Smad2基因MH2结构域表达载体的构建和其在大肠杆菌中的表达
作者：陈 健 牛忠英 药立波 范金水
单位：陈健 牛忠英 第四军医大学口腔医学院；药立波，范金水 第四军医大学全军分子生物学重点实验室
关键词：基因Smad2；MH2；遗传载体；基因表达
实用口腔医学杂志990202 〔摘要〕 目的：构建Smad2基因MH2结构域原核融合表达载体， 在大肠杆菌中表达MH2结构域，为制备抗MH2抗体，研究Smad2基因和MH2结构域的功能奠定基础。方法：用pGEX-4T-2表达载体构建pGEX-4T-2/S2MH2原核融合表达载体，转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达GST-MH2融合蛋白，100 g/L SDS-PAGE检测表达产物。结果：重组载体转化DH5α，经IPTG诱导4 h后，在100 g/L SDS-PAGE上出现一条新的蛋白条带，相对分子质量(Mr) 约为49×103。结论：构建成功pGEX-4T-2/S2MH2融合表达载体，在大肠杆菌DH5α内表达获得GST-MH2融合蛋白。
, http://www.100md.com
Expression of MH2 domain of smad2 in E.Coli
Chen Jian, Niu Zhongying, Yao Libo.
Stomatological College, Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕 Objective:To express MH2 domain of smad2 in E.Coli.Methods:The cDNA fragment of MH2 domain was obtained with EcoR I and Xho I from the plasmid pBluescript/S2MH2.The fragment was inserted into prokaryotic gene fusion vector pGEX-4T-2 and an expression plasmid pGEX-4T-2/S2MH2 was constructed.E.Coli DH5 α transformed with recombinant plasmid pGEX-4T-2/S2MH2 was induced by IPTG for 4 h.Results:100 g/L SDS-PAGE revealed a new foreign protein band near Mr 49×103.Conclusion:The constructed plasmid expresses GST-MH2 in E.Coli.
, 百拇医药
Key words Genes Smad2;MH2;Genetic vector;Gene expression
牙髓损伤修复的分子机理是多年来国内外学者关注的重要课题。转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β) 在牙髓的损伤修复和第三期牙本质的形成过程中起着重要的调控作用〔1,2〕。Smad2是TGF-β特异的细胞内信号转导分子，MH2是其功能性的结构域〔3〕。作者的研究已经证实了Smad2 在人牙髓细胞内的表达，并已克隆成功Smad2基因的MH2结构域〔4〕。本研究通过构建MH2结构域的原核融合表达载体，转化大肠杆菌，诱导表达GST-MH2融合蛋白，旨在为制备抗MH2抗体，深入研究Smad2基因和MH2结构域的功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 含Smad2基因MH2结构域的质粒pBluescript/S2MH2 由作者从原代培养的人牙髓细胞克隆构建。经序列测定，pBluescript/S2MH2中插入基因全长667bp(34～701位)，其中编码MH2结构域的核苷酸序列长627bp，与已发表的从人肾cDNA文库中克隆的Smad2基因MH2结构域的核苷酸序列完全一致〔4〕。
, http://www.100md.com
1.2 GST-MH2融合表达载体的构建
核酸内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分别对pBluescript/S2MH2和pGEX-4T-2进行双酶消化。 酶切产物于10 g/L低熔点琼脂糖凝胶上电泳。 用AdvantageTM PCR-Pure Kit( Clotech Laboratories Inc. USA)分别回收MH2片段和pGEX-4T-2。T4连接酶连接MH2 和pGEX-4T-2，构建pGEX-4T-2/S2MH2表达载体。转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆， 提取质粒，EcoRⅠ和XhoⅠ酶切及PCR鉴定筛选阳性克隆。
1.3 诱导表达
经鉴定的pGEX-4T-2/S2MH2表达载体和pGEX-4T-2空载体分别转化大肠杆菌DH5 α，37 ℃培养过夜。按1∶100接种扩大培养， 37 ℃培养4 h 。 加入IPTG 至终浓度0.5 mmol/L，37 ℃培养4 h。
, 百拇医药
1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
