人血管抑素基因工程菌发酵条件的初步研究
作者：卢文菊 罗进贤 何建国 张添元
单位：卢文菊(广州医学院检验系，广州 510182)；罗进贤(中山大学生命科学学院，广州 510275)；何建国(中山大学生命科学学院，广州 510275)；张添元(中山大学生命科学学院，广州 510275)
关键词：人血管抑素；基因表达；大肠杆菌；发酵
广州医学院学报000301
提要 目的：探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组人血管抑素(rhAGN)的影响。方法：应用摇瓶和发酵罐发酵试验观察不同诱导时机和诱导时间以及pH、通气量等对rhAGN表达量的影响。结果：(1)工程菌E.coli DH5α(pBVA2)在30℃培养至A600nm为0.3～0.5时于42℃诱导4 hrhAGN表达量最高，约为212mg/L；(2)15 L发酵罐发酵参数为pH7.2，搅拌转速500r/min,通气量4～8L/min，溶氧50%时，rhAGN表达量提高到276mg/L。结论：确定了最适诱导时机和诱导时间，通过调节pH和改善通气，初步形成了一套高表达rhAGN的发酵工艺。
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中图分类号 Q786 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0001-03
Studies on Fermentation Conditions of Genetically Engineered
Escherichial Coli for Recombinant Human Angiostatin
Lu Wenju
(Dept. of Laborotory,Guangzhou Mediczal College,Guangzhou 510182)
Luo Jinxian He Jianguo et al
(School of Life Sciences,Zhongshan University,Guangzhou 510275)
, 百拇医药
Objective:To investigate the effects of fermentation conditions on the producti on of recombinant human angiostatin (rhAGN)by genetically engineered E.coli. Meth ods:The effects of different cell growth phases for induction,different inducing period,pH and air-flow on rhAGN production were observed using shaking flask a nd fermentor respectively.Results:When induced at 42℃ for 4 hours after the cul tivation of E.coli DH5α(pBVA2) in shaking flask reached to A600nm≈0.3～0 .5 at 30℃,the yield of rhAGN reached to the highest level of 212mg/ml. When cul tivated in a 15l fermentor at 30℃ ,with pH of 7.2,rotation rate of 500r/min,air-flow of 4～6L/min and soluble oxygen sa tu ration of 50%,for the engineered bacteria to reach to A600nm≈0.5 and then induced at 42℃ for another 4 hours,the yield of rhAGN was 276mg/L.Conclusion: The optimal growth phase for induction and the inducing period were determined.Through the e ffective controll of the technical parameters,the yield of rhAGN in a fermentor was increased to a higher level than that in a shaking flask.
, 百拇医药
Key words Human angiostatin;Gene expression;Escherichia coli;Fermentation
血管抑素(Angiostatin,简称AGN)是1994年发现的一种强血管生成抑制因子，能抑制多种类型肿瘤的生长和转移，有可能发展成为一种新型抗癌药物[1，2]；同时，AGN对于控制糖尿病视网膜病变、消化道溃疡、关节炎等疾病的病理性血管生成也有重要的应用前景。本课题组在以前的工作中完成了AGN(Human angiostatin,hAGN)cDNA的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达，活性实验证明表达产物具有抗血管生成和抗肿瘤功能[3]。本文报道通过优化部分发酵条件，提高了重组人血管抑素(Recombinant human angiostatin rhAGN)在大肠杆菌工程菌中的表达量。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 菌种 温控型大肠杆菌工程菌DH5α(pBVA2)为本室构建[3]，保存于-20℃、30%甘油中。
1.2 试剂和培养基 酵母提取物和蛋白胨均为OXIOD公司产品，余为国产分析纯试剂。LB培养基含蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L,pH7.2。
