肝癌中cyclin D1扩增与HBV感染及病理学的关系*
作者：王辉云 严瑞琪 龙江斌 吴秋良
单位：王辉云 严瑞琪 龙江斌 中山医科大学肿瘤防治中心 肿瘤研究所； 吴秋良 肿瘤医院病理科 广东省广州市 510060
关键词：肝肿瘤/病理学；癌，肝细胞/病理学；肝炎，乙型；DNA，病毒
摘 要 目的 探讨癌基因 cyclin D1在肝癌发生发展中的作用以及与HBV感染和临床病理之间的关系摘 要
目的 探讨癌基因 cyclin D1在肝癌发生发展中的作用以及与HBV感染和临床病理之间的关系.
方法 取手术切除的肝细胞癌标本，用Southern杂交的方法对cyclin D1和CDK4癌基因以及HBV的感染状态进行了检测，切片同时行病理检查.
, http://www.100md.com 结果 肝癌39例中9例cyclin D1存在2～30倍的扩增(23.7%)，其中1例检出重组杂交带；37例中5例(13.5%)有CDK4的扩增；HBV DNA在肝癌组织中检出的阳性率为94.7%，HBV DNA整合率为74.4%. 相关分析发现，cyclin D1的扩增与CDK4扩增，HBV DNA整合，肿瘤的分化高低和肿块大小等之间有相关关系，相关系数r分别为0.51，0.31，0.39和0.55，全部P<0.05.
结论 cyclin D1的扩增与HBV DNA的整合密切相关，并在肝癌的恶化进展中起着重要作用.
中国图书资料分类号 R735.7
Cyclin D1 amplification is associated with HBV DNA integration and pathology in human hepatocellular carcinoma*
, 百拇医药
WANG Hui-Yun1, YAN Rui-Qi1, LONG Jiang-Bin1 and WU Qiu-Liang2
1Cancer Institute, 2Department of Pathology, Tumor Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China
Subject headings liver neoplasms/pathology; carcinoma, hepatocellular/pathology; hepatitis B; DNA, viral; cyclin D1
Abstract
, http://www.100md.com
AIM To explore the amplification of cyclin D1 and its correlation to HBV infection and pathology during the development of human hepatocellular carcinoma (HCC).
METHODS Forty specimens of fresh paired tumor and nontumor liver tissues from surgical resections were used for detection of genetic alterations of cyclin D1, CDK4 and HBV infection by the Southern hybridization. The samples were also examined histologically for pathological correlation with the genetic changes.
, 百拇医药
RESULTS Two-to thirty-fold amplifications of cyclin D1 gene were detected in 9 of 39 HCC samples (23.7%) and a structural aberration of the gene was found in one of those samples with amplification. The amplifications of CDK4 gene were found in 5 of 37 HCC cases. HBV DNA was detected in 37 of 39 HCC samples (94.9%) and the integration of HBV DNA in 29 of 39 HCC samples (74.4%). By correlation analysis, cyclin D1 amplification significantly correlated with amplification of CDK4, the integration of HBV DNA, the differentiation degree and size of tumors. The correlation coefficients were 0.51, 0.31，0.39 and 0.55 respectively, P<0.05 for all.
, http://www.100md.com
CONCLUSION The amplification of cyclin D1 is related to HBV DNA integration and plays an important role in the development and progression of HCC.
0 引言
Cyclin D1基因是1991年由Motokura T et al[1]从甲状旁腺腺瘤中克隆和鉴定出来的，位于染色体11q13，被认为是一个癌基因. Cyclin D1的作用是与细胞周期素依赖的蛋白激酶4(CDK4)结合并激活CDK4，从而催化RB蛋白磷酸化使细胞从G1期进入S期[2]. 此外，cyclin D1自身也能与RB蛋白结合并使RB蛋白磷酸化[1]. Cyclin D1的扩增已涉及到许多肿瘤的发生. 目前，国内尚未见有关肝癌中cyclin D1状态的报道. 最近，我们对广东省肝癌中cyclin D1的状态及其与其他因素的关系进行了探讨，现报道如下.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 1995-06/1995-11顺序收集中山医科大学肿瘤医院初诊住院肝癌患者手术切除的标本共40例，患者平均年龄48岁(20岁～69岁)，男37例，女3例. 每个病例均收集新鲜癌和癌旁肝组织，标本全部经病理学诊断：39例肝细胞癌，1例混合细胞癌. 每一个病例均取部分组织作常规HE染色，由肿瘤病理专家进行病理观察，其中分裂指数是指随机选择的10个高倍视野的核分裂象数的平均数(表1).