各取1 ml经诱导、未经诱导及空载体菌液，12 000 r/min离心取沉淀，加入15 μl去离子水和15 μl 2×上样缓冲液(50 g/L-巯基乙醇，40 g/L SDS，0.25 g/L溴酚蓝)， 混匀，于沸水中煮6 min，12 000 r/min离心10 min后取5 μl上样，100 g/L分离胶电泳，考马斯亮蓝染色。
2 结 果
2.1 构建MH2结构域原核融合表达载体(图1)
从pGEX-4T-2/S2MH2中用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切出MH2基因， 重组入融合表达载体pGEX-4T-2/S2MH2中。重组载体经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶消化，于10 g/L 低熔点琼脂糖凝胶电泳， 可见大小约667 bp 和4970 bp 的两条特异条带， 证实构建成pGEX-4T-2/S2MH2融合表达载体。
, http://www.100md.com
图1 pGEX-4T-2/S2MH2经 EcoRⅠ和XhoⅠ双酶消化
鉴定，10 g/L 低熔点琼脂糖凝胶电泳
a.b:pGEX-4T-2/S2MH2 c:DNA Marker: λDNA/HindⅢ
2.2 MH2结构域在大肠杆菌内的诱导表达(图2)：
pGEX-4T-2/S2MH2转入大肠杆菌DH5α后，经IPTG诱导，100 g/L SDS-PAGE电泳，与未经诱导者相比，在相对分子质量(Mr)49×103处出现一条明显的新生蛋白条带，与预计的GST-MH2融合蛋白大小基本相符。经诱导的pGEX-4T-2/S2MH2空载体在相对分子质量(Mr )26×103处出现一条新生蛋白条带，与GST蛋白大小相符。
, http://www.100md.com
图2 pGEX-4T-2/S2MH2表达产物的100 g/L
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Line1:protein molecular weight marker
Line2:未诱导的 pGEX-4T-2/S2MH2
Line3-7:经诱导的 pGEX-4T-2/S2MH2
Line8:经诱导的 pGEX-4T-2
3 讨 论
TGF-β是属于TGF-β超家族的细胞因子。TGF-β超家族包括TGF-β、BMP、activin等多种细胞因子。随着对牙髓损伤修复和第三期牙本质形成机理研究的不断深入，TGF-β的作用日益受到国内外学者的关注。TGF-β能够促进牙髓细胞形成细胞外基质，诱导牙髓细胞的分化，并促进成牙本质细胞形成第三期牙本质〔1，2〕。对TGF-β的研究已经逐步深入到细胞内信号转导水平。1995年，Sekelsky〔5〕等在研究果蝇Dpp(一种果蝇体内属于TGF-β超家族的细胞因子)作用时，克隆成功1种新的基因，称之为mad(Mothers against Dpp)。研究证实，Mad是细胞内Dpp受体下游的信号转导分子。1996年，Hoodless〔6〕克隆成功第一种与Mad同源的人基因，命名为MADR1(MAD-related 1，即Smad1)。研究证实，Smad1是细胞内的信号转导分子，特异地转导BMPs的信号。Eppert〔4〕等通过研究ESP数据库，与Smad1进行同源性比较、筛选，进而设计引物，并利人肾细胞cDNA文库作为模板进行同源PCR，克隆成功MADR2(MAD-related 2，即Smad2)。Smad2的基因全长为1605 bp，包含1个编码467个氨基酸的完整开放读框。对Smad2的功能研究证实，Smad2是TGF-β特异的细胞内信号转导分子。到目前为止，Smads基因家族共克隆成功9个成员，已统一命名为Smad1～Smad9。根据其作用的不同分为3种类型：途径限制型Smads (Pathway-restricted Smads, R-Smads)，共同中介型Smads(Common-mediator Smads, C-Smads)和抑制型Smads(Inhibitory Smads, I-Smads)。R-Smads包括Smad1 、Smad2 、Smad3、Smad5 、Smad8 和Smad9，它们分别特异地转导某种TGF-β超家族细胞因子的信号。如Smad1 、Smad5 和Smad9 是BMPs特异的细胞内信号转导基因，而Smad2 和Smad3是TGF-β特异的细胞内信号转导基因。C-Smad只有一种，即Smad4。它在TGF-β超家族的各个细胞因子的信号转导途径中都起作用。I-Smads包括Smad6和 Smad7。它们对TGF-β超家族的细胞内信号转导起抑制作用〔7〕。
, http://www.100md.com
Smads家族在结构上有共同的特点。在其N端和C端各存在一个独特的保守结构域，分别称之为MH1和MH2结构域(Mad-homology domain)，中间由一富含脯氨酸的连接区相连〔7〕。目前的研究认为，MH2结构域是信号转导的功能性结构域。Baker〔8〕观察到，单独表达Smad1和Smad2的MH2结构域具有信号转导的作用。Liu〔9〕发现MH2结构域能通过GAL4的DNA结合结构域与DNA结合，显示转录因子的活性。这表明，MH2是Smads的功能性结构域，同时也提示Smads分子很可能具有转录因子的作用。作者的研究已经证实了Smad2 基因在人牙髓细胞内的表达，并克隆成功Smad2基因的MH2结构域〔4〕。但Smad2基因和MH2结构域在人牙髓细胞内的具体作用方式，对哪些基因进行怎样的调控等问题还有待进一步的深入研究。
