补体C5b-9抗血清对抗胸腺细胞血清性肾炎大鼠肾组织一氧化氮合成及其病变的影响
作者：王迎伟 何球藻 秦慧莲 高丰光 汤仁仙
单位：王迎伟 高丰光 汤仁仙(徐州医学院免疫教研室， 江苏 徐州221002)；何球藻 秦慧莲(上海医科大学免疫教研室， 上海 200032)
关键词：补体膜攻击复合物；肾小球肾炎，膜增生性；一氧化氮；大鼠
中国病理生理杂志000909 [摘 要] 目的：探讨抗鼠补体C5b-9复合物抗血清对系膜增生性肾炎大鼠肾组织合成一氧化氮(NO)及其病变的作用。方法：复制大鼠系膜增生性肾小球肾炎即抗胸腺细胞血清性肾炎(ATSN)模型，用抗大鼠C5b-9复合物抗血清处理，观察其对ATSN大鼠NO相关指标及其病变的影响。结果：抗鼠C5b-9复合物抗血清既能减少ATSN大鼠肾组织诱生性NO合酶(iNOS)mRNA的表达和大鼠尿液中硝酸盐/亚硝酸盐(NO-3/NO-2)排泄量，还能减低大鼠肾组织病变的程度。NOS抑制剂L-NAME也可降低尿NO-3/NO-3排泄量，同时减轻肾组织病变程度。结论：抗鼠C5b-9复合物抗血清能够抑制肾细胞NO的合成及其肾小球系膜细胞的增生。
, 百拇医药
[中图分类号] R692 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0805-04
Effect of antiserum against complement C5b-9 complexes on
nitric oxide(NO) synthesis and pathologic changes
in renal tissue of ATSN rats
WANG Ying-wei, GAO Feng-guang, TANG Ren-xian
(Department of Immunology,Xuzhou Medical college,Xuzhou 221002, China)
, 百拇医药
HE Qiu-zao, QIN Hui-lian
(Department of Immunology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
[Abstract] AIM: To explore the effect of antiserum against rat complement C5b-9 complexes on nitric oxide synthesis and pathologic changes in renal tissue of rats with mesangioproliferative glomerulonephritis. METHEDS: The rat model of mesangioproliferative glomerulonephritis,namely,anti-thymocyte serum nephritis(ATSN) was established and the rats with ATSN were treated with antiserum against complement C5b-9 complexes. Some parameters related to NO and pathologic changes of the rats were observed.RESULTS:Anti-C5b-9 serum not only reduced the expression of inducible NO synthase(iNOS) mRNA in renal tissue and urinary content of nitrate/nitrite(NO-3/ NO-2) of rats with ATSN, but also reduced renal pathologic changes. L-NG-nitro arginine methylester (L-NAME) also reduced the contents of urinary NO-3/NO-2 and the renal pathologic changes of rats with ATSN. CONCLUSION:The antiserum against rat complement C5b-9 complexes inhibited glomerular NO synthesis and glomerular mesangial cell proliferation of rats with ATSN.
