PCR检测降钙素基因甲基化及其在某些恶性血液病中的意义
作者：王顺清,洪文德,彭爱华,罗绍凯,戴木水，戴丽君
单位：王顺清，广州市第一人民医院血液科(广州,510080)；洪文德,彭爱华,罗绍凯,戴木水，戴丽君 中山医科大学附属第一医院血液科(广州，510080)
关键词：降钙素基因；甲基化；急性非淋巴细胞白血病；骨髓增生异常综和征；慢性粒细胞白血病；
癌症990615
【摘要】目的：探讨急性非淋巴细胞白血病(acute non lymphoblastic leukecia,ANLL)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)和慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者降钙素基因(calcitoningene,CT基因)甲基化状况及其意义。方法：利用限制性内切酶和多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术。结果：72%(18/25)的ANLL和60%(6/10)的MDS患者有CT基因高度甲基化，在CML慢性期CT基因甲基化阳性率为23.8%(5/21)，而急变期阳性率为80%(8/10)，两者之间有显著性差异，系列稀释法发现本试验敏感性至少达10-3水平。结论：CT基因高度甲基化较广泛地存在于ANLL、MDS和CML急变期，是ANLL和MDS患者白血病细胞克隆以及CML进展和急变的一个共同的分子标志，而且CT基因高度甲基化与MDS的转归和预后可能有一定关系。
, 百拇医药
中图分类号：R730.263 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0677-03
Detection of the hypermethylation of calcitonin gene by polymerase chain reaction and its implication in some hematological malignancies
WANG Shun-qing*，HONG Wen-de，PENG Ai-hua，et al.
*Department of Hematology，Guangzhuo First Municipal People’s Hospital，Guangzhou 510180，P.R.China
【Abstract】 Objective：To study the methylation pattern of calcitonin gene (CT gene) in acute nonlymphoblastic leukemia (ANLL)，myelodysplastic syndrome (MDS) and chronic myeloid leukemia (CML) and its implication.Methods：Restriction endonuclease and polymerase chain reaction (PCR) techniques were used.Results：The hypermethylation pattern was found in 72% (18/25) of ANLL and 60% (6/10) of MDS patients.In CML，23.8% (5/21) samples in chronic phase and 80% (8/10) samples in blast crisis were positive (P<0.05).And the sensitivity of this method was at least 3 logs (1 in 1000).Conclusion：This findings indicated that the hypermethylation of CT gene was a common molecular marker for the tumor cells in ANLL，MDS and the progression and blast crisis of CML.The hypermethylation of CT gene might be associated with the transformation to increase blastic cells in MDS and might have prognostic value in MDS.
, http://www.100md.com
Key words：Calcitonin gene;Methylation;Acute nonlymphoblastic leukemia; Myelodysplastic syndrome;Chronic myeloid leukemia
降钙素基因(Calcitoningene，CT基因)位于染色体11p15，长约39kb。近来发现其5'端CCGG位点的高度甲基化与人类小细胞肺癌、结肠癌、淋巴瘤以及白血病等恶性疾病有密切关系，被认为是不少恶性细胞克隆的一个共同的分子标志〔1〕。我们利用限制性内切酶和多聚酶链反应(polymerose chainreaction,PCR)技术检测了急性非淋巴细胞白血病(acute non lymphoblastic leukemia,ANLL)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)和慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者CT基因甲基化状况，以探讨CT基因甲基化与这些恶性血液病的关系及其临床意义。
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1材料和方法
1.1研究对象