pGEX-4T-2/S2MH2是一种原核融合表达载体，含有tac启动子、Lac 操纵基因及SD序列等。在SD序列下游是谷胱苷肽巯基转移酶( GST) 基因。 克隆的外源基因与GST基因相连，表达产物为GST与目的基因产物的融合蛋白。选用这一载体是因其具有可诱导高效表达、便于纯化等优点。而且，使用GST-MH2融合蛋白制备抗体， 也有利于对抗体的检测。
, http://www.100md.com
本研究构建了pGEX-4T-2/S2MH2原核融合表达载体，在大肠杆菌DH5α中表达了GST-MH2融合蛋白。GST 的相对分子质量( Mr) 为26 ×103。 插入的目的基因全长667 bp，其中编码MH2结构域的序列长627 bp，编码209个氨基酸，其相对分子质量(Mr)约为23×103。GST-MH2融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为49×103。MH2结构域的原核融合表达，为制备抗MH2抗体，深入研究Smad2和MH2的功能奠定了基础。
本课题为国家自然科学基金资助项目 编号 39870789
参考文献
1Cassidy N, Fahey M, Prine SS, et al. Comparative analysis of transforming growth factor-β isoform 1-3 in human and rabbit dentine matrices. Archs Oral Biol,1997，42(3):219
, 百拇医药
2 Tziafas D. Basic mechanisms of cytodiferentiation and dentinogensis during dental pulp repair. Int J Dev Biol, 1995，39:281
3 Eppert K, Scherer S, Ozcelik H, et al. MADR2 maps to 18q21 and encodes a TGF-β regulated MAD related protein that is functionally mutated in colorectal carcinoma. Cell,1996，86:543
4 陈健，牛忠英，药立波. 人牙髓细胞Smad2基因MH2结构域cDNA克隆和序列测定. 牙体牙髓牙周病学杂志，待发表
5 Sekelsky J, Newfeld s, Raftery L, et al. Genetic characterization and cloning of mothers against dpp, a gene required for decapentaplegic function in drosophila melanogaster.Genetics,1995，139(3):1347
, http://www.100md.com
6 Hoodless P, Haery T, Abdolloh S, et al. MADR1, a Mad-related protein that functions in BMPs signaling pathway. Cell, 1996，85(3):489
7 Henrik C-H, Miyazono K, Dijke P. TGF-βsignalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins.Nature,1997，390:465
8 Baker JC, Harland RM. A novel mesoderm inducer,Madr2,functions in the activin signal transduction pathway. Genes Dev,1996，10:1880
9 Liu F, Hata A, Baker J, et al. A human Mad protein acting as a BMP-regulated transcriptional activator. Nature, 1996，381:620
(收稿：1998-12-08修回:1999-01-07), http://www.100md.com
单位：陈健 牛忠英 第四军医大学口腔医学院；药立波，范金水 第四军医大学全军分子生物学重点实验室
关键词：基因Smad2；MH2；遗传载体；基因表达
实用口腔医学杂志990202 〔摘要〕 目的：构建Smad2基因MH2结构域原核融合表达载体， 在大肠杆菌中表达MH2结构域，为制备抗MH2抗体，研究Smad2基因和MH2结构域的功能奠定基础。方法：用pGEX-4T-2表达载体构建pGEX-4T-2/S2MH2原核融合表达载体，转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达GST-MH2融合蛋白，100 g/L SDS-PAGE检测表达产物。结果：重组载体转化DH5α，经IPTG诱导4 h后，在100 g/L SDS-PAGE上出现一条新的蛋白条带，相对分子质量(Mr) 约为49×103。结论：构建成功pGEX-4T-2/S2MH2融合表达载体，在大肠杆菌DH5α内表达获得GST-MH2融合蛋白。
, http://www.100md.com
Expression of MH2 domain of smad2 in E.Coli
Chen Jian, Niu Zhongying, Yao Libo.