1.2 Southern杂交 ①基因组DNA抽提、酶切、电泳和Southern印迹：标本置液氮冻硬打碎，每克组织加5mL消化液，置于50℃水浴摇动过夜；加等量酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次，加10mol/L乙酸铵和等体积无水乙醇沉淀DNA，TE (pH 8.0)溶解DNA. 取20μg样本DNA，60U～80U限制性内切酶消化过夜后，再于8g/L琼脂糖(宝灵曼产品)凝胶中电泳过夜. 取出凝胶，经酸、碱及中和处理后，于10×SSC溶液中行毛细转印，印迹18h～24h. 印迹后，取出尼龙膜(宝灵曼产品)，于120℃烘烤20min，真空保存备用. ②探针：HBV DNA探针，由EcoRⅠ从pHBV重组质粒中切出，长度3.2kb，为HBV的ayw型，质粒由中山医科大学分子医学中心提供；cyclin D1探针[1]，由EcoRⅠ从pPL-8重组质粒中切出，长度1.4kb，为人cyclin D1 cDNA片段，质粒由美国麻省总医院Arnold博士惠赠；CDK4探针[3]，由BamHⅠ从pcD-PSKJ3重组质粒中切出，长度1.6kb，含人CDK4 cDNA全长，质粒由美国Vanderbilt大学Hanks博士惠赠；β-Actin探针，长度2.0kb，购自北京中山生物技术公司. ③探针标记：探针采用随机引物法标记α-32P-dCTP，试剂盒为Promega产品：标记操作按说明书进行. 标记反应后，离心柱层析法纯化标记探针，经测定估计同位素掺入率60%～70%，探针放射性比度约为2×1014min-1.g-1. ④DNA膜上杂交：取一塑料盒，加入适量的预杂交液(含500g/L甲酰胺)，将已印迹的尼龙膜放入，42℃摇动温育2h. 然后将预杂交好的膜封入杂交袋并加入3.5mL杂交液(含变性标记探针约4.5×108min-1*L-1)，于42℃摇动杂交过夜. 经常规洗膜后，将杂交膜和富士X光片一起装入暗盒，置-70℃曝光4d～9d. ⑤杂交带定量分析：对样本中被检基因和参照基因(β-actin)的杂交带于DU 640紫外分光光度计中进行光密度扫描. 等位基因拷贝数的确定，按文献[4]报道的方式计算.
, 百拇医药
统计学处理 所有的数据分析均采用SPSS for Windows (Release 6.0)统计软件进行分析，采用的统计模块有综合分析模块中的列联表分析、相关分析模块中的双变量相关分析等.
2 结果
2.1 HBV感染状态 用Southern杂交检测了40例肝癌和对应的癌旁组织内的HBV状态，HBV DNA在癌组织内总的阳性率为94.9%(37/39)，HBV DNA的整合率为74.4%(29/39)，整合条带多的达6条，两条以上的占总整合的69%；癌旁肝组织HBV DNA总的阳性率为78.6%，整合HBV DNA为64.3%. 此外，患者外周血中血清HBsAg阳性率为70%(28/40).
2.2 cyclin D1基因状态 本实验检测了40个病例，可供分析的有39例. EcoRⅠ酶切时，cyclin D1产生4.0kb，2.3kb和2.0kb三条带；用HindⅢ酶切产生16.8kb和2.7kb二条带(图1). 39例中有9例cyclin D1扩增，扩增发生率为23.7%(表1). 其中20号病例的cyclin D1既有扩增又有结构变异，即在EcoRⅠ酶切时出现14.4kb，3.8kb和2.1kb三条带，基因扩增量达30倍.