, 百拇医药
[MeSH] Complement membrane attack complex; Glomerulonephritis, membranoproliferative; Nitric oxide;Rats
大鼠抗胸腺细胞血清性肾炎(anti-thymocyte serum nephritis,ATSN)是人类系膜增生性肾炎的动物模型之一[1]。近年来的研究证明：ATSN的病变具有补体依赖性及中性粒细胞非依赖性[2]。亚溶解(sublytic)剂量的补体膜攻击复合体即C5b-9复合物在插入靶细胞膜后能够激活胞内多种代谢途径，致使一些生物活性介质释放，引起炎症病变和增生反应[3]。我们过去的实验已提示，一定量的C5b-9复合物能刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell, MC)合成一氧化氮(nitric oxide,NO)。本文旨在观察体内应用抗鼠C5b-9复合物抗血清处理ATSN大鼠后其肾组织诱生性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS) mRNA的表达、尿液中NO代谢产物——硝酸盐(nitrate, NO-3)和亚硝酸盐(nitrite, NO-2)排泄量及肾小球的病理变化，以了解C5b-9抗血清对ATSN大鼠肾组织NO合成及其病变程度有何影响。
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材 料 和 方 法
一、大鼠血清补体C5b-9复合物的提取及其抗血清的制备 见参考文献[4]。
二、大鼠胸腺细胞的分离及其抗血清的制备 操作方法见文献[5]。
三、大鼠ATSN模型的复制及其分组处理
取正常雌性SD大鼠32只(本实验动物中心提供)，重160-210 g。实验前先行尿蛋白测定，查无异常后随机分成4组，每组8只。(一)ATSN模型组：首次给大鼠尾静脉注射抗胸腺细胞血清(anti-thymocyte serum,ATS) 0.5 mL/100 g体重，然后每隔7 d再给大鼠注射ATS(0.5 mL/100 g)1次，共3次。(二)ATSN+Anti-C5b-9抗血清组：每次给大鼠静脉注射同(一)组的ATS后再静脉注射兔抗鼠C5b-9抗血清(0.5 mL/100 g)。(三)ATSN+L-NAME组：每次给大鼠静脉注射同(一)组的ATS后再静脉追加注射NG-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NG-nitro arginine methylester,L-NAME)，剂量为0.5 mg/100 g体重。(四)对照组：首次给大鼠静脉注射正常兔血清(剂量同ATS)后，每隔7 d再给大鼠注射生理盐水1次。
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四、检测指标
(一)点杂交(Dot-blot)测定肾组织iNOS mRNA的表达与丰度
用TRIZOL试剂(美国GIBCO公司)分别提取各组大鼠实验3、7 d和14 d活检的肾皮质总RNA，然后各取10 μg点在尼龙膜(德国B.M.公司)上，先预杂交42 ℃ 4 h，然后再用地高辛(digoxigenin,DIG)标记的大鼠iNOS cRNA探针[6]杂交，42 ℃ 16 h最后经DIG核苷酸检测试剂盒(B.M.公司)显色观察。
(二)原位杂交检查肾切片iNOS mRNA的表达
实验3 d、14 d取大鼠肾皮质行快速石蜡包埋，并制成7 μm厚切片，切片经梯度乙醇脱水、蛋白酶K(B.M产品)消化及PBS洗涤处理后，用DIG-iNOS cRNA探针进行预杂交、杂交，杂交时间及显示系统材料等均同Dot-blot检测。
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(三)尿液中NO-3/NO-2排泄量的测定
实验3 d、7 d、14 d及28 d分别将各组大鼠置代谢笼内，收集其24 h全部尿液，并测量尿液体积。采用硝酸还原酶法测定各鼠24 h尿液中NO的代谢产物NO-3/NO-2的排泄量，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。结果以nmol/24 h尿液表示。
(四)肾小球内细胞总数的变化
实验3 d、7 d、14 d和28 d活检各组大鼠肾皮质标本制成石腊切片(HE染色)，每个标本每张切片随机计数20个肾小球内细胞数，最后取均值比较。
(五)肾小球内α-SMA的表达
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同上时间活检的各组大鼠肾皮质制成冰冻切片(4 μm厚)后，用单克隆抗平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(DAKO公司)为一抗行ABC法染色检查各鼠肾小球内α-SMA的表达情况。α-SMA半定量分析采用德国MD-20型显微图像分析仪[分辨率：4×面积＝象素点×(0.0025 )2 mm]扫描测定。每张切片上随机取20个肾小球测定其平均积分光密度(OD)值，各组OD值取均数比较。
(六)肾小球系膜区的改变
各组大鼠肾皮质石腊切片HE染色(取材时间同上)标本，显微镜下观察肾小球系膜区细胞数及肾小球系膜区基质等病理变化。
结 果
一、Dot-blot检测肾组织iNOS mRNA的结果
实验3 d、7 d和14d时，ATSN模型组肾组织中均有明显的iNOS mRNA表达，而ATSN+Anti-C5b-9组实验3 d、7 d和14 d时，iNOS mRNA虽有表达，但丰度不如ATSN模型组高。另ATSN+L-NAME组，肾组织iNOS mRNA表达亦较显著，而正常对照组无iNOS mRNA的表达。结果见图1。
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二、原位杂交检测肾细胞iNOS mRNA的表达情况
实验3 d，ATSN模型组肾组织切片显示肾小球系膜细胞有明显的iNOS mRNA表达(图2)，而ATSN+Anti-C5b-9组肾小球系膜细胞表达iNOS mRNA量较少。此外，ATSN+L-NAME组，肾组织切片iNOS mRNA表达亦较明显。对照组无iNOS mRNA的表达。
三、尿液中NO-3/NO-2的排泄总量
实验各阶段，ATSN+Anti-C5b-9组大鼠24 h尿液中NO-3/NO-2排泄量均明显较ATSN组低，具体数据详见表1。
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Fig 1 The expression of renal tissue iNOS mRNA in four groups of rats by Dot-blot.