1.3 菌种筛选 用接种环划线接种甘油管中菌种于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，30℃培养过夜，挑取单菌落接种于5mL LB培养基中，30℃培养到A600nm为0.3～1.0，取1ml菌液于另一试管中42℃水浴振荡培养3～8h，离心收集菌体，SDS-PAGE分析选用表达量最高的克隆作为发酵用种子。
1.4 生长曲线的绘制 将E.coli DH5α(pBVA2)过夜培养物以5%接种于LB培养基中，30℃振摇培养0～5h，每隔30min取样测定A600nm，绘制生长曲线。
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1.5 发酵罐发酵 采用法国B.Braun公司的Biostat C型15 L发酵罐，操作按说明书进行，发酵总体积为10L。①种子培养：接种工程菌单菌落于10ml含100μg/mL Amp的LB培养液中，30℃振荡培养过夜进行活化。按1%接种量将活化菌转移至500mL三角瓶中(每瓶盛250mL LB,含Amp 50μg/mL),30℃、200r/min振荡培养12h，作为种子液。②培养液为LB(9.5L)，加数滴食用油作为防泡剂，在120℃灭菌20min后，冷却至30℃，加Amp 1.0g，接种子液500mL。③发酵参数：PH7.2，搅拌转速500r/min，通气量4～8L/min，溶氧50%。
1.6 菌体生长的测量 菌体生长以吸光度表示。发酵液稀释后，以培养基为对照，于波长600nm测吸光度，线性范围0.1～0.8。
1.7 重组质粒稳定性测定 工程菌发酵过程中，每隔一定时间取样，稀释后涂LB平板，培养12～16h后，从中随机挑100个菌落点在含100μg/mL Amp的LB平板上，培养过夜，根据菌落数目计算百分率，以此表示重组质粒稳定性。
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1.8 SDS-PAGE 按文献[4]的方法。
2 结果
2.1 摇瓶发酵试验
2.1.1 诱导时机对rhAGN表达量的影响
大肠杆菌工程菌的温度诱导一般在对数生长期进行。按1.4的方法测定E.coli DH5α(pBVA2)在LB培养基中30℃时生长与培养时间的关系，绘制生长曲线，结果见图1。从图中判断，当A600nm在0.3～3.0之间时为该工程菌的对数生长期。
图1 E.coli DH5α(pBVA2)的生长曲线
将E.coli DH5α(pBVA2)于30℃培养至对数生长期，升温至42℃诱导4h，取样进行SDS-PAGE分析，图2结果表明：A600nm为0.3、0.4和0.5时诱导rhAGN有较高的表达量，在A600nm为0.6、0.7、0.8、1.0时诱导表达量依次下降。从而确定E.coli DH5α(pBVA2)的最佳诱导时机在A600nm为0.3～0.5之间，即对数生长早期。
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2.1.2 诱导时间对rhAGN表达量的影响
将E.coli DH5α(pBVA2)于30℃振摇培养至A600nm≈0.4时，转移至42℃诱导表达，分别在诱导后3～8h每间隔1h取样进行SDS-PAGE分析，图3的结果显示：诱导3h时rhAGN已有明显的表达，诱导4h表达量最高，诱导5～8h依次下降。说明E.coli DH5α(pBVA2)最适诱导时间是4h左右，凝胶扫描结合菌体总蛋白含量测定，计算rhAGN表达量约为212mg/L。
图2 不同生长时期诱导对rhAGN表达量的影响
1.未诱导：2～8分别示A600nm为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0时诱导；9蛋白分子量标准
, 百拇医药
图3 不同诱导时间对rhAGN表达量的影响
1.蛋白分子量标准：2.未诱导；
3～8分别示诱导3h、4h、5h、6h、7h和8h
2.2 15L罐发酵试验
按1.5的方法将E.coli DH5α(pBVA2)于30℃发酵至A600nm≈0.5时，升温至42℃诱导4h完成发酵，离心收集菌体。共进行了3次发酵试验(见表1)，平均产菌量为58±3g,rhAGN表达量为276±12mg/L。
表1 罐发酵的产菌量及rhAGN表达量 发酵批次
菌体湿重(g)
表达量(mg/L)
, 百拇医药
1
55
263
2
61
287
3
58
279
2.3 发酵过程中质粒稳定性检测
按1.7的方法检测E.coli DH5α(pBVA2)在发酵罐发酵培养过程中重组质粒pBVA2的稳定性，结果均为100%，证明在大规模培养时该工程菌非常稳定，适于工业化生产。
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3 讨论
外源基因在大肠杆菌中的高水平表达，不仅决定于基因、载体和宿主三者间的相互关系，而且受到诱导条件及工程菌所处的外部环境条件如培养基类型、pH值、通气量等的影响[5]。在探讨rhAGN的发酵条件中我们选用了LB培养基，其营养丰富，但富含生理碱性物质，在培养过程中随着酸性养分的利用使培养基逐渐变碱，pH值升高达8.0以上。工程大肠杆菌生长的最适pH在6.8～7.2范围，高pH则会抑制细菌生长。溶氧也可直接和间接地影响细菌的生长和代谢，溶氧过低会造成细菌生长缓慢，溶氧过高会对细菌产生毒性。在使用摇瓶发酵时溶氧和pH都不便控制，溶氧不足和pH过高成为工程菌生长和重组蛋白表达的限制因素，rhAGN表达量相对较低。在发酵罐发酵时，通过自动改善通气，使溶氧维持在50%左右，同时通过补充酸控制培养基pH值在7.2左右，使细菌保持了良好的生长和代谢状态，这可能是rhAGN表达量得以提高的重要因素。
本研究确定了rhAGN大肠杆菌工程菌的最适诱导时机和诱导时间，并初步分析了pH值、通气量等因素对rhAGN表达量的影响，为进一步探索其高密度高表达发酵工艺奠定了基础。
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基金项目：国家自然科学基金(39670013)和广东省自然科学基金(960052)资助项目