, 百拇医药
表1 各种基因变化与临床病理的关系
临床病理
n
cyclin D1/扩增(%)
肝癌总数
40
9/39 (23.7)b
分化程度a
高分化
6
0/5 ( 0.0)
中分化
, 百拇医药
20
3/20 (15.0)
低分化
14
6/13 (46.2)
分裂指数
～1.0
6
1/6 (16.6)
～2.0
19
3/19 (15.8)
>2.0
, 百拇医药
15
5/14 (35.7)
HBV DNA整合a
无
10
0/10 ( 0.0)
有
29
9/27 (33.3)
癌细胞浸润
无
30
, 百拇医药 6/28 (21.4)
有
10
3/10 (30.0)
肿瘤直径
≤5cm
11
0/9 ( 0.0)d
～10cm
20
3/19 (15.8)d
>10cm
, 百拇医药
9
6/9 (66.7)d
肝硬变
无
7
3/7 (42.9)
有
33
6/31 (19.4)
HBsAg
阴性
12
1/9 (11.1)
, http://www.100md.com
阳性
28
8/28 (28.6)
bP<0.01，r=0.51，aP<0.05；dP<0.01，r=0.55.
图1 Cyclin D1杂交图. A.基因组DNA由EcoRⅠ消化，20号病例cyclin D1基因重组并扩增；B.基因组DNA由HindⅢ消化，16号病例cyclin D1基因扩增. T.肝癌组织，N.非癌肝组织.
2.3 CDK4的基因状态 用EcoRⅠ酶切基因组DNA时，CDK4基因出现二条杂交带，分别约为12.0kb和6.0kb；用HindⅢ酶切时只出现一条约9.4kb的带. 可供分析的37例肝癌中发现5例癌组织CDK4扩增，扩增频率为13.5%.
, 百拇医药
2.4 Cyclin D1与HBV感染及临床病理间的关系 相关分析显示，cyclin D1的扩增与CDK4扩增、HBV DNA整合、肿瘤分化程度和肿瘤大小等之间有相关关系，相关系数r分别为0.51，0.31，0.39和0.55，全部P<0.05. 此外，患者外周血中HBsAg的检出率为70.0%(28/40)，其与癌组织中HBV DNA的相关系数为0.43，与癌内整合HBV DNA的相关系数为0.38，两者均P<0.05. 分析还发现，CDK4扩增的病例全部发生在有HBV DNA整合的病例，无HBV DNA整合的病例无扩增(0/9).
3 讨论
本组患者血清HBsAg阳性率为75.7%，肝癌组织中HBV DNA的总检出率为94.9%，有肝硬变的患者占82.5%. 结果提示，这些肝癌的发生仍主要与HBV感染以及肝硬变有关. 在肝癌组织中，整合的HBV DNA检出率为74.4%，与陈渊卿et al[5]报道的结果相似，提示整合的HBV DNA在肝癌的发生中可能起着重要作用. HBV DNA整合的位点最多可达6个，有2个以上整合位点的病例占总整合例数的69%，提示多位点整合在肝癌的发生中可能有重要作用. 相关分析显示，患者血清HBsAg阳性率与肝癌组织中的整合HBV DNA有相关关系，提示S蛋白的表达可能与整合的HBV DNA有关.