A. ATSN; B. ATSN+Anti-C5b-9; C. ATSN+L-NAME; D. Control.
图1 点杂交显示4组大鼠肾组织iNOS mRNA的表达
Fig 2 The expression of glomerular cells iNOS mRNA in rats with ATSN at day 3 by in situ hybridization (×100).
图2 原位杂交显示实验3 d时ATSN组大鼠肾小球系膜细胞iNOS mRNA的表达
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Fig 3 The expression of glomerular α-SMA in rats with ATSN at day 3 by immunohistochemistry staining (×400).
图3 免疫组化染色显示实验3 d时ATSN组鼠肾小球中α-SMA的表达
四、肾小球细胞总数的变化
实验各阶段，ATSN+Anti-C5b-9组肾小球内细胞总数明显不如ATSN组高，具体结果见表2。
五、肾小球内α-SMA的表达情况
实验3 d、ATSN组肾小球内可见平滑肌来源的系膜细胞增殖指标-α-SMA的阳性染色，呈束状或分枝状(图3)。显微图像扫描半定量分析结果表明，ATSN+Anti-C5b-9组肾小球内α-SMA的平均OD值明显低于ATSN组。(注：各阶段对照组鼠α-SMA表达呈阴性，其OD值为DAB显色背景的光密度值)。
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表1 4组大鼠24 h尿液中NO-3/NO-2量的变化
Tab 1 The changes of 24 h urinary NO-3/NO-2 content in four groups(
±s. n=8) Group
Content of 24 h urinary NO-3/NO-2(nmol/24 h)
3d
7d
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14d
28d
ATSN
486.79±127.29* *
855.66±133.16* *
978.75±208.77* *
613.75±159.26* *
ATSN+Anti-C5b-9
289.88±111.16△△
398.66±127.33*△△
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450.94±150.78*△△
311.56+131.67△△
ATSN+L-NAME
286.31±143.55△△
305.36±132.57△△
330.94±152.14△△
297.50±135.59△△
Control
252.98± 96.16
, 百拇医药
261.02± 76.85
282.81± 96.19
270.31±106.71
*P<0.05，* * P<0.01 vs control group；△△ P<0.01 vs ATSN.表2 4组大鼠肾小球内细胞总数的变化
Tab 2 Changes of cell numbers of glomeruli in four groups(±s. n=8) Grouop
Numbers of cell in glomeruli
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3d
7d
14d
28d
ATSN
65.18±7.75* *
70.56±7.64* *
87.80±11.22* *
89.93±12.95* *
ATSN+Anti-C5b-9
55.29±5.06△△
, http://www.100md.com
63.44±6.81△△
65.20±6.07* *△△
67.79±8.37* *△△
ATSN+L-NAME
57.41±7.11
66.98±6.38* *
74.72±6.31* *△△
77.17±6.54* *△
Control
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53.85±4.43
53.27±4.05
54.12±3.82
* * P<0.01 vs control;△ P<0.05,△△ P<0.01 vs ATSN.表3 4组肾小球内α-SMA平均OD值的变化
Tab 3 Changes of average OD of α-SMA in four groups(±s. n=8) Group
Average OD of α-SMA in glomeruli
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3d
7d
14d
28d
ATSN
0.2347±0.0108* *
0.3061±0.0137* *
0.3180±0.0115* *
0.2919±0.0113* *
ATSN+Anti-C5b-9
0.2205±0.0116
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0.2489±0.0123* *△△
0.2600±0.0116* *△△
0.2494±0.0134* *△△
ATSN+L-NAME
0.2246±0.0142*
0.2505±0.0115*△△
0.2782±0.0119* *△△
0.2641±0.0116* *△
Control
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0.2085±0.0089
0.2081±0.0086
0.2099±0.0101
0.2087±0.0079
* P<0.05,* * P<0.01 vs control;△ P<0.05,△△ P<0.01 vs ATSN.