作者简介：卢文菊(1969-)，女，博士，讲师。研究方向：分子生物学研究
参考文献
[1]O'Reilly MS,Holmgren L.Shing Y,et al.Angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma[J].Cell,1994;79:315～328
[2]O'Reilly MS,Holmgren L,Chen C,et al.Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice[J].Nature Medicine,1996;2:689～692
, 百拇医药
[3]Luo Jinxian,Lu Wenju,Li Wenqing, et al.Cloning,sequencing of human angiostatin gene and its expression in E.[J]Coli.Progress in Natural Science,1999;9(9):672～677
[4]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis TJ.Molecular Cloning,A Laboratory Mannual[M].2ndEd.New York,Cold Spring Habor Lab.1994
[5]李会成，李文辉，郭军等.基因工程菌的发酵研究[J].1997；17(2)：40～43
(收稿：2000-04-30), 百拇医药
单位：卢文菊(广州医学院检验系，广州 510182)；罗进贤(中山大学生命科学学院，广州 510275)；何建国(中山大学生命科学学院，广州 510275)；张添元(中山大学生命科学学院，广州 510275)
关键词：人血管抑素；基因表达；大肠杆菌；发酵
广州医学院学报000301
提要 目的：探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组人血管抑素(rhAGN)的影响。方法：应用摇瓶和发酵罐发酵试验观察不同诱导时机和诱导时间以及pH、通气量等对rhAGN表达量的影响。结果：(1)工程菌E.coli DH5α(pBVA2)在30℃培养至A600nm为0.3～0.5时于42℃诱导4 hrhAGN表达量最高，约为212mg/L；(2)15 L发酵罐发酵参数为pH7.2，搅拌转速500r/min,通气量4～8L/min，溶氧50%时，rhAGN表达量提高到276mg/L。结论：确定了最适诱导时机和诱导时间，通过调节pH和改善通气，初步形成了一套高表达rhAGN的发酵工艺。
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中图分类号 Q786 文献标识码：A 文章编号：1008-1836(2000)03-0001-03
Studies on Fermentation Conditions of Genetically Engineered
Escherichial Coli for Recombinant Human Angiostatin
Lu Wenju
(Dept. of Laborotory,Guangzhou Mediczal College,Guangzhou 510182)
Luo Jinxian He Jianguo et al
(School of Life Sciences,Zhongshan University,Guangzhou 510275)
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Objective:To investigate the effects of fermentation conditions on the producti on of recombinant human angiostatin (rhAGN)by genetically engineered E.coli. Meth ods:The effects of different cell growth phases for induction,different inducing period,pH and air-flow on rhAGN production were observed using shaking flask a nd fermentor respectively.Results:When induced at 42℃ for 4 hours after the cul tivation of E.coli DH5α(pBVA2) in shaking flask reached to A600nm≈0.3～0 .5 at 30℃,the yield of rhAGN reached to the highest level of 212mg/ml. When cul tivated in a 15l fermentor at 30℃ ,with pH of 7.2,rotation rate of 500r/min,air-flow of 4～6L/min and soluble oxygen sa tu ration of 50%,for the engineered bacteria to reach to A600nm≈0.5 and then induced at 42℃ for another 4 hours,the yield of rhAGN was 276mg/L.Conclusion: The optimal growth phase for induction and the inducing period were determined.Through the e ffective controll of the technical parameters,the yield of rhAGN in a fermentor was increased to a higher level than that in a shaking flask.