Stomatological College, Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕 Objective:To express MH2 domain of smad2 in E.Coli.Methods:The cDNA fragment of MH2 domain was obtained with EcoR I and Xho I from the plasmid pBluescript/S2MH2.The fragment was inserted into prokaryotic gene fusion vector pGEX-4T-2 and an expression plasmid pGEX-4T-2/S2MH2 was constructed.E.Coli DH5 α transformed with recombinant plasmid pGEX-4T-2/S2MH2 was induced by IPTG for 4 h.Results:100 g/L SDS-PAGE revealed a new foreign protein band near Mr 49×103.Conclusion:The constructed plasmid expresses GST-MH2 in E.Coli.
, 百拇医药
Key words Genes Smad2;MH2;Genetic vector;Gene expression
牙髓损伤修复的分子机理是多年来国内外学者关注的重要课题。转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β) 在牙髓的损伤修复和第三期牙本质的形成过程中起着重要的调控作用〔1,2〕。Smad2是TGF-β特异的细胞内信号转导分子，MH2是其功能性的结构域〔3〕。作者的研究已经证实了Smad2 在人牙髓细胞内的表达，并已克隆成功Smad2基因的MH2结构域〔4〕。本研究通过构建MH2结构域的原核融合表达载体，转化大肠杆菌，诱导表达GST-MH2融合蛋白，旨在为制备抗MH2抗体，深入研究Smad2基因和MH2结构域的功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 含Smad2基因MH2结构域的质粒pBluescript/S2MH2 由作者从原代培养的人牙髓细胞克隆构建。经序列测定，pBluescript/S2MH2中插入基因全长667bp(34～701位)，其中编码MH2结构域的核苷酸序列长627bp，与已发表的从人肾cDNA文库中克隆的Smad2基因MH2结构域的核苷酸序列完全一致〔4〕。
, http://www.100md.com
1.2 GST-MH2融合表达载体的构建
核酸内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分别对pBluescript/S2MH2和pGEX-4T-2进行双酶消化。 酶切产物于10 g/L低熔点琼脂糖凝胶上电泳。 用AdvantageTM PCR-Pure Kit( Clotech Laboratories Inc. USA)分别回收MH2片段和pGEX-4T-2。T4连接酶连接MH2 和pGEX-4T-2，构建pGEX-4T-2/S2MH2表达载体。转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆， 提取质粒，EcoRⅠ和XhoⅠ酶切及PCR鉴定筛选阳性克隆。
1.3 诱导表达
经鉴定的pGEX-4T-2/S2MH2表达载体和pGEX-4T-2空载体分别转化大肠杆菌DH5 α，37 ℃培养过夜。按1∶100接种扩大培养， 37 ℃培养4 h 。 加入IPTG 至终浓度0.5 mmol/L，37 ℃培养4 h。
, 百拇医药
1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
各取1 ml经诱导、未经诱导及空载体菌液，12 000 r/min离心取沉淀，加入15 μl去离子水和15 μl 2×上样缓冲液(50 g/L-巯基乙醇，40 g/L SDS，0.25 g/L溴酚蓝)， 混匀，于沸水中煮6 min，12 000 r/min离心10 min后取5 μl上样，100 g/L分离胶电泳，考马斯亮蓝染色。
2 结 果
2.1 构建MH2结构域原核融合表达载体(图1)