66例恶性血液病患者均经过临床、外周血象、骨髓象及组织化学染色确诊，其中，ANLL25例，MDS10例，CML31例(包括慢性期21例，急变期10例)。此外，以10例胸外科非恶性疾病手术切除的肋骨中提取的骨髓(5例)和非恶性血液病性贫血患者的骨髓(5例)为对照组。取骨髓3ml或外周血5ml，EDTA抗凝，淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。阳性对照为白血病细胞系K562和HL60。
1.2DNA提取和酶切
用常规的酚/氯仿法抽提上述单个核细胞的大分子量DNA，取DNA1μg，加内切酶HpaⅡ(Gibco公司)10u，37℃水浴16小时以上。
1.3PCR扩增及结果观察
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参照文献〔2〕设计跨越CT基因第4个CCGG甲基化位点(M4)的一对引物，有义链为5'-CCTCTGATCCAAGCCACCTC-3'，反义链为5'-CGCCTGCTGGCACCTCAGTC-3'。按文献〔2〕建立PCR反应体系，酶切后DNA100ng用于PCR扩增，循环条件为：94℃变性，55℃退火，72℃延伸各1分钟，总共35个循环，末次延伸10分钟。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外透射反射仪下观察、照相，用λDNA-EcoRⅠ/HindⅢ作为分子量参照物。
1.4PCR产物半定量分析
参考文献〔2〕，引用竞争性PCR的概念，将所扩增出的一条639bp非特异性带看作内对照，对扩增产物作半定量处理：照相后负片用密度仪扫描，分别测定所扩增出的566bp特异性带和639bp非特异性带的吸光度A，计算出这两条带的吸光度比值(A566/A639)，将比值大于或等于1者定为阳性，即有CT基因高度甲基化，小于1者定为阴性，即无CT基因高度甲基化。
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1.5系列稀释法测定本实验敏感性
用正常骨髓DNA按10倍比例系列稀释HL60细胞DNA，然后取各稀释度DNA1μg(从纯的HL60细胞DNA1μg，即100起)，按前述的条件进行酶切、PCR扩增及结果观察。
2结果
2.1ANLL
按上述标准，正常骨髓及非恶性贫血患者全部阴性，无CT基因高度甲基化;25例ANLL患者中18例阳性，阳性率72%。实验敏感性的测定结果显示在10-3稀释度仍可见明显的566bp带，其A566/A639大于1.0，从10-4开始，A566/A639小于1.0，提示本实验敏感性至少在10-3水平，即至少能检测出1/1000有CT基因甲基化的白血病细胞。图1示部分ANLL病人PCR产物电泳分析，图2为实验敏感性分析结果。
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图1 部分为ANLL病人PCR产物电泳
1阴性对照 2,3为ANLL
4为阳性对照 5为Marker
A566/A639依次为:0.45 0.34 2.55 1.93
图2 系列稀释法测定实验敏感性
1 为阳性对照 7 为 HL60,即 100
A566/A639依次为:0.11 0.19 0.34 1.20
1.574.277.66
2.2MDS
, 百拇医药
10例MDS患者6例阳性，阳性率60%。复习病史及追踪观察发现，4例阴性患者除1例RAEB-t者经积极治疗，全血细胞减少进行性加重，较快死亡外，其余2例RA型和1例CMML型患者治疗后一直处于缓解状态已达1年以上;相反，6例阳性患者疗效差，1例CMML患者治疗3个月无好转而自动出院，另5例在3～6个月内，外周血及骨髓中幼稚细胞进行性增多，由RA向RAEB、RAEB-t及白血病方向进展，其中3例转变成白血病后很快死亡。
2.3CML
21例CML慢性期患者5例阳性，阳性率23.81%，10例急变期病人8例阳性，阳性率达80%，两者之间有显著性差异(P<0.01)。追踪观察5例慢性期即呈阳性的患者，1例失访，另4例分别在检测后2，5，6和14个月发生急变。
3讨论
3.1ANLL的CT基因甲基化检测及其意义
, 百拇医药
白血病缓解后的微小残留病(micro-residual disease,MRD)是其日后复发的根源，PCR技术已被广泛地应用于MRD的检测，以利于预测早期复发、指导适当的治疗。ANLL除M3和M2b外，其它更多亚型因无特异性分子标志无法检测MRD，我们的实验发现CT基因高度甲基化广泛存在ANLL(72%)，因此可作为ANLL白血病细胞克隆的一个的分子标志，本实验的敏感性至少达10-3水平，可用于ANLL患者治疗后MRD检测，特别是适用于ANLL中目前仍没有很好分子标志的亚型。
3.2MDS的CT基因甲基化检测及其意义
实验证明CT基因高度甲基化出现在细胞恶性转化之前或开始向恶性转化的早期〔3，4〕，它与恶性细胞的发生、发展密切相关。我们的实验发现，10例MDS患者6例(60%)出现CT基因甲基化这一恶性细胞克隆的分子标志。病历资料分析和追踪观察又发现，本实验中4例阴性的MDS患者除1例治疗反应差并很快死亡外，其余3例疗效满意，病情稳定，而6例阳性的患者治疗效果差，病情很快恶化甚至死亡，这一现象提示CT基因高度甲基化与MDS的恶性转化及预后可能有一定关系。
, 百拇医药
3.3CML的CT基因甲基化检测及其意义
我们的研究表明大多数慢性期CML患者(76.2%)未发现有CT基因高度甲基化，而在急变期有80%出现了甲基化，这与文献〔5，6〕报道很相似，提示CT基因的甲基化与CML的进展、急变密切相关，可作为CML进展的一个分子标志。我们追踪观察，发现4例CT基因甲基化阳性的慢性期患者分别于检测后2～14(平均6.75)个月发生急变，Malinen等〔6〕通过大量追踪观察也发现甲基化往往出现在CML由慢性期向加速期或急变期转化的过程中，认为检测CT基因甲基化可以比临床表现或细胞形态学改变大约提前6个月左右发现CML的进展(加速期或急变)，因此检测CT基因的甲基化可用以监测CML的进展，预测急变的发生，以指导积极的治疗。
〔参考文献〕
〔1〕王顺清，洪文德.降钙素基因高度甲基化─恶性细胞克隆的一个分子标志〔J〕.白血病，1995，5(增刊)：50～51.