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Key words Human angiostatin;Gene expression;Escherichia coli;Fermentation
血管抑素(Angiostatin,简称AGN)是1994年发现的一种强血管生成抑制因子，能抑制多种类型肿瘤的生长和转移，有可能发展成为一种新型抗癌药物[1，2]；同时，AGN对于控制糖尿病视网膜病变、消化道溃疡、关节炎等疾病的病理性血管生成也有重要的应用前景。本课题组在以前的工作中完成了AGN(Human angiostatin,hAGN)cDNA的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达，活性实验证明表达产物具有抗血管生成和抗肿瘤功能[3]。本文报道通过优化部分发酵条件，提高了重组人血管抑素(Recombinant human angiostatin rhAGN)在大肠杆菌工程菌中的表达量。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 菌种 温控型大肠杆菌工程菌DH5α(pBVA2)为本室构建[3]，保存于-20℃、30%甘油中。
1.2 试剂和培养基 酵母提取物和蛋白胨均为OXIOD公司产品，余为国产分析纯试剂。LB培养基含蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L,pH7.2。
1.3 菌种筛选 用接种环划线接种甘油管中菌种于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，30℃培养过夜，挑取单菌落接种于5mL LB培养基中，30℃培养到A600nm为0.3～1.0，取1ml菌液于另一试管中42℃水浴振荡培养3～8h，离心收集菌体，SDS-PAGE分析选用表达量最高的克隆作为发酵用种子。
1.4 生长曲线的绘制 将E.coli DH5α(pBVA2)过夜培养物以5%接种于LB培养基中，30℃振摇培养0～5h，每隔30min取样测定A600nm，绘制生长曲线。
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1.5 发酵罐发酵 采用法国B.Braun公司的Biostat C型15 L发酵罐，操作按说明书进行，发酵总体积为10L。①种子培养：接种工程菌单菌落于10ml含100μg/mL Amp的LB培养液中，30℃振荡培养过夜进行活化。按1%接种量将活化菌转移至500mL三角瓶中(每瓶盛250mL LB,含Amp 50μg/mL),30℃、200r/min振荡培养12h，作为种子液。②培养液为LB(9.5L)，加数滴食用油作为防泡剂，在120℃灭菌20min后，冷却至30℃，加Amp 1.0g，接种子液500mL。③发酵参数：PH7.2，搅拌转速500r/min，通气量4～8L/min，溶氧50%。
1.6 菌体生长的测量 菌体生长以吸光度表示。发酵液稀释后，以培养基为对照，于波长600nm测吸光度，线性范围0.1～0.8。
1.7 重组质粒稳定性测定 工程菌发酵过程中，每隔一定时间取样，稀释后涂LB平板，培养12～16h后，从中随机挑100个菌落点在含100μg/mL Amp的LB平板上，培养过夜，根据菌落数目计算百分率，以此表示重组质粒稳定性。
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1.8 SDS-PAGE 按文献[4]的方法。
2 结果
2.1 摇瓶发酵试验
2.1.1 诱导时机对rhAGN表达量的影响
大肠杆菌工程菌的温度诱导一般在对数生长期进行。按1.4的方法测定E.coli DH5α(pBVA2)在LB培养基中30℃时生长与培养时间的关系，绘制生长曲线，结果见图1。从图中判断，当A600nm在0.3～3.0之间时为该工程菌的对数生长期。
图1 E.coli DH5α(pBVA2)的生长曲线
将E.coli DH5α(pBVA2)于30℃培养至对数生长期，升温至42℃诱导4h，取样进行SDS-PAGE分析，图2结果表明：A600nm为0.3、0.4和0.5时诱导rhAGN有较高的表达量，在A600nm为0.6、0.7、0.8、1.0时诱导表达量依次下降。从而确定E.coli DH5α(pBVA2)的最佳诱导时机在A600nm为0.3～0.5之间，即对数生长早期。
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2.1.2 诱导时间对rhAGN表达量的影响
