WT1基因在恶性血液病中的表达及临床意义
作者：钱思轩 朱广荣 夏薇 盛瑞兰
单位：(210029南京医科大学第一附属医院血液科)
关键词：恶性血液病；WT1基因；微小残留病
江苏医药001018 【摘要】 目的 探讨WT1基因mRNA表达与恶性血液病的关系及意义。方法 应用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)测定141例不同类型恶性血液病患者和10名正常人外周血WT1基因的表达。结果 69.9%急性白血病(AL)WT1表达阳性，其中急性髓系白血病(AML)65.2%，急性淋巴细胞白血病(ALL)77.8%；40.0%慢性粒细胞白血病(CML)WT1表达阳性，其中7例急变者全部为阳性；2例骨髓增生异常综合征(MDS)-RAEBT WT1表达阳性；非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)均为低表达；3例MDS-RA，10名正常人WT1表达阴性。结论 WT1基因在各类型白血病、MDS中均能表达，表达水平与体内白血病细胞的数量、病程进展等相关。可作为化疗和骨髓移植后微小残留病检测的敏感指标，也是研究白血病、MDS发病、发展和预测预后的手段。
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WT1基因(Wilms tumor gene)是从Wilms瘤细胞的染色体11p13位分离出来的肿瘤抑制基因，是调控造血细胞增殖和/或分化基因的转录抑制剂，在恶性血液系统疾病的发生中可能起重要作用[1，2]。近年来国内外研究表明WT1基因在各类白血病的发生、发展及预后中起一定作用，我们采用RT-PCR方法对AL、CML、NHL、MM及MDS患者进行了WT1基因检测，并探讨其临床意义。
材料与方法
一、材料
141例恶性血液病均为我院住院或门诊病人，诊断、分期按文献标准[3]。男86例，女55例，中位年龄40(3～78)岁。AL73例，其中急性非淋巴细胞白血病(ANLL)46例，初治39例，复发7例；ALL27例，初治25例，复发2例。CML30例，其中慢性期及加速期23例，急变期7例。NHL21例(Ⅰ、Ⅱ期11例，Ⅲ、Ⅳ期10例)。MM12例(Ⅰ、Ⅱ期5例，Ⅲ期7例)。MDS 5例(RA 3例，RAEB-T2例)。10名正常人外周血作为对照，K562(慢粒急性红白血病病变细胞系)细胞作为阳性对照。
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二、方法
1.单个核细胞(MNC)的分离及总RNA的提取：患者或正常人骨髓2ml或外周血5～8ml，肝素抗凝。经淋巴细胞分离液(Ficoll，相对密度1.077)分离，采用美国GIBCO公司的TNZOL一步法提取细胞总RNA。紫外分光光度仪测定RNA的量。
2.cDNA合成及PCR扩增：(1)引物由美国GIBCO公司合成。WT1引物包括7～10个外显子编码的锌指结构区域[2]。上游引物：5-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3；下游引物：5-GAGAGT-CAGACTTGAAAGCAGT-3.扩增产物的长度为481bp。(2)取1μg总RNA，65℃加热5分钟，加入5×RT缓冲液10μl，RNasin80U，4种dNTP(10mmol/L)混和液10μl，3′端引物1μl，AMV10U，总体积50μl。42℃反应60分钟，96℃5分钟，迅速置-20℃备用。(3)PCR取cDNA5μl依次加入10×缓冲液2.5μl，4种dNTP2μl，20pmol的WT1引物，Taq酶IU，25mmol/L MgCl22μl，总体积25μl。扩增条件：94℃变性1分钟，64℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共34个周期。
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3.PCR产物分析：取PCR产物5μl，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳(含0.5μg/ml溴化乙锭)50分钟，紫外透射仪下观察结果并照相。
4.统计学分析：采用χ2检验
结果
一、恶性血液病WT1mRNA的基础表达：WT1mRNA表达阳性在AL中占69.9%(51/73)，初发AL中67.2%(43/64)，复发AL中88.9%(8/9)；在CML急变期、MDS-RAEBT中均为100%，明显高于CML慢性及加速期(22%)和MDS-RA(0)；NHL和MM疾病任何阶段其表达率均明显低下。见表1。
二、WT1与AML亚型的关系：WT1在AML各亚型中都能表达，?其中4/6(66.7%)M1、?11/12(91.7%)M2、11/19(57.9%)M3WT1表达阳性；M4～M7的患者亦有阳性表达，但病例数尚少故需做更多的研究。表1 正常人与141例恶性血液病患者诊断、分期及WT1的表达 对象