, 百拇医药
〔2〕Fukuhara T，Hooper WC，Baylin SB，et al.Use of the polymerase chain reaction to detect hypermethylation in the calcitonin gene.A new，sensitive approach to monitor tumor cells in acute myelogenous leukemia〔J〕.Leuk Res，1992，16：1031～1040.
〔3〕Baylin SB，Fearon ER，Vogelstein B，et al.Hypermethylation of the 5'region of the calcitonin gene is a property of human lymphoid and acute myeloid malignancies 〔J〕. Blood，1987，70(2)：412～417.
〔4〕De Bustros，Nelkin BD，Silverman A，et al.The short arm of chromosome 11 is a“ hot Spot ”for hypermethylation in human neoplasia〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1988，85：5693～5697.
, 百拇医药
〔5〕Nelkin BD，Przepiorka D，Burke PJ，et al.Abnormal methylation of the calcitonin gene marks progression of chronic myelogenous leukemia〔J〕.Blood，1991，77：2431～2434.
〔6〕Malinen T，Palotie A，Pakkala S，et al.Acceleration of chronic myeloid leukemia correlates with calcitonin gene hypermethylation〔J〕.Blood，1991，77：2435～2440.
收稿日期：1999-04-22；修回日期：1999-06-15, 百拇医药
单位：王顺清，广州市第一人民医院血液科(广州,510080)；洪文德,彭爱华,罗绍凯,戴木水，戴丽君 中山医科大学附属第一医院血液科(广州，510080)
关键词：降钙素基因；甲基化；急性非淋巴细胞白血病；骨髓增生异常综和征；慢性粒细胞白血病；
癌症990615
【摘要】目的：探讨急性非淋巴细胞白血病(acute non lymphoblastic leukecia,ANLL)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)和慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者降钙素基因(calcitoningene,CT基因)甲基化状况及其意义。方法：利用限制性内切酶和多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术。结果：72%(18/25)的ANLL和60%(6/10)的MDS患者有CT基因高度甲基化，在CML慢性期CT基因甲基化阳性率为23.8%(5/21)，而急变期阳性率为80%(8/10)，两者之间有显著性差异，系列稀释法发现本试验敏感性至少达10-3水平。结论：CT基因高度甲基化较广泛地存在于ANLL、MDS和CML急变期，是ANLL和MDS患者白血病细胞克隆以及CML进展和急变的一个共同的分子标志，而且CT基因高度甲基化与MDS的转归和预后可能有一定关系。
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中图分类号：R730.263 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)06-0677-03
Detection of the hypermethylation of calcitonin gene by polymerase chain reaction and its implication in some hematological malignancies
WANG Shun-qing*，HONG Wen-de，PENG Ai-hua，et al.
*Department of Hematology，Guangzhuo First Municipal People’s Hospital，Guangzhou 510180，P.R.China
【Abstract】 Objective：To study the methylation pattern of calcitonin gene (CT gene) in acute nonlymphoblastic leukemia (ANLL)，myelodysplastic syndrome (MDS) and chronic myeloid leukemia (CML) and its implication.Methods：Restriction endonuclease and polymerase chain reaction (PCR) techniques were used.Results：The hypermethylation pattern was found in 72% (18/25) of ANLL and 60% (6/10) of MDS patients.In CML，23.8% (5/21) samples in chronic phase and 80% (8/10) samples in blast crisis were positive (P<0.05).And the sensitivity of this method was at least 3 logs (1 in 1000).Conclusion：This findings indicated that the hypermethylation of CT gene was a common molecular marker for the tumor cells in ANLL，MDS and the progression and blast crisis of CML.The hypermethylation of CT gene might be associated with the transformation to increase blastic cells in MDS and might have prognostic value in MDS.