, 百拇医药
自从cyclin D1发现后，已有的报道表明该基因涉及到人的许多肿瘤，如食管癌、乳腺癌、肺癌和喉癌等；在肝癌中有11%～13%的病例存在着cyclin D1的扩增，而且其相应的mRNA或蛋白均有过表达[6，7]. 在本次实验中，肝癌中cyclin D1基因有23.7%的病例存在2～30倍的扩增，稍高于国外报道的扩增率，其中扩增倍数最高的一例同时存在着基因重组(图1). 我们用比较基因组杂交法检测了另31例肝癌，其中11号染色体长臂(11q)的扩增率为16.1%，与位于11q的cyclin D1的扩增率相近，两者结果相互印证. 相关分析显示，cyclin D1的扩增与肿瘤分化程度、肿瘤大小等有正相关关系，这表明cyclin D1的作用主要是促进肝癌的发展、演进和恶化，这与Nishida et al[7]报道的cyclin D1扩增全部发生在第Ⅳ期和肿块在5cm以上的肝癌相似. 从最近的报道来看cyclin D1的这种作用已得到体外研究的印证，如Uchimaru et al[8]报道单独转染cyclin D1或者与ras或p53共同转染不能使细胞转化，但cyclin D1的转染能提高ras与p53共同转染所致的细胞转化效率并能减少细胞生长对血清的依赖性，当转化细胞注射到裸鼠体内时移植物生长得更快. 本次实验还显示，9例cyclin D1扩增全部发生在有HBV DNA整合的病例，相关分析显示两者之间有相关关系. Wang et al[9]报道过一例肝癌中的HBV DNA整合于cyclin A基因中. 本次实验中，20号病例的cyclin D1既扩增又有结构重组，而且其癌组织中有4条HBV DNA整合带. 因此，cyclin D1的扩增与重组是否与HBV DNA整合在其附近有关，值得探讨.
, 百拇医药
CDK4基因的变异已涉及到许多肿瘤，但有关其在肝癌中状态的研究甚少，迄今只检索到Kita et al[10]发表过一篇有关报道，其中提到CDK4在肝癌中没有变化. 在本次实验中，Southern blot检出5例肝癌组织中CDK4有扩增，扩增率为13.5%，这显示CDK4在我国部分肝癌的发生发展中起着一定的作用. 所有CDK4扩增病例的肝癌组织中全部有HBV DNA的整合，患者的血清中也全部存在HBsAg，提示CDK4的扩增可能与HBV DNA的整合或HBV感染有关.
相关分析显示，本实验中CDK4的扩增与cyclin D1的扩增有相关关系，这可能与基因扩增引起过表达的CDK4蛋白须和过表达的cyclin D1蛋白形成复合物才能发挥抑制RB蛋白的作用有关. 此外，人肝癌中这两者的扩增都是发生在有HBV DNA整合的病例，提示两者的扩增与整合的HBV DNA之间可能有关联作用.
作者简介：王辉云，男，1958-12-26生，湖南省衡阳市人，汉族. 1982年衡阳医学院医疗专业本科毕业，1997年中山医科大学博士，助理研究员，主要从事原发性肝癌和鼻咽癌的研究，发表论文14篇，获广东省科技进步三等奖2次.
, http://www.100md.com
*国家教委博士学科点专项科研基金，No.94156和广东省自然科学基金，No.940222.
通讯作者 王辉云，510060，中山医科大学肿瘤研究所，广东省广州市东风东路651号.
*Supported by Scientific Research Foundation of National Education Committee, No.94156 and Guangdong Province Natural Science Foundation No.940222.
Correspondence to:Dr. WANG Hui-Yun, Cancer Institute, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, 651 Dongfeng Donglu, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China
, 百拇医药
Tel. +86.20.87765368 Ext. 7274, Fax. +86*20*87754506
E-mail. wangh@gzsums. edu. cn
4 参考文献
[1] Motokura T, Bloom T, Kim HG, Juppner H, Ruderman JV, Kronenberg HM. A novel cyclin encoded by a bcl 1-linked candidate oncogene. Nature, 1991;350:512-515
[2] Matsushime H, Ewen ME, Strom DK, Kato JY, Hanks SK, Roussel MF et al. Identification and properties of an atypical catalytic subunit (p34PSK-J3/cdk4) for mammalian D type G1 cyclins. Cell, 1992;71:323-334
, 百拇医药
[3] Hanks SK. Homology probing: identification of cDNA clones encoding members of the protein-serine kinase family. Proc Natl Acad Sci USA, 1987;84:388-392
[4] Schmidt EE, Ichimura K, Reifenberger G, Collins-VP. CDKN2(p16/MTS1) gene deletion or CDK4 amplification occurs in the majority of glioblatomas. Cancer Res, 1994;54:6321-6324
[5] 陈渊卿，蒋惠秋，顾建人，曹韵珍，廖锦初. 乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸在人原发性肝癌及癌旁组织中存在状态和与肝癌的关系. 上海医学，1988；11：63-65
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[6] Zhang YJ, Jiang W, Chen CJ, Lee-CS, Kahn-SM, Santella RM. Amplification and overexpression of cyclin D1 in human hepatocellular carcinoma. Biochem Biophys Res Commun, 1993;196:1010-1016