将E.coli DH5α(pBVA2)于30℃振摇培养至A600nm≈0.4时，转移至42℃诱导表达，分别在诱导后3～8h每间隔1h取样进行SDS-PAGE分析，图3的结果显示：诱导3h时rhAGN已有明显的表达，诱导4h表达量最高，诱导5～8h依次下降。说明E.coli DH5α(pBVA2)最适诱导时间是4h左右，凝胶扫描结合菌体总蛋白含量测定，计算rhAGN表达量约为212mg/L。
图2 不同生长时期诱导对rhAGN表达量的影响
1.未诱导：2～8分别示A600nm为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0时诱导；9蛋白分子量标准
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图3 不同诱导时间对rhAGN表达量的影响
1.蛋白分子量标准：2.未诱导；
3～8分别示诱导3h、4h、5h、6h、7h和8h
2.2 15L罐发酵试验
按1.5的方法将E.coli DH5α(pBVA2)于30℃发酵至A600nm≈0.5时，升温至42℃诱导4h完成发酵，离心收集菌体。共进行了3次发酵试验(见表1)，平均产菌量为58±3g,rhAGN表达量为276±12mg/L。
表1 罐发酵的产菌量及rhAGN表达量 发酵批次
菌体湿重(g)
表达量(mg/L)
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1
55
263
2
61
287
3
58
279
2.3 发酵过程中质粒稳定性检测
按1.7的方法检测E.coli DH5α(pBVA2)在发酵罐发酵培养过程中重组质粒pBVA2的稳定性，结果均为100%，证明在大规模培养时该工程菌非常稳定，适于工业化生产。
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3 讨论
外源基因在大肠杆菌中的高水平表达，不仅决定于基因、载体和宿主三者间的相互关系，而且受到诱导条件及工程菌所处的外部环境条件如培养基类型、pH值、通气量等的影响[5]。在探讨rhAGN的发酵条件中我们选用了LB培养基，其营养丰富，但富含生理碱性物质，在培养过程中随着酸性养分的利用使培养基逐渐变碱，pH值升高达8.0以上。工程大肠杆菌生长的最适pH在6.8～7.2范围，高pH则会抑制细菌生长。溶氧也可直接和间接地影响细菌的生长和代谢，溶氧过低会造成细菌生长缓慢，溶氧过高会对细菌产生毒性。在使用摇瓶发酵时溶氧和pH都不便控制，溶氧不足和pH过高成为工程菌生长和重组蛋白表达的限制因素，rhAGN表达量相对较低。在发酵罐发酵时，通过自动改善通气，使溶氧维持在50%左右，同时通过补充酸控制培养基pH值在7.2左右，使细菌保持了良好的生长和代谢状态，这可能是rhAGN表达量得以提高的重要因素。
本研究确定了rhAGN大肠杆菌工程菌的最适诱导时机和诱导时间，并初步分析了pH值、通气量等因素对rhAGN表达量的影响，为进一步探索其高密度高表达发酵工艺奠定了基础。
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基金项目：国家自然科学基金(39670013)和广东省自然科学基金(960052)资助项目
作者简介：卢文菊(1969-)，女，博士，讲师。研究方向：分子生物学研究
参考文献
[1]O'Reilly MS,Holmgren L.Shing Y,et al.Angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma[J].Cell,1994;79:315～328
[2]O'Reilly MS,Holmgren L,Chen C,et al.Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice[J].Nature Medicine,1996;2:689～692
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[3]Luo Jinxian,Lu Wenju,Li Wenqing, et al.Cloning,sequencing of human angiostatin gene and its expression in E.[J]Coli.Progress in Natural Science,1999;9(9):672～677
[4]Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis TJ.Molecular Cloning,A Laboratory Mannual[M].2ndEd.New York,Cold Spring Habor Lab.1994
[5]李会成，李文辉，郭军等.基因工程菌的发酵研究[J].1997；17(2)：40～43
(收稿：2000-04-30), 百拇医药