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例数
WT1表达阳性
正常对照
10
0
AML
初发
39
24
复发
7
6
ALL
, http://www.100md.com 初发
25
19
复发
2
2
CML
慢性及加速期
23
5
急变期
7
7
NHL
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Ⅰ、Ⅱ期
11
0
Ⅲ期
10
1
MM
Ⅰ、Ⅱ期
5
0
Ⅲ期
7
1
MDS
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RA
3
0
RAEB-T
2
2
三、WT1与白血病病程的关系：AL治疗前WT1表达阳性的15例患者，经治疗后检测WT1转为阴性，同时行骨髓检查，其中11例达完全缓解(CR)，2例已达部分缓解(PR)，另2例经治疗后骨髓初为CR时WT1表达仍为阳性，但经多次强化治疗后WT1表达逐渐减弱至阴性。7例AL治疗前后WT1表达持续阴性；5例AL CR时WT1阴性，复发后则转为阳性，再化疗后又有3例WT1表达转为阴性。1例ALL WT1表达阳性，而此时临床、骨髓尚处于CR期，2周后该患者临床、骨髓才提示复发。1例CML在加速期WT1表达阴性，急变时WT1表达阳性。
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四、RT-PCR检测WT1的灵敏性：取表达阳性的K562细胞与正常人外周血MNC按1∶10，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105，1∶106倍比稀释，然后用RT-PCR测定WT1mRNA，结果显示测定的灵敏性为10-4～10-5。讨论
WT1基因是Wilms′瘤的易感基因，其在造血系统中起着一定的作用。有学者研究发现WT1基因有两种功能，即肿瘤抑制基因和促癌基因，而在白血病中，它的促癌基因作用大于肿瘤抑制基因功能，且在白血病的发生、发展中起重要作用[4]。
本文研究发现WT1基因在AML和ALL中均有高表达，分别为65.2%和77.8%，而复发型AL的表达率(88.9%)明显高于初治型AL(67.2%)；在CML的急变期WT1的表达率(100%)要明显高于慢性及加速期(21.7%)；MDS WT1的表达与其疾病阶段密切相关，即在白血病前期WT1为高表达，而NHL、MM的任何疾病阶段WT1的表达均低下，并与正常对照组无显著性差异(P>0.05)，上述结果与国内外文献报道相一致[4～6，8]。有学者认为在AML中，M0、M1、M2、M3WT1高表达，而M4、M5表达较低；本组发现在M1、M2、M3尤其M1、M2有较高表达，其余类型AML因例数相对较少而需进一步研究探讨，而10名正常人未检测到WT1基因。从这些研究结果可以看出：淋系、髓系白血病及MDS，WT1表达水平与不成熟白血病细胞的量有关，并随细胞的分化成熟逐渐降低，而NHL、MM均起源于较后期的淋巴细胞，故其WT1呈低表达。
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准确、敏感地检测白血病患者微小残瘤病(MRD)对于治疗具有重要价值。有学者报道[5，7～9]，利用WT1进行MRD检测可以比临床提前4～32周预测复发。本文对15例治疗前WT1基因表达阳性的患者进行了动态观察，发现治疗后骨髓达CR时11例WT1表达转为阴性，2例表达有明显下降，再经多次化疗WT1转为阴性，另2例骨髓达PR时，WT1就转为阴性。同时我们还观察到7例治疗前WT1阴性的患者，化疗后仍为阴性；5例复发前WT1表达阴性，复发后又转为阳性，3例经再化疗达CR时WT1又转为阴性；1例临床、骨髓仍提示缓解而WT1表达阳性的患者，2周后临床、骨髓提示复发；1例CML加速期WT1表达阴性，急变期转为阳性。
本文应用RT-PCR检测WT1基因表达，其检测敏感性达10-4水平，故WT1可作为判断预后及监测MRD的敏感指标[4，8]。而对于MDS，动态监测WT1的表达具有更重要意义，Tamaki等[4]认为MDS的患者如WT1的表达从阴性转为阳性，则提示6个月内MDS即将转为AL，应尽可能早些行骨髓移植治疗，而CML慢性与加速期WT1表达阳性者更需要密切观察其疾病的演变。
, 百拇医药
综上所述，检测WT1表达对研究白血病、MDS的发生发展及监测MRD和判断白血病病人预后、预测疾病进展、制定个体化疗方案及其化疗与骨髓移植治疗后疗效的随访观察等均有重要作用。
参考文献
1，Hewitt SM，Monares A，Kotickal L，et al.Regulation of the proncogenes bal-2 and c-myc by the Wilms tumor supressor gene WT1.Cancer Res，1995，55：5386-5389.