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Key words：Calcitonin gene;Methylation;Acute nonlymphoblastic leukemia; Myelodysplastic syndrome;Chronic myeloid leukemia
降钙素基因(Calcitoningene，CT基因)位于染色体11p15，长约39kb。近来发现其5'端CCGG位点的高度甲基化与人类小细胞肺癌、结肠癌、淋巴瘤以及白血病等恶性疾病有密切关系，被认为是不少恶性细胞克隆的一个共同的分子标志〔1〕。我们利用限制性内切酶和多聚酶链反应(polymerose chainreaction,PCR)技术检测了急性非淋巴细胞白血病(acute non lymphoblastic leukemia,ANLL)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)和慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者CT基因甲基化状况，以探讨CT基因甲基化与这些恶性血液病的关系及其临床意义。
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1材料和方法
1.1研究对象
66例恶性血液病患者均经过临床、外周血象、骨髓象及组织化学染色确诊，其中，ANLL25例，MDS10例，CML31例(包括慢性期21例，急变期10例)。此外，以10例胸外科非恶性疾病手术切除的肋骨中提取的骨髓(5例)和非恶性血液病性贫血患者的骨髓(5例)为对照组。取骨髓3ml或外周血5ml，EDTA抗凝，淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。阳性对照为白血病细胞系K562和HL60。
1.2DNA提取和酶切
用常规的酚/氯仿法抽提上述单个核细胞的大分子量DNA，取DNA1μg，加内切酶HpaⅡ(Gibco公司)10u，37℃水浴16小时以上。
1.3PCR扩增及结果观察
, http://www.100md.com
参照文献〔2〕设计跨越CT基因第4个CCGG甲基化位点(M4)的一对引物，有义链为5'-CCTCTGATCCAAGCCACCTC-3'，反义链为5'-CGCCTGCTGGCACCTCAGTC-3'。按文献〔2〕建立PCR反应体系，酶切后DNA100ng用于PCR扩增，循环条件为：94℃变性，55℃退火，72℃延伸各1分钟，总共35个循环，末次延伸10分钟。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外透射反射仪下观察、照相，用λDNA-EcoRⅠ/HindⅢ作为分子量参照物。
1.4PCR产物半定量分析
参考文献〔2〕，引用竞争性PCR的概念，将所扩增出的一条639bp非特异性带看作内对照，对扩增产物作半定量处理：照相后负片用密度仪扫描，分别测定所扩增出的566bp特异性带和639bp非特异性带的吸光度A，计算出这两条带的吸光度比值(A566/A639)，将比值大于或等于1者定为阳性，即有CT基因高度甲基化，小于1者定为阴性，即无CT基因高度甲基化。
, http://www.100md.com
1.5系列稀释法测定本实验敏感性
用正常骨髓DNA按10倍比例系列稀释HL60细胞DNA，然后取各稀释度DNA1μg(从纯的HL60细胞DNA1μg，即100起)，按前述的条件进行酶切、PCR扩增及结果观察。
2结果
2.1ANLL
按上述标准，正常骨髓及非恶性贫血患者全部阴性，无CT基因高度甲基化;25例ANLL患者中18例阳性，阳性率72%。实验敏感性的测定结果显示在10-3稀释度仍可见明显的566bp带，其A566/A639大于1.0，从10-4开始，A566/A639小于1.0，提示本实验敏感性至少在10-3水平，即至少能检测出1/1000有CT基因甲基化的白血病细胞。图1示部分ANLL病人PCR产物电泳分析，图2为实验敏感性分析结果。
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图1 部分为ANLL病人PCR产物电泳
1阴性对照 2,3为ANLL
4为阳性对照 5为Marker
A566/A639依次为:0.45 0.34 2.55 1.93
图2 系列稀释法测定实验敏感性
1 为阳性对照 7 为 HL60,即 100
A566/A639依次为:0.11 0.19 0.34 1.20
1.574.277.66
2.2MDS
, 百拇医药
10例MDS患者6例阳性，阳性率60%。复习病史及追踪观察发现，4例阴性患者除1例RAEB-t者经积极治疗，全血细胞减少进行性加重，较快死亡外，其余2例RA型和1例CMML型患者治疗后一直处于缓解状态已达1年以上;相反，6例阳性患者疗效差，1例CMML患者治疗3个月无好转而自动出院，另5例在3～6个月内，外周血及骨髓中幼稚细胞进行性增多，由RA向RAEB、RAEB-t及白血病方向进展，其中3例转变成白血病后很快死亡。