Fig 4 The segmental proliferation of glomerular cells with increased mesangial matrix in rat with ATSN at day 28 by HE staining (×400).
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图4 HE染色显示实验28 d时，ATSN大鼠肾小球系膜细胞呈节段性增生伴系膜基质增多
六、肾小球系膜区的病变
实验3 d时，ATSN组肾小球系膜细胞数已明显升高，以后逐渐增多。实验28 d，肾小球系膜区有节段性增生，系膜区基质显著增加，部分毛细血管袢呈分叶状(图4)。而ATSN+Anti-C5b-9组，系膜区病变显著较ATSN组轻。
讨 论
给大鼠注射ATS后能够激活补体迅速导致MC的溶解坏死[2]。但组织学检查发现，肾小球中部分MC并无明显的溶解反应。有学者认为这些细胞的变化主要与亚溶解剂量的补体C5b-9复合物作用相关[3]，而受刺激的MC能合成和释放多种介质，诱导MC损伤及增生，最终促发大鼠产生系膜增生性肾炎即ATSN。因此，补体C5b-9复合物是一种大鼠系膜增生性肾炎重要的致病因素。
, 百拇医药
近年来，NO作为一种活性物质在参与肾损伤方面的作用已受到重视[7]。有实验证实，NO过度升高可加重肾小球细胞的继发损伤，致使大鼠产生严重的蛋白尿[1]。由于亚溶解剂量的C5b-9复合物在插入细胞脂质双层后能激活多种信号传导途径，导致某些活性介质释放[8]，故C5b-9复合物能否刺激MC合成多量的NO？反过来应用抗C5b-9复合物抗体可否减少肾组织NO的产生？减轻ATSN病理表现？至今未见报道。本实验结果发现，注射抗鼠C5b-9抗血清的ATSN大鼠即ATSN+Anti-C5b-9组既能减少肾细胞iNOS mRNA的表达及尿液中NO-3/NO-2的排泄量，又能减少肾小球细胞增生数及α-SMA(系膜细胞的增殖指标)的表达。此外，应用NOS抑制剂-L-NAME也可降低尿中NO-3/NO-2的生成，同时减轻肾组织的病变程度。但对肾组织iNOS mRNA的表达不起作用。由此可见：对于iNOS诱生的早期阶段，抗鼠C5b-9复合物抗体能给予阻断，其环节在于抑制大鼠体内刺激性C5b-9复合物的作用。
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过去我们的研究表明，一定剂量的C5b-9复合物能够刺激体外培养的大鼠肾小球MC合成NO[9]，本实验又从另一方面证实罹患ATSN大鼠体内应用抗鼠C5b-9复合物抗体阻止C5b-9复合物刺激后对于肾组织合成NO及病变有显著的抑制性影响。值得一提的是亚溶解剂量的补体C5b-9复合物作用机制较为复杂，它诱导肾细胞iNOS mRNA的表达，提高NO的产量是直接作用，还是间接效应？目前尚不十分清楚，仍须继续深入地进行探索。
[基金项目] 江苏省科委基金资助(BK97154)； 江苏省卫生厅基金资助(H9723)
[参 考 文 献]
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, 百拇医药
[2] Brandt J, Pippin J, Schulze M, et al. Role of the complement membrane attack complex (C5b-9)in mediating expeimental mesangioproliferative glomerulonephritis[J]. Kidney Int,1996, 49:335-343.
[3] Couser WG. Pathogenesis of glomerular damage in glomerulonephritis[J]. Nephrol Dial Transplant,1998, 13 (suppl 1):10-15.
[4] 王迎伟，汤仁仙，赵文君. 人与大鼠补体C5b-9复合物的提取鉴定及相应抗体的制备[J]. 徐州医学院学报，1999, 19(5):353-355.
, 百拇医药 [5] 陈广平，郭慕依，张月娥，等. 大鼠Thy 1抗血清制备及系膜增生性肾炎模型的建立[J]. 临床与实验病理学杂志，1996, 12(3):241-243.