[7] Nishida N, Fukuda Y, Komeda T, Kita R, Sando T, Furukawa M. Amplification and overexpression of the cyclin D1 gene in aggressive human hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 1994;54:3107-3110
[8] Uchimaru K, Endo K, Fujinuma H, Zukerberg L, Arnold A, Motokura T. Oncogenic collaboration of the cyclin D1 (PRAD1 bcl-1) gene with a mutated p53 and an activated ras oncogene in neoplastic transformation. Jpn J Cancer Res, 1996;87:459-465
, 百拇医药
[9] Wang J, Chenivesse X, Henglein B, Brechot C. Hepatitis B virus integration in a cyclin A gene in a hepatocellular carcinoma. Nature, 1990;343:555-557
[10] Kita R, Hishida N, Fukuda Y, Azechi H, Matsuoka Y, Komeda T. Infrequent alterations of the p16INK4A gene in liver cancer. Int J Cancer, 1996;67:176-180
收稿日期 1998-08-04, 百拇医药
单位：王辉云 严瑞琪 龙江斌 中山医科大学肿瘤防治中心 肿瘤研究所； 吴秋良 肿瘤医院病理科 广东省广州市 510060
关键词：肝肿瘤/病理学；癌，肝细胞/病理学；肝炎，乙型；DNA，病毒
摘 要 目的 探讨癌基因 cyclin D1在肝癌发生发展中的作用以及与HBV感染和临床病理之间的关系摘 要
目的 探讨癌基因 cyclin D1在肝癌发生发展中的作用以及与HBV感染和临床病理之间的关系.
方法 取手术切除的肝细胞癌标本，用Southern杂交的方法对cyclin D1和CDK4癌基因以及HBV的感染状态进行了检测，切片同时行病理检查.
, http://www.100md.com 结果 肝癌39例中9例cyclin D1存在2～30倍的扩增(23.7%)，其中1例检出重组杂交带；37例中5例(13.5%)有CDK4的扩增；HBV DNA在肝癌组织中检出的阳性率为94.7%，HBV DNA整合率为74.4%. 相关分析发现，cyclin D1的扩增与CDK4扩增，HBV DNA整合，肿瘤的分化高低和肿块大小等之间有相关关系，相关系数r分别为0.51，0.31，0.39和0.55，全部P<0.05.
结论 cyclin D1的扩增与HBV DNA的整合密切相关，并在肝癌的恶化进展中起着重要作用.
中国图书资料分类号 R735.7
Cyclin D1 amplification is associated with HBV DNA integration and pathology in human hepatocellular carcinoma*
, 百拇医药
WANG Hui-Yun1, YAN Rui-Qi1, LONG Jiang-Bin1 and WU Qiu-Liang2
1Cancer Institute, 2Department of Pathology, Tumor Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China
Subject headings liver neoplasms/pathology; carcinoma, hepatocellular/pathology; hepatitis B; DNA, viral; cyclin D1
Abstract
, http://www.100md.com
AIM To explore the amplification of cyclin D1 and its correlation to HBV infection and pathology during the development of human hepatocellular carcinoma (HCC).
METHODS Forty specimens of fresh paired tumor and nontumor liver tissues from surgical resections were used for detection of genetic alterations of cyclin D1, CDK4 and HBV infection by the Southern hybridization. The samples were also examined histologically for pathological correlation with the genetic changes.
, 百拇医药
RESULTS Two-to thirty-fold amplifications of cyclin D1 gene were detected in 9 of 39 HCC samples (23.7%) and a structural aberration of the gene was found in one of those samples with amplification. The amplifications of CDK4 gene were found in 5 of 37 HCC cases. HBV DNA was detected in 37 of 39 HCC samples (94.9%) and the integration of HBV DNA in 29 of 39 HCC samples (74.4%). By correlation analysis, cyclin D1 amplification significantly correlated with amplification of CDK4, the integration of HBV DNA, the differentiation degree and size of tumors. The correlation coefficients were 0.51, 0.31，0.39 and 0.55 respectively, P<0.05 for all.
