。方酸在溶液中存在着酮式和烯醇式的快速互变。在对方酸的溶液测试中，每个碳原子得出的信号实际上是烯醇式和酮式信号的平均值。因此在对方酸测试中只显示1个单峰信号。而在对方酸-Pt测试中,由于两个氧原子与Pt配位,烯醇式和酮式之间不能发生交换,显示出3个信号，烯醇式碳位于略低场处, 由于受到附近不对称因素的影响裂分为两个小峰。略高场处峰高为小峰两倍的单峰是羰基碳的信号。DNA加入后，Pt-O键断裂，方酸根游离至溶液中，烯醇式和酮式之间恢复了交换，如在对方酸-Pt-DNA测试中所示, 在低场变为1个信号。与单纯的方酸对比，此峰有6.55的位移,这是由于溶液的不同pH值造成的。在方酸-Pt与DNA的接近中性的混合溶液中，方酸的浓度很低,解离度比纯方酸溶液的大，以酸根离子形态存在的比例较多,碳核附近的电子云密度较大,所以信号向低场方向移动。而对
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13 CNMR化学位移值的分析证明了环方铂是通过方酸根的离去与DNA结合的, 其与DNA的作用方式和顺铂有类似性。而环斑铂与DNA作用的
1 HNMR研究结果告诉我们，DNA的加入未使环斑铂的1H峰的化学位移及峰型出现明显的变化,说明去甲斑蝥酸根在与DNA的作用中不是作为离去基团存在的，环斑铂与DNA的作用方式和顺铂及环方铂完全不同。
NMR研究揭示了环方铂与DNA作用的分子机制，证明新的环方铂络合物的作用是随着方酸根的离去，进而形成了新的共价键来与DNA结合的。而环斑铂与DNA的作用却无离去基团的存在，呈现了与传统的顺铂完全不同的结合方式。DNA粘度滴定的结果说明3种构型的环斑铂的加入均使DNA的相对粘度明显增加，这是由于环斑铂嵌插入DNA碱基对之间造成的，由此证实了环斑铂与DNA之间的嵌插结合方式。我们注意到图2中环方铂R,S-SA-Pt对DNA的粘度滴定曲线是一条水平的直线，说明它们与DNA之间不存在嵌插作用。DNA粘度滴定的结果同样显示了铂络合物与DNA两种完全不同的结合方式。
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从HPLC结果中，表5及表6的数据可以看出铂络合物对4种单核苷酸具有结合特异性。当dAMP,dTMP加环方铂后原保留时间无明显变化，峰面积无明显的下降，而加入环斑铂后却变化显著，dGMP,dCMP加环斑铂后原保留时间及峰面积都无显著变化，而加环方铂后原特征峰面积明显减少，且有新峰出现，说明有新的共价化合物生成。dAMP, dTMP在加了环斑铂之后虽变化显著但无新峰出现，是由于单核苷酸与环斑铂之间是弱键结合，这正说明环斑铂是一类与DNA非共价结合的新的铂配合物。
我们发现在这两类新的铂络合物中，对DNA碱基选择性作用最强的都是RR构型的。表7列出的环方铂与单核苷酸计算机分子模拟的docking能量优化数据表明，RR构型的铂络合物与dGMP或dCMP作用的能量均低于SS构型的铂络合物。这从能量的角度为新的手性铂络合物与DNA的分子识别作用提供了理论计算的依据。
对于环方铂抗癌作用的分子机制研究说明新的铂络合物是以DNA为靶分子的，同时不同配体的顺铂类络合物与DNA的结合，有两种完全不同的方式。并揭示了在共价结合中，铂络合物与DNA通过离去基团效应而结合的分子机制；非共价结合中通过嵌插作用与DNA形成复合物的作用机制。它们与DNA结合的热效应不同，对DNA双螺旋结构的影响也不同。在两种不同方式的结合中，DNA碱基结合特异性明显不同。而且RR构型的铂络合物对DNA 的作用最强，对DNA双螺旋构象影响最大，碱基特异性最明显，体外筛选也表现出最强的抗癌活性，充分说明药物的手性特征在与DNA识别结合过程中起着很重要的作用。■基金项目：国家自然科学基金(39870183)和高等学校博士学科点专项科研基金资助项目。
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参考文献
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, 百拇医药
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收稿日期：2000-01-25, 百拇医药