从pGEX-4T-2/S2MH2中用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切出MH2基因， 重组入融合表达载体pGEX-4T-2/S2MH2中。重组载体经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶消化，于10 g/L 低熔点琼脂糖凝胶电泳， 可见大小约667 bp 和4970 bp 的两条特异条带， 证实构建成pGEX-4T-2/S2MH2融合表达载体。
, http://www.100md.com
图1 pGEX-4T-2/S2MH2经 EcoRⅠ和XhoⅠ双酶消化
鉴定，10 g/L 低熔点琼脂糖凝胶电泳
a.b:pGEX-4T-2/S2MH2 c:DNA Marker: λDNA/HindⅢ
2.2 MH2结构域在大肠杆菌内的诱导表达(图2)：
pGEX-4T-2/S2MH2转入大肠杆菌DH5α后，经IPTG诱导，100 g/L SDS-PAGE电泳，与未经诱导者相比，在相对分子质量(Mr)49×103处出现一条明显的新生蛋白条带，与预计的GST-MH2融合蛋白大小基本相符。经诱导的pGEX-4T-2/S2MH2空载体在相对分子质量(Mr )26×103处出现一条新生蛋白条带，与GST蛋白大小相符。
, http://www.100md.com
图2 pGEX-4T-2/S2MH2表达产物的100 g/L
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Line1:protein molecular weight marker
Line2:未诱导的 pGEX-4T-2/S2MH2
Line3-7:经诱导的 pGEX-4T-2/S2MH2
Line8:经诱导的 pGEX-4T-2
3 讨 论
TGF-β是属于TGF-β超家族的细胞因子。TGF-β超家族包括TGF-β、BMP、activin等多种细胞因子。随着对牙髓损伤修复和第三期牙本质形成机理研究的不断深入，TGF-β的作用日益受到国内外学者的关注。TGF-β能够促进牙髓细胞形成细胞外基质，诱导牙髓细胞的分化，并促进成牙本质细胞形成第三期牙本质〔1，2〕。对TGF-β的研究已经逐步深入到细胞内信号转导水平。1995年，Sekelsky〔5〕等在研究果蝇Dpp(一种果蝇体内属于TGF-β超家族的细胞因子)作用时，克隆成功1种新的基因，称之为mad(Mothers against Dpp)。研究证实，Mad是细胞内Dpp受体下游的信号转导分子。1996年，Hoodless〔6〕克隆成功第一种与Mad同源的人基因，命名为MADR1(MAD-related 1，即Smad1)。研究证实，Smad1是细胞内的信号转导分子，特异地转导BMPs的信号。Eppert〔4〕等通过研究ESP数据库，与Smad1进行同源性比较、筛选，进而设计引物，并利人肾细胞cDNA文库作为模板进行同源PCR，克隆成功MADR2(MAD-related 2，即Smad2)。Smad2的基因全长为1605 bp，包含1个编码467个氨基酸的完整开放读框。对Smad2的功能研究证实，Smad2是TGF-β特异的细胞内信号转导分子。到目前为止，Smads基因家族共克隆成功9个成员，已统一命名为Smad1～Smad9。根据其作用的不同分为3种类型：途径限制型Smads (Pathway-restricted Smads, R-Smads)，共同中介型Smads(Common-mediator Smads, C-Smads)和抑制型Smads(Inhibitory Smads, I-Smads)。R-Smads包括Smad1 、Smad2 、Smad3、Smad5 、Smad8 和Smad9，它们分别特异地转导某种TGF-β超家族细胞因子的信号。如Smad1 、Smad5 和Smad9 是BMPs特异的细胞内信号转导基因，而Smad2 和Smad3是TGF-β特异的细胞内信号转导基因。C-Smad只有一种，即Smad4。它在TGF-β超家族的各个细胞因子的信号转导途径中都起作用。I-Smads包括Smad6和 Smad7。它们对TGF-β超家族的细胞内信号转导起抑制作用〔7〕。
, http://www.100md.com
Smads家族在结构上有共同的特点。在其N端和C端各存在一个独特的保守结构域，分别称之为MH1和MH2结构域(Mad-homology domain)，中间由一富含脯氨酸的连接区相连〔7〕。目前的研究认为，MH2结构域是信号转导的功能性结构域。Baker〔8〕观察到，单独表达Smad1和Smad2的MH2结构域具有信号转导的作用。Liu〔9〕发现MH2结构域能通过GAL4的DNA结合结构域与DNA结合，显示转录因子的活性。这表明，MH2是Smads的功能性结构域，同时也提示Smads分子很可能具有转录因子的作用。作者的研究已经证实了Smad2 基因在人牙髓细胞内的表达，并克隆成功Smad2基因的MH2结构域〔4〕。但Smad2基因和MH2结构域在人牙髓细胞内的具体作用方式，对哪些基因进行怎样的调控等问题还有待进一步的深入研究。