[6] 王迎伟，高丰光，何球藻，等. 诱生性一氧化氮合酶(iNOS) cRNA探针的制备及敏感性检测[J]. 徐州医学院学报，1999, 19: 265-267.
[7] Klahr S. Renal disease: the two faces of nitric oxide[J]. Lab Invest, 1995, 72:1-3.
[8] Niculeseu F, Badea T and Rus H. Sublytic C5b-9 induced proliferation activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase[J]. Atherosclerosis,1999, 142:47-56.
[9] 王迎伟，何球藻，秦慧莲，等. 人补体C5b-9复合物对大鼠肾系膜细胞NO生成的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2000, 16(3):45-48.
[收稿日期] 1999-10-06 [修回日期] 2000-03-17, 百拇医药
单位：王迎伟 高丰光 汤仁仙(徐州医学院免疫教研室， 江苏 徐州221002)；何球藻 秦慧莲(上海医科大学免疫教研室， 上海 200032)
关键词：补体膜攻击复合物；肾小球肾炎，膜增生性；一氧化氮；大鼠
中国病理生理杂志000909 [摘 要] 目的：探讨抗鼠补体C5b-9复合物抗血清对系膜增生性肾炎大鼠肾组织合成一氧化氮(NO)及其病变的作用。方法：复制大鼠系膜增生性肾小球肾炎即抗胸腺细胞血清性肾炎(ATSN)模型，用抗大鼠C5b-9复合物抗血清处理，观察其对ATSN大鼠NO相关指标及其病变的影响。结果：抗鼠C5b-9复合物抗血清既能减少ATSN大鼠肾组织诱生性NO合酶(iNOS)mRNA的表达和大鼠尿液中硝酸盐/亚硝酸盐(NO-3/NO-2)排泄量，还能减低大鼠肾组织病变的程度。NOS抑制剂L-NAME也可降低尿NO-3/NO-3排泄量，同时减轻肾组织病变程度。结论：抗鼠C5b-9复合物抗血清能够抑制肾细胞NO的合成及其肾小球系膜细胞的增生。
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[中图分类号] R692 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)09-0805-04
Effect of antiserum against complement C5b-9 complexes on
nitric oxide(NO) synthesis and pathologic changes
in renal tissue of ATSN rats
WANG Ying-wei, GAO Feng-guang, TANG Ren-xian
(Department of Immunology,Xuzhou Medical college,Xuzhou 221002, China)
, 百拇医药
HE Qiu-zao, QIN Hui-lian
(Department of Immunology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China)
[Abstract] AIM: To explore the effect of antiserum against rat complement C5b-9 complexes on nitric oxide synthesis and pathologic changes in renal tissue of rats with mesangioproliferative glomerulonephritis. METHEDS: The rat model of mesangioproliferative glomerulonephritis,namely,anti-thymocyte serum nephritis(ATSN) was established and the rats with ATSN were treated with antiserum against complement C5b-9 complexes. Some parameters related to NO and pathologic changes of the rats were observed.RESULTS:Anti-C5b-9 serum not only reduced the expression of inducible NO synthase(iNOS) mRNA in renal tissue and urinary content of nitrate/nitrite(NO-3/ NO-2) of rats with ATSN, but also reduced renal pathologic changes. L-NG-nitro arginine methylester (L-NAME) also reduced the contents of urinary NO-3/NO-2 and the renal pathologic changes of rats with ATSN. CONCLUSION:The antiserum against rat complement C5b-9 complexes inhibited glomerular NO synthesis and glomerular mesangial cell proliferation of rats with ATSN.