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CONCLUSION The amplification of cyclin D1 is related to HBV DNA integration and plays an important role in the development and progression of HCC.
0 引言
Cyclin D1基因是1991年由Motokura T et al[1]从甲状旁腺腺瘤中克隆和鉴定出来的，位于染色体11q13，被认为是一个癌基因. Cyclin D1的作用是与细胞周期素依赖的蛋白激酶4(CDK4)结合并激活CDK4，从而催化RB蛋白磷酸化使细胞从G1期进入S期[2]. 此外，cyclin D1自身也能与RB蛋白结合并使RB蛋白磷酸化[1]. Cyclin D1的扩增已涉及到许多肿瘤的发生. 目前，国内尚未见有关肝癌中cyclin D1状态的报道. 最近，我们对广东省肝癌中cyclin D1的状态及其与其他因素的关系进行了探讨，现报道如下.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 1995-06/1995-11顺序收集中山医科大学肿瘤医院初诊住院肝癌患者手术切除的标本共40例，患者平均年龄48岁(20岁～69岁)，男37例，女3例. 每个病例均收集新鲜癌和癌旁肝组织，标本全部经病理学诊断：39例肝细胞癌，1例混合细胞癌. 每一个病例均取部分组织作常规HE染色，由肿瘤病理专家进行病理观察，其中分裂指数是指随机选择的10个高倍视野的核分裂象数的平均数(表1).
1.2 Southern杂交 ①基因组DNA抽提、酶切、电泳和Southern印迹：标本置液氮冻硬打碎，每克组织加5mL消化液，置于50℃水浴摇动过夜；加等量酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次，加10mol/L乙酸铵和等体积无水乙醇沉淀DNA，TE (pH 8.0)溶解DNA. 取20μg样本DNA，60U～80U限制性内切酶消化过夜后，再于8g/L琼脂糖(宝灵曼产品)凝胶中电泳过夜. 取出凝胶，经酸、碱及中和处理后，于10×SSC溶液中行毛细转印，印迹18h～24h. 印迹后，取出尼龙膜(宝灵曼产品)，于120℃烘烤20min，真空保存备用. ②探针：HBV DNA探针，由EcoRⅠ从pHBV重组质粒中切出，长度3.2kb，为HBV的ayw型，质粒由中山医科大学分子医学中心提供；cyclin D1探针[1]，由EcoRⅠ从pPL-8重组质粒中切出，长度1.4kb，为人cyclin D1 cDNA片段，质粒由美国麻省总医院Arnold博士惠赠；CDK4探针[3]，由BamHⅠ从pcD-PSKJ3重组质粒中切出，长度1.6kb，含人CDK4 cDNA全长，质粒由美国Vanderbilt大学Hanks博士惠赠；β-Actin探针，长度2.0kb，购自北京中山生物技术公司. ③探针标记：探针采用随机引物法标记α-32P-dCTP，试剂盒为Promega产品：标记操作按说明书进行. 标记反应后，离心柱层析法纯化标记探针，经测定估计同位素掺入率60%～70%，探针放射性比度约为2×1014min-1.g-1. ④DNA膜上杂交：取一塑料盒，加入适量的预杂交液(含500g/L甲酰胺)，将已印迹的尼龙膜放入，42℃摇动温育2h. 然后将预杂交好的膜封入杂交袋并加入3.5mL杂交液(含变性标记探针约4.5×108min-1*L-1)，于42℃摇动杂交过夜. 经常规洗膜后，将杂交膜和富士X光片一起装入暗盒，置-70℃曝光4d～9d. ⑤杂交带定量分析：对样本中被检基因和参照基因(β-actin)的杂交带于DU 640紫外分光光度计中进行光密度扫描. 等位基因拷贝数的确定，按文献[4]报道的方式计算.