2.3CML
21例CML慢性期患者5例阳性，阳性率23.81%，10例急变期病人8例阳性，阳性率达80%，两者之间有显著性差异(P<0.01)。追踪观察5例慢性期即呈阳性的患者，1例失访，另4例分别在检测后2，5，6和14个月发生急变。
3讨论
3.1ANLL的CT基因甲基化检测及其意义
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白血病缓解后的微小残留病(micro-residual disease,MRD)是其日后复发的根源，PCR技术已被广泛地应用于MRD的检测，以利于预测早期复发、指导适当的治疗。ANLL除M3和M2b外，其它更多亚型因无特异性分子标志无法检测MRD，我们的实验发现CT基因高度甲基化广泛存在ANLL(72%)，因此可作为ANLL白血病细胞克隆的一个的分子标志，本实验的敏感性至少达10-3水平，可用于ANLL患者治疗后MRD检测，特别是适用于ANLL中目前仍没有很好分子标志的亚型。
3.2MDS的CT基因甲基化检测及其意义
实验证明CT基因高度甲基化出现在细胞恶性转化之前或开始向恶性转化的早期〔3，4〕，它与恶性细胞的发生、发展密切相关。我们的实验发现，10例MDS患者6例(60%)出现CT基因甲基化这一恶性细胞克隆的分子标志。病历资料分析和追踪观察又发现，本实验中4例阴性的MDS患者除1例治疗反应差并很快死亡外，其余3例疗效满意，病情稳定，而6例阳性的患者治疗效果差，病情很快恶化甚至死亡，这一现象提示CT基因高度甲基化与MDS的恶性转化及预后可能有一定关系。
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3.3CML的CT基因甲基化检测及其意义
我们的研究表明大多数慢性期CML患者(76.2%)未发现有CT基因高度甲基化，而在急变期有80%出现了甲基化，这与文献〔5，6〕报道很相似，提示CT基因的甲基化与CML的进展、急变密切相关，可作为CML进展的一个分子标志。我们追踪观察，发现4例CT基因甲基化阳性的慢性期患者分别于检测后2～14(平均6.75)个月发生急变，Malinen等〔6〕通过大量追踪观察也发现甲基化往往出现在CML由慢性期向加速期或急变期转化的过程中，认为检测CT基因甲基化可以比临床表现或细胞形态学改变大约提前6个月左右发现CML的进展(加速期或急变)，因此检测CT基因的甲基化可用以监测CML的进展，预测急变的发生，以指导积极的治疗。
〔参考文献〕
〔1〕王顺清，洪文德.降钙素基因高度甲基化─恶性细胞克隆的一个分子标志〔J〕.白血病，1995，5(增刊)：50～51.
, 百拇医药
〔2〕Fukuhara T，Hooper WC，Baylin SB，et al.Use of the polymerase chain reaction to detect hypermethylation in the calcitonin gene.A new，sensitive approach to monitor tumor cells in acute myelogenous leukemia〔J〕.Leuk Res，1992，16：1031～1040.
〔3〕Baylin SB，Fearon ER，Vogelstein B，et al.Hypermethylation of the 5'region of the calcitonin gene is a property of human lymphoid and acute myeloid malignancies 〔J〕. Blood，1987，70(2)：412～417.
〔4〕De Bustros，Nelkin BD，Silverman A，et al.The short arm of chromosome 11 is a“ hot Spot ”for hypermethylation in human neoplasia〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1988，85：5693～5697.
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〔5〕Nelkin BD，Przepiorka D，Burke PJ，et al.Abnormal methylation of the calcitonin gene marks progression of chronic myelogenous leukemia〔J〕.Blood，1991，77：2431～2434.
〔6〕Malinen T，Palotie A，Pakkala S，et al.Acceleration of chronic myeloid leukemia correlates with calcitonin gene hypermethylation〔J〕.Blood，1991，77：2435～2440.
收稿日期：1999-04-22；修回日期：1999-06-15, 百拇医药