pGEX-4T-2/S2MH2是一种原核融合表达载体，含有tac启动子、Lac 操纵基因及SD序列等。在SD序列下游是谷胱苷肽巯基转移酶( GST) 基因。 克隆的外源基因与GST基因相连，表达产物为GST与目的基因产物的融合蛋白。选用这一载体是因其具有可诱导高效表达、便于纯化等优点。而且，使用GST-MH2融合蛋白制备抗体， 也有利于对抗体的检测。
, http://www.100md.com
本研究构建了pGEX-4T-2/S2MH2原核融合表达载体，在大肠杆菌DH5α中表达了GST-MH2融合蛋白。GST 的相对分子质量( Mr) 为26 ×103。 插入的目的基因全长667 bp，其中编码MH2结构域的序列长627 bp，编码209个氨基酸，其相对分子质量(Mr)约为23×103。GST-MH2融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为49×103。MH2结构域的原核融合表达，为制备抗MH2抗体，深入研究Smad2和MH2的功能奠定了基础。
本课题为国家自然科学基金资助项目 编号 39870789
参考文献
1Cassidy N, Fahey M, Prine SS, et al. Comparative analysis of transforming growth factor-β isoform 1-3 in human and rabbit dentine matrices. Archs Oral Biol,1997，42(3):219
, 百拇医药
2 Tziafas D. Basic mechanisms of cytodiferentiation and dentinogensis during dental pulp repair. Int J Dev Biol, 1995，39:281
3 Eppert K, Scherer S, Ozcelik H, et al. MADR2 maps to 18q21 and encodes a TGF-β regulated MAD related protein that is functionally mutated in colorectal carcinoma. Cell,1996，86:543
4 陈健，牛忠英，药立波. 人牙髓细胞Smad2基因MH2结构域cDNA克隆和序列测定. 牙体牙髓牙周病学杂志，待发表
5 Sekelsky J, Newfeld s, Raftery L, et al. Genetic characterization and cloning of mothers against dpp, a gene required for decapentaplegic function in drosophila melanogaster.Genetics,1995，139(3):1347
, http://www.100md.com
6 Hoodless P, Haery T, Abdolloh S, et al. MADR1, a Mad-related protein that functions in BMPs signaling pathway. Cell, 1996，85(3):489
7 Henrik C-H, Miyazono K, Dijke P. TGF-βsignalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins.Nature,1997，390:465
8 Baker JC, Harland RM. A novel mesoderm inducer,Madr2,functions in the activin signal transduction pathway. Genes Dev,1996，10:1880
9 Liu F, Hata A, Baker J, et al. A human Mad protein acting as a BMP-regulated transcriptional activator. Nature, 1996，381:620
(收稿：1998-12-08修回:1999-01-07), http://www.100md.com