, 百拇医药
统计学处理 所有的数据分析均采用SPSS for Windows (Release 6.0)统计软件进行分析，采用的统计模块有综合分析模块中的列联表分析、相关分析模块中的双变量相关分析等.
2 结果
2.1 HBV感染状态 用Southern杂交检测了40例肝癌和对应的癌旁组织内的HBV状态，HBV DNA在癌组织内总的阳性率为94.9%(37/39)，HBV DNA的整合率为74.4%(29/39)，整合条带多的达6条，两条以上的占总整合的69%；癌旁肝组织HBV DNA总的阳性率为78.6%，整合HBV DNA为64.3%. 此外，患者外周血中血清HBsAg阳性率为70%(28/40).
2.2 cyclin D1基因状态 本实验检测了40个病例，可供分析的有39例. EcoRⅠ酶切时，cyclin D1产生4.0kb，2.3kb和2.0kb三条带；用HindⅢ酶切产生16.8kb和2.7kb二条带(图1). 39例中有9例cyclin D1扩增，扩增发生率为23.7%(表1). 其中20号病例的cyclin D1既有扩增又有结构变异，即在EcoRⅠ酶切时出现14.4kb，3.8kb和2.1kb三条带，基因扩增量达30倍.
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表1 各种基因变化与临床病理的关系
临床病理
n
cyclin D1/扩增(%)
肝癌总数
40
9/39 (23.7)b
分化程度a
高分化
6
0/5 ( 0.0)
中分化
, 百拇医药
20
3/20 (15.0)
低分化
14
6/13 (46.2)
分裂指数
～1.0
6
1/6 (16.6)
～2.0
19
3/19 (15.8)
>2.0
, 百拇医药
15
5/14 (35.7)
HBV DNA整合a
无
10
0/10 ( 0.0)
有
29
9/27 (33.3)
癌细胞浸润
无
30
, 百拇医药 6/28 (21.4)
有
10
3/10 (30.0)
肿瘤直径
≤5cm
11
0/9 ( 0.0)d
～10cm
20
3/19 (15.8)d
>10cm
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9
6/9 (66.7)d
肝硬变
无
7
3/7 (42.9)
有
33
6/31 (19.4)
HBsAg
阴性
12
1/9 (11.1)
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阳性
28
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bP<0.01，r=0.51，aP<0.05；dP<0.01，r=0.55.
图1 Cyclin D1杂交图. A.基因组DNA由EcoRⅠ消化，20号病例cyclin D1基因重组并扩增；B.基因组DNA由HindⅢ消化，16号病例cyclin D1基因扩增. T.肝癌组织，N.非癌肝组织.
2.3 CDK4的基因状态 用EcoRⅠ酶切基因组DNA时，CDK4基因出现二条杂交带，分别约为12.0kb和6.0kb；用HindⅢ酶切时只出现一条约9.4kb的带. 可供分析的37例肝癌中发现5例癌组织CDK4扩增，扩增频率为13.5%.
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2.4 Cyclin D1与HBV感染及临床病理间的关系 相关分析显示，cyclin D1的扩增与CDK4扩增、HBV DNA整合、肿瘤分化程度和肿瘤大小等之间有相关关系，相关系数r分别为0.51，0.31，0.39和0.55，全部P<0.05. 此外，患者外周血中HBsAg的检出率为70.0%(28/40)，其与癌组织中HBV DNA的相关系数为0.43，与癌内整合HBV DNA的相关系数为0.38，两者均P<0.05. 分析还发现，CDK4扩增的病例全部发生在有HBV DNA整合的病例，无HBV DNA整合的病例无扩增(0/9).
3 讨论
本组患者血清HBsAg阳性率为75.7%，肝癌组织中HBV DNA的总检出率为94.9%，有肝硬变的患者占82.5%. 结果提示，这些肝癌的发生仍主要与HBV感染以及肝硬变有关. 在肝癌组织中，整合的HBV DNA检出率为74.4%，与陈渊卿et al[5]报道的结果相似，提示整合的HBV DNA在肝癌的发生中可能起着重要作用. HBV DNA整合的位点最多可达6个，有2个以上整合位点的病例占总整合例数的69%，提示多位点整合在肝癌的发生中可能有重要作用. 相关分析显示，患者血清HBsAg阳性率与肝癌组织中的整合HBV DNA有相关关系，提示S蛋白的表达可能与整合的HBV DNA有关.