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[MeSH] Complement membrane attack complex; Glomerulonephritis, membranoproliferative; Nitric oxide;Rats
大鼠抗胸腺细胞血清性肾炎(anti-thymocyte serum nephritis,ATSN)是人类系膜增生性肾炎的动物模型之一[1]。近年来的研究证明：ATSN的病变具有补体依赖性及中性粒细胞非依赖性[2]。亚溶解(sublytic)剂量的补体膜攻击复合体即C5b-9复合物在插入靶细胞膜后能够激活胞内多种代谢途径，致使一些生物活性介质释放，引起炎症病变和增生反应[3]。我们过去的实验已提示，一定量的C5b-9复合物能刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell, MC)合成一氧化氮(nitric oxide,NO)。本文旨在观察体内应用抗鼠C5b-9复合物抗血清处理ATSN大鼠后其肾组织诱生性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS) mRNA的表达、尿液中NO代谢产物——硝酸盐(nitrate, NO-3)和亚硝酸盐(nitrite, NO-2)排泄量及肾小球的病理变化，以了解C5b-9抗血清对ATSN大鼠肾组织NO合成及其病变程度有何影响。
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材 料 和 方 法
一、大鼠血清补体C5b-9复合物的提取及其抗血清的制备 见参考文献[4]。
二、大鼠胸腺细胞的分离及其抗血清的制备 操作方法见文献[5]。
三、大鼠ATSN模型的复制及其分组处理
取正常雌性SD大鼠32只(本实验动物中心提供)，重160-210 g。实验前先行尿蛋白测定，查无异常后随机分成4组，每组8只。(一)ATSN模型组：首次给大鼠尾静脉注射抗胸腺细胞血清(anti-thymocyte serum,ATS) 0.5 mL/100 g体重，然后每隔7 d再给大鼠注射ATS(0.5 mL/100 g)1次，共3次。(二)ATSN+Anti-C5b-9抗血清组：每次给大鼠静脉注射同(一)组的ATS后再静脉注射兔抗鼠C5b-9抗血清(0.5 mL/100 g)。(三)ATSN+L-NAME组：每次给大鼠静脉注射同(一)组的ATS后再静脉追加注射NG-硝基-L-精氨酸甲基酯(L-NG-nitro arginine methylester,L-NAME)，剂量为0.5 mg/100 g体重。(四)对照组：首次给大鼠静脉注射正常兔血清(剂量同ATS)后，每隔7 d再给大鼠注射生理盐水1次。
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四、检测指标
(一)点杂交(Dot-blot)测定肾组织iNOS mRNA的表达与丰度
用TRIZOL试剂(美国GIBCO公司)分别提取各组大鼠实验3、7 d和14 d活检的肾皮质总RNA，然后各取10 μg点在尼龙膜(德国B.M.公司)上，先预杂交42 ℃ 4 h，然后再用地高辛(digoxigenin,DIG)标记的大鼠iNOS cRNA探针[6]杂交，42 ℃ 16 h最后经DIG核苷酸检测试剂盒(B.M.公司)显色观察。
(二)原位杂交检查肾切片iNOS mRNA的表达
实验3 d、14 d取大鼠肾皮质行快速石蜡包埋，并制成7 μm厚切片，切片经梯度乙醇脱水、蛋白酶K(B.M产品)消化及PBS洗涤处理后，用DIG-iNOS cRNA探针进行预杂交、杂交，杂交时间及显示系统材料等均同Dot-blot检测。
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(三)尿液中NO-3/NO-2排泄量的测定
实验3 d、7 d、14 d及28 d分别将各组大鼠置代谢笼内，收集其24 h全部尿液，并测量尿液体积。采用硝酸还原酶法测定各鼠24 h尿液中NO的代谢产物NO-3/NO-2的排泄量，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。结果以nmol/24 h尿液表示。
(四)肾小球内细胞总数的变化
实验3 d、7 d、14 d和28 d活检各组大鼠肾皮质标本制成石腊切片(HE染色)，每个标本每张切片随机计数20个肾小球内细胞数，最后取均值比较。
(五)肾小球内α-SMA的表达
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同上时间活检的各组大鼠肾皮质制成冰冻切片(4 μm厚)后，用单克隆抗平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(DAKO公司)为一抗行ABC法染色检查各鼠肾小球内α-SMA的表达情况。α-SMA半定量分析采用德国MD-20型显微图像分析仪[分辨率：4×面积＝象素点×(0.0025 )2 mm]扫描测定。每张切片上随机取20个肾小球测定其平均积分光密度(OD)值，各组OD值取均数比较。
(六)肾小球系膜区的改变
各组大鼠肾皮质石腊切片HE染色(取材时间同上)标本，显微镜下观察肾小球系膜区细胞数及肾小球系膜区基质等病理变化。
结 果
一、Dot-blot检测肾组织iNOS mRNA的结果
实验3 d、7 d和14d时，ATSN模型组肾组织中均有明显的iNOS mRNA表达，而ATSN+Anti-C5b-9组实验3 d、7 d和14 d时，iNOS mRNA虽有表达，但丰度不如ATSN模型组高。另ATSN+L-NAME组，肾组织iNOS mRNA表达亦较显著，而正常对照组无iNOS mRNA的表达。结果见图1。
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二、原位杂交检测肾细胞iNOS mRNA的表达情况
实验3 d，ATSN模型组肾组织切片显示肾小球系膜细胞有明显的iNOS mRNA表达(图2)，而ATSN+Anti-C5b-9组肾小球系膜细胞表达iNOS mRNA量较少。此外，ATSN+L-NAME组，肾组织切片iNOS mRNA表达亦较明显。对照组无iNOS mRNA的表达。
三、尿液中NO-3/NO-2的排泄总量
实验各阶段，ATSN+Anti-C5b-9组大鼠24 h尿液中NO-3/NO-2排泄量均明显较ATSN组低，具体数据详见表1。
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Fig 1 The expression of renal tissue iNOS mRNA in four groups of rats by Dot-blot.