2，Baird PN，Simmons PJ.Exprsssion of the Wilms tumor gene in normal hematopoiesis.Exp-Hematol，1997，25：312-320.
3，张之南，沈悌，主编.血液病诊断及疗效标准.北京：科学出版社，1998，168-381.
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4，Tamaki H，Ogawa H，ohyashiki K，et al.The Wilms tumor gene WT1 is a good marker for diagnosis of disease progression of myelodysplastic syndromes.Leukemia，1999，13：393-399.
5，Inoue K，Sugiyama H，Ogawa H，et al.WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia.Blood，1994，84：3071-3079.
6，郭晓楠，徐世荣，董作仁，等.白血病患者WT1基因的表达及其与预后及多药耐药的关系.中华血液学杂志，1999，20：69-72.
, 百拇医药
7，Sugiyama H，Wilms tumor gene as a new marker for the detection of minimal residual disease in leukemia.Leuk-lymphone，1998，30：55-61.
8，Hosoya N，Miyagawa K，Mitani K，et al.Mutation analysis of the WT1 gene in myelodysplastic syndromes.Jan J Cancer Res 1998，89：821-824.
9，Inoue K，Ogawa H，Yamagami T，et al.Long-term follow-up of minimal residual disease in leukemia patients by monitoring WT1 expression levels.Blood，1996，88：2267-2268.
收稿：1999-11-25
修回：2000-03-06, 百拇医药
单位：(210029南京医科大学第一附属医院血液科)
关键词：恶性血液病；WT1基因；微小残留病
江苏医药001018 【摘要】 目的 探讨WT1基因mRNA表达与恶性血液病的关系及意义。方法 应用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)测定141例不同类型恶性血液病患者和10名正常人外周血WT1基因的表达。结果 69.9%急性白血病(AL)WT1表达阳性，其中急性髓系白血病(AML)65.2%，急性淋巴细胞白血病(ALL)77.8%；40.0%慢性粒细胞白血病(CML)WT1表达阳性，其中7例急变者全部为阳性；2例骨髓增生异常综合征(MDS)-RAEBT WT1表达阳性；非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)均为低表达；3例MDS-RA，10名正常人WT1表达阴性。结论 WT1基因在各类型白血病、MDS中均能表达，表达水平与体内白血病细胞的数量、病程进展等相关。可作为化疗和骨髓移植后微小残留病检测的敏感指标，也是研究白血病、MDS发病、发展和预测预后的手段。
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WT1基因(Wilms tumor gene)是从Wilms瘤细胞的染色体11p13位分离出来的肿瘤抑制基因，是调控造血细胞增殖和/或分化基因的转录抑制剂，在恶性血液系统疾病的发生中可能起重要作用[1，2]。近年来国内外研究表明WT1基因在各类白血病的发生、发展及预后中起一定作用，我们采用RT-PCR方法对AL、CML、NHL、MM及MDS患者进行了WT1基因检测，并探讨其临床意义。
材料与方法
一、材料
141例恶性血液病均为我院住院或门诊病人，诊断、分期按文献标准[3]。男86例，女55例，中位年龄40(3～78)岁。AL73例，其中急性非淋巴细胞白血病(ANLL)46例，初治39例，复发7例；ALL27例，初治25例，复发2例。CML30例，其中慢性期及加速期23例，急变期7例。NHL21例(Ⅰ、Ⅱ期11例，Ⅲ、Ⅳ期10例)。MM12例(Ⅰ、Ⅱ期5例，Ⅲ期7例)。MDS 5例(RA 3例，RAEB-T2例)。10名正常人外周血作为对照，K562(慢粒急性红白血病病变细胞系)细胞作为阳性对照。
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二、方法
1.单个核细胞(MNC)的分离及总RNA的提取：患者或正常人骨髓2ml或外周血5～8ml，肝素抗凝。经淋巴细胞分离液(Ficoll，相对密度1.077)分离，采用美国GIBCO公司的TNZOL一步法提取细胞总RNA。紫外分光光度仪测定RNA的量。