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自从cyclin D1发现后，已有的报道表明该基因涉及到人的许多肿瘤，如食管癌、乳腺癌、肺癌和喉癌等；在肝癌中有11%～13%的病例存在着cyclin D1的扩增，而且其相应的mRNA或蛋白均有过表达[6，7]. 在本次实验中，肝癌中cyclin D1基因有23.7%的病例存在2～30倍的扩增，稍高于国外报道的扩增率，其中扩增倍数最高的一例同时存在着基因重组(图1). 我们用比较基因组杂交法检测了另31例肝癌，其中11号染色体长臂(11q)的扩增率为16.1%，与位于11q的cyclin D1的扩增率相近，两者结果相互印证. 相关分析显示，cyclin D1的扩增与肿瘤分化程度、肿瘤大小等有正相关关系，这表明cyclin D1的作用主要是促进肝癌的发展、演进和恶化，这与Nishida et al[7]报道的cyclin D1扩增全部发生在第Ⅳ期和肿块在5cm以上的肝癌相似. 从最近的报道来看cyclin D1的这种作用已得到体外研究的印证，如Uchimaru et al[8]报道单独转染cyclin D1或者与ras或p53共同转染不能使细胞转化，但cyclin D1的转染能提高ras与p53共同转染所致的细胞转化效率并能减少细胞生长对血清的依赖性，当转化细胞注射到裸鼠体内时移植物生长得更快. 本次实验还显示，9例cyclin D1扩增全部发生在有HBV DNA整合的病例，相关分析显示两者之间有相关关系. Wang et al[9]报道过一例肝癌中的HBV DNA整合于cyclin A基因中. 本次实验中，20号病例的cyclin D1既扩增又有结构重组，而且其癌组织中有4条HBV DNA整合带. 因此，cyclin D1的扩增与重组是否与HBV DNA整合在其附近有关，值得探讨.
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CDK4基因的变异已涉及到许多肿瘤，但有关其在肝癌中状态的研究甚少，迄今只检索到Kita et al[10]发表过一篇有关报道，其中提到CDK4在肝癌中没有变化. 在本次实验中，Southern blot检出5例肝癌组织中CDK4有扩增，扩增率为13.5%，这显示CDK4在我国部分肝癌的发生发展中起着一定的作用. 所有CDK4扩增病例的肝癌组织中全部有HBV DNA的整合，患者的血清中也全部存在HBsAg，提示CDK4的扩增可能与HBV DNA的整合或HBV感染有关.
相关分析显示，本实验中CDK4的扩增与cyclin D1的扩增有相关关系，这可能与基因扩增引起过表达的CDK4蛋白须和过表达的cyclin D1蛋白形成复合物才能发挥抑制RB蛋白的作用有关. 此外，人肝癌中这两者的扩增都是发生在有HBV DNA整合的病例，提示两者的扩增与整合的HBV DNA之间可能有关联作用.
作者简介：王辉云，男，1958-12-26生，湖南省衡阳市人，汉族. 1982年衡阳医学院医疗专业本科毕业，1997年中山医科大学博士，助理研究员，主要从事原发性肝癌和鼻咽癌的研究，发表论文14篇，获广东省科技进步三等奖2次.
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*国家教委博士学科点专项科研基金，No.94156和广东省自然科学基金，No.940222.
通讯作者 王辉云，510060，中山医科大学肿瘤研究所，广东省广州市东风东路651号.
*Supported by Scientific Research Foundation of National Education Committee, No.94156 and Guangdong Province Natural Science Foundation No.940222.
Correspondence to:Dr. WANG Hui-Yun, Cancer Institute, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, 651 Dongfeng Donglu, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China
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E-mail. wangh@gzsums. edu. cn
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收稿日期 1998-08-04, 百拇医药