A. ATSN; B. ATSN+Anti-C5b-9; C. ATSN+L-NAME; D. Control.
图1 点杂交显示4组大鼠肾组织iNOS mRNA的表达
Fig 2 The expression of glomerular cells iNOS mRNA in rats with ATSN at day 3 by in situ hybridization (×100).
图2 原位杂交显示实验3 d时ATSN组大鼠肾小球系膜细胞iNOS mRNA的表达
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Fig 3 The expression of glomerular α-SMA in rats with ATSN at day 3 by immunohistochemistry staining (×400).
图3 免疫组化染色显示实验3 d时ATSN组鼠肾小球中α-SMA的表达
四、肾小球细胞总数的变化
实验各阶段，ATSN+Anti-C5b-9组肾小球内细胞总数明显不如ATSN组高，具体结果见表2。
五、肾小球内α-SMA的表达情况
实验3 d、ATSN组肾小球内可见平滑肌来源的系膜细胞增殖指标-α-SMA的阳性染色，呈束状或分枝状(图3)。显微图像扫描半定量分析结果表明，ATSN+Anti-C5b-9组肾小球内α-SMA的平均OD值明显低于ATSN组。(注：各阶段对照组鼠α-SMA表达呈阴性，其OD值为DAB显色背景的光密度值)。
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表1 4组大鼠24 h尿液中NO-3/NO-2量的变化
Tab 1 The changes of 24 h urinary NO-3/NO-2 content in four groups(
±s. n=8) GroupContent of 24 h urinary NO-3/NO-2(nmol/24 h)
3d
7d
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14d
28d
ATSN
486.79±127.29* *
855.66±133.16* *
978.75±208.77* *
613.75±159.26* *
ATSN+Anti-C5b-9
289.88±111.16△△
398.66±127.33*△△
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450.94±150.78*△△
311.56+131.67△△
ATSN+L-NAME
286.31±143.55△△
305.36±132.57△△
330.94±152.14△△
297.50±135.59△△
Control
252.98± 96.16
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261.02± 76.85
282.81± 96.19
270.31±106.71
*P<0.05，* * P<0.01 vs control group；△△ P<0.01 vs ATSN.表2 4组大鼠肾小球内细胞总数的变化
Tab 2 Changes of cell numbers of glomeruli in four groups(
±s. n=8) GrouopNumbers of cell in glomeruli
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3d
7d
14d
28d
ATSN
65.18±7.75* *
70.56±7.64* *
87.80±11.22* *
89.93±12.95* *
ATSN+Anti-C5b-9
55.29±5.06△△
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63.44±6.81△△
65.20±6.07* *△△
67.79±8.37* *△△
ATSN+L-NAME
57.41±7.11
66.98±6.38* *
74.72±6.31* *△△
77.17±6.54* *△
Control
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53.85±4.43
53.27±4.05
54.12±3.82
* * P<0.01 vs control;△ P<0.05,△△ P<0.01 vs ATSN.表3 4组肾小球内α-SMA平均OD值的变化
Tab 3 Changes of average OD of α-SMA in four groups(
±s. n=8) GroupAverage OD of α-SMA in glomeruli
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3d
7d
14d
28d
ATSN
0.2347±0.0108* *
0.3061±0.0137* *
0.3180±0.0115* *
0.2919±0.0113* *
ATSN+Anti-C5b-9
0.2205±0.0116
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0.2489±0.0123* *△△
0.2600±0.0116* *△△
0.2494±0.0134* *△△
ATSN+L-NAME
0.2246±0.0142*
0.2505±0.0115*△△
0.2782±0.0119* *△△
0.2641±0.0116* *△
Control
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0.2085±0.0089
0.2081±0.0086
0.2099±0.0101
0.2087±0.0079
* P<0.05,* * P<0.01 vs control;△ P<0.05,△△ P<0.01 vs ATSN.