2.cDNA合成及PCR扩增：(1)引物由美国GIBCO公司合成。WT1引物包括7～10个外显子编码的锌指结构区域[2]。上游引物：5-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3；下游引物：5-GAGAGT-CAGACTTGAAAGCAGT-3.扩增产物的长度为481bp。(2)取1μg总RNA，65℃加热5分钟，加入5×RT缓冲液10μl，RNasin80U，4种dNTP(10mmol/L)混和液10μl，3′端引物1μl，AMV10U，总体积50μl。42℃反应60分钟，96℃5分钟，迅速置-20℃备用。(3)PCR取cDNA5μl依次加入10×缓冲液2.5μl，4种dNTP2μl，20pmol的WT1引物，Taq酶IU，25mmol/L MgCl22μl，总体积25μl。扩增条件：94℃变性1分钟，64℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共34个周期。
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3.PCR产物分析：取PCR产物5μl，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳(含0.5μg/ml溴化乙锭)50分钟，紫外透射仪下观察结果并照相。
4.统计学分析：采用χ2检验
结果
一、恶性血液病WT1mRNA的基础表达：WT1mRNA表达阳性在AL中占69.9%(51/73)，初发AL中67.2%(43/64)，复发AL中88.9%(8/9)；在CML急变期、MDS-RAEBT中均为100%，明显高于CML慢性及加速期(22%)和MDS-RA(0)；NHL和MM疾病任何阶段其表达率均明显低下。见表1。
二、WT1与AML亚型的关系：WT1在AML各亚型中都能表达，?其中4/6(66.7%)M1、?11/12(91.7%)M2、11/19(57.9%)M3WT1表达阳性；M4～M7的患者亦有阳性表达，但病例数尚少故需做更多的研究。表1 正常人与141例恶性血液病患者诊断、分期及WT1的表达 对象
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例数
WT1表达阳性
正常对照
10
0
AML
初发
39
24
复发
7
6
ALL
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25
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复发
2
2
CML
慢性及加速期
23
5
急变期
7
7
NHL
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Ⅰ、Ⅱ期
11
0
Ⅲ期
10
1
MM
Ⅰ、Ⅱ期
5
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Ⅲ期
7
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MDS
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RA
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RAEB-T
2
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三、WT1与白血病病程的关系：AL治疗前WT1表达阳性的15例患者，经治疗后检测WT1转为阴性，同时行骨髓检查，其中11例达完全缓解(CR)，2例已达部分缓解(PR)，另2例经治疗后骨髓初为CR时WT1表达仍为阳性，但经多次强化治疗后WT1表达逐渐减弱至阴性。7例AL治疗前后WT1表达持续阴性；5例AL CR时WT1阴性，复发后则转为阳性，再化疗后又有3例WT1表达转为阴性。1例ALL WT1表达阳性，而此时临床、骨髓尚处于CR期，2周后该患者临床、骨髓才提示复发。1例CML在加速期WT1表达阴性，急变时WT1表达阳性。
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四、RT-PCR检测WT1的灵敏性：取表达阳性的K562细胞与正常人外周血MNC按1∶10，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105，1∶106倍比稀释，然后用RT-PCR测定WT1mRNA，结果显示测定的灵敏性为10-4～10-5。讨论
WT1基因是Wilms′瘤的易感基因，其在造血系统中起着一定的作用。有学者研究发现WT1基因有两种功能，即肿瘤抑制基因和促癌基因，而在白血病中，它的促癌基因作用大于肿瘤抑制基因功能，且在白血病的发生、发展中起重要作用[4]。