Fig 4 The segmental proliferation of glomerular cells with increased mesangial matrix in rat with ATSN at day 28 by HE staining (×400).
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图4 HE染色显示实验28 d时，ATSN大鼠肾小球系膜细胞呈节段性增生伴系膜基质增多
六、肾小球系膜区的病变
实验3 d时，ATSN组肾小球系膜细胞数已明显升高，以后逐渐增多。实验28 d，肾小球系膜区有节段性增生，系膜区基质显著增加，部分毛细血管袢呈分叶状(图4)。而ATSN+Anti-C5b-9组，系膜区病变显著较ATSN组轻。
讨 论
给大鼠注射ATS后能够激活补体迅速导致MC的溶解坏死[2]。但组织学检查发现，肾小球中部分MC并无明显的溶解反应。有学者认为这些细胞的变化主要与亚溶解剂量的补体C5b-9复合物作用相关[3]，而受刺激的MC能合成和释放多种介质，诱导MC损伤及增生，最终促发大鼠产生系膜增生性肾炎即ATSN。因此，补体C5b-9复合物是一种大鼠系膜增生性肾炎重要的致病因素。
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近年来，NO作为一种活性物质在参与肾损伤方面的作用已受到重视[7]。有实验证实，NO过度升高可加重肾小球细胞的继发损伤，致使大鼠产生严重的蛋白尿[1]。由于亚溶解剂量的C5b-9复合物在插入细胞脂质双层后能激活多种信号传导途径，导致某些活性介质释放[8]，故C5b-9复合物能否刺激MC合成多量的NO？反过来应用抗C5b-9复合物抗体可否减少肾组织NO的产生？减轻ATSN病理表现？至今未见报道。本实验结果发现，注射抗鼠C5b-9抗血清的ATSN大鼠即ATSN+Anti-C5b-9组既能减少肾细胞iNOS mRNA的表达及尿液中NO-3/NO-2的排泄量，又能减少肾小球细胞增生数及α-SMA(系膜细胞的增殖指标)的表达。此外，应用NOS抑制剂-L-NAME也可降低尿中NO-3/NO-2的生成，同时减轻肾组织的病变程度。但对肾组织iNOS mRNA的表达不起作用。由此可见：对于iNOS诱生的早期阶段，抗鼠C5b-9复合物抗体能给予阻断，其环节在于抑制大鼠体内刺激性C5b-9复合物的作用。
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过去我们的研究表明，一定剂量的C5b-9复合物能够刺激体外培养的大鼠肾小球MC合成NO[9]，本实验又从另一方面证实罹患ATSN大鼠体内应用抗鼠C5b-9复合物抗体阻止C5b-9复合物刺激后对于肾组织合成NO及病变有显著的抑制性影响。值得一提的是亚溶解剂量的补体C5b-9复合物作用机制较为复杂，它诱导肾细胞iNOS mRNA的表达，提高NO的产量是直接作用，还是间接效应？目前尚不十分清楚，仍须继续深入地进行探索。
[基金项目] 江苏省科委基金资助(BK97154)； 江苏省卫生厅基金资助(H9723)
[参 考 文 献]
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[2] Brandt J, Pippin J, Schulze M, et al. Role of the complement membrane attack complex (C5b-9)in mediating expeimental mesangioproliferative glomerulonephritis[J]. Kidney Int,1996, 49:335-343.
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[4] 王迎伟，汤仁仙，赵文君. 人与大鼠补体C5b-9复合物的提取鉴定及相应抗体的制备[J]. 徐州医学院学报，1999, 19(5):353-355.
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[收稿日期] 1999-10-06 [修回日期] 2000-03-17, 百拇医药