本文研究发现WT1基因在AML和ALL中均有高表达，分别为65.2%和77.8%，而复发型AL的表达率(88.9%)明显高于初治型AL(67.2%)；在CML的急变期WT1的表达率(100%)要明显高于慢性及加速期(21.7%)；MDS WT1的表达与其疾病阶段密切相关，即在白血病前期WT1为高表达，而NHL、MM的任何疾病阶段WT1的表达均低下，并与正常对照组无显著性差异(P>0.05)，上述结果与国内外文献报道相一致[4～6，8]。有学者认为在AML中，M0、M1、M2、M3WT1高表达，而M4、M5表达较低；本组发现在M1、M2、M3尤其M1、M2有较高表达，其余类型AML因例数相对较少而需进一步研究探讨，而10名正常人未检测到WT1基因。从这些研究结果可以看出：淋系、髓系白血病及MDS，WT1表达水平与不成熟白血病细胞的量有关，并随细胞的分化成熟逐渐降低，而NHL、MM均起源于较后期的淋巴细胞，故其WT1呈低表达。
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准确、敏感地检测白血病患者微小残瘤病(MRD)对于治疗具有重要价值。有学者报道[5，7～9]，利用WT1进行MRD检测可以比临床提前4～32周预测复发。本文对15例治疗前WT1基因表达阳性的患者进行了动态观察，发现治疗后骨髓达CR时11例WT1表达转为阴性，2例表达有明显下降，再经多次化疗WT1转为阴性，另2例骨髓达PR时，WT1就转为阴性。同时我们还观察到7例治疗前WT1阴性的患者，化疗后仍为阴性；5例复发前WT1表达阴性，复发后又转为阳性，3例经再化疗达CR时WT1又转为阴性；1例临床、骨髓仍提示缓解而WT1表达阳性的患者，2周后临床、骨髓提示复发；1例CML加速期WT1表达阴性，急变期转为阳性。
本文应用RT-PCR检测WT1基因表达，其检测敏感性达10-4水平，故WT1可作为判断预后及监测MRD的敏感指标[4，8]。而对于MDS，动态监测WT1的表达具有更重要意义，Tamaki等[4]认为MDS的患者如WT1的表达从阴性转为阳性，则提示6个月内MDS即将转为AL，应尽可能早些行骨髓移植治疗，而CML慢性与加速期WT1表达阳性者更需要密切观察其疾病的演变。
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综上所述，检测WT1表达对研究白血病、MDS的发生发展及监测MRD和判断白血病病人预后、预测疾病进展、制定个体化疗方案及其化疗与骨髓移植治疗后疗效的随访观察等均有重要作用。
参考文献
1，Hewitt SM，Monares A，Kotickal L，et al.Regulation of the proncogenes bal-2 and c-myc by the Wilms tumor supressor gene WT1.Cancer Res，1995，55：5386-5389.
2，Baird PN，Simmons PJ.Exprsssion of the Wilms tumor gene in normal hematopoiesis.Exp-Hematol，1997，25：312-320.
3，张之南，沈悌，主编.血液病诊断及疗效标准.北京：科学出版社，1998，168-381.
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4，Tamaki H，Ogawa H，ohyashiki K，et al.The Wilms tumor gene WT1 is a good marker for diagnosis of disease progression of myelodysplastic syndromes.Leukemia，1999，13：393-399.
5，Inoue K，Sugiyama H，Ogawa H，et al.WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia.Blood，1994，84：3071-3079.
6，郭晓楠，徐世荣，董作仁，等.白血病患者WT1基因的表达及其与预后及多药耐药的关系.中华血液学杂志，1999，20：69-72.
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7，Sugiyama H，Wilms tumor gene as a new marker for the detection of minimal residual disease in leukemia.Leuk-lymphone，1998，30：55-61.
8，Hosoya N，Miyagawa K，Mitani K，et al.Mutation analysis of the WT1 gene in myelodysplastic syndromes.Jan J Cancer Res 1998，89：821-824.
9，Inoue K，Ogawa H，Yamagami T，et al.Long-term follow-up of minimal residual disease in leukemia patients by monitoring WT1 expression levels.Blood，1996，88：2267-2268.
收稿：1999-11-25
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