KAI1和nm23与人黑色素瘤细胞转移潜能的相关性
作者：李珊珊 方伟岗 任秀花 闫爱华 沈琼
单位：李珊珊(河南医科大学第一附属医院病理科,河南省肿瘤病理学重点实验室 郑州450052)；方伟岗(北京医科大学病理系 北京 100083)；闫爱华 任秀花 沈琼(河南医科大学癌前期研究室 郑州 450052)
关键词：基因，抑制，肿瘤转移；黑色素瘤；KAI1基因；nm23基因
河南医科大学学报000205摘 要：目的：探讨肿瘤转移抑制基因KAI1和nm23与人黑色素瘤细胞转移潜能的关系。方法：应用Northern blot杂交检测不同转移潜能人黑色素瘤细胞中KAI1和nm23基因的表达。结果：4种不同转移潜能的人黑色素瘤细胞中(WM35,WM451，WM983a,WM1341b)，KAI1 mRNA和nm23 mRNA均有表达且表达量基本一致，KAI1在4种细胞中的积分光密度值分别为0.1798,0.1800,0.1501,0.1582；nm23分别为1.0428,1.0607,1.0141,1.0754。结论：KAI1基因与nm23基因的表达降低与人黑色素瘤的浸润转移无关。
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分类号：R739.5
Study on correlation of KAI1 and nm23 expressions with human melanoma metastasis
LI Shanshan
(Department of Pathology,the First Affiliated Hospital,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
FANG Weigang
(Department of Pathology,Beijing Medical University,Beijing 100083)
REN Xiuhua,YAN Aihua,SHEN Qiong
, http://www.100md.com
(Department of Precancerous Studies,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
Abstract：Aim:To investigate the correlation of tumor metastasis suppressor gene KAI1,nm23 with metastatic potential of human melanoma cell lines.Methods:Expressions of KAI1 gene and nm23 gene in human melanoma cell lines with different metastasis potential were studied by Northern blot hybridization.Results:KAI1 mRNA and nm23 mRNA all expressed in four human melanoma cell lines (WM35,WM451,WM983a,WM1341b) and no difference in expression levels were observed in these cancer cell lines(integral light density values in KAI1 gene are 0.1798,0.1800,0.1501,0.1582 respectively and in nm23 gene are 1.0428,1.0607,1.0141,1.0754 respectively).Conclusion:Reduced KAI1 and nm23 expressions may be no association with enhanced potential in human melanoma cells.
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Key words：neoplasm metastasis;gene,suppressor,neoplasm;KAI1;nm23▲
KAI1基因是最近发现的一个新的肿瘤转移抑制基因，它的转移抑制作用已被证实[1]。另一个肿瘤转移抑制基因nm23是在1988年被报道的[2]，人们已经发现它的低表达与多种肿瘤转移的发生有关。作者观察了不同转移潜能人黑色素瘤细胞中KAI1和nm23基因的表达，探讨这两个肿瘤转移抑制基因在人黑色素瘤的浸润转移过程中所起的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞系 WM35：人黑色素瘤早期瘤株(来自辐射生长期)，无转移能力。WM1341b：人黑色素瘤早期垂直生长期瘤株。WM983a：人黑色素瘤进展期瘤株(来自晚期垂直生长期)。WM451：人黑色素瘤远处转移瘤株，具有高转移性。以上4种细胞系来自北京医科大学病理系。
, 百拇医药
1.2 细胞培养 采用含体积分数15%小牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃，体积分数5% CO2及恒定相对湿度条件下培养。
1.3 细胞总RNA的提取 取对数生长期细胞，PBS洗两遍。按异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA[3]。按每瓶细胞(100 ml)加入裂解液(4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠，5 g/L Sarcosyl，0.1 mol/L α-巯基乙醇)裂解细胞，再依次加入0.1 ml的2 mol/L乙酸钠(pH 4.0)混匀，1 ml水饱和酚，0.2 ml氯仿-异戊醇(体积比49∶1)，混匀，震荡10 min。4 ℃ 12 000 r/min离心20 min。取水相，加入等体积异丙醇，-20 ℃过夜。离心，弃上清，以裂解液重新溶解沉淀，加等体积异丙醇，-20 ℃ 1 h，离心。沉淀用体积分数75%乙醇洗，然后将沉淀RNA溶于DEPC水，-70 ℃保存备用。
1.4 Northern blot杂交 RNA上样量为20 μg，以12 g/L甲醛变性凝胶进行电泳，转膜。制备探针：质粒，PCMV.KAI1(美国国立卫生研究院提供)；PNM23-H1cDNA重组质粒(北京医科大学病理系提供)。以PCR法(聚合酶链反应)扩增质粒目的基因。KAI1引物：上游，5'-AGTCCTCCCTGCTGCTGTGTG-3'，下游，5'-TCAGTCAGGGTGGGCAAGAGG-3'(扩增片段为1030 bp)；nm23引物：上游，5'-TTGAGCGTACCTCCATTGCGATC-3'，下游，5'-TTTGCACTCTCCACAGAATCACT-3'(扩增片段为366 bp)。以随机引物法标记探针(α-32P-dCTP标记目的基因片段)。同样方法制备β-actin探针。杂交：68 ℃预杂交(预杂交液：0.5 mol/L Na2HPO4,70 g/L SDS,1 mmol/L EDTA)30 min。将已标记探针变性后，加入杂交袋中，混匀。于68 ℃杂交20 h。洗膜，室温晾干，压X光片，-20 ℃放射自显影14 d。观察Northern blot杂交结果。
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2 结果
2.1 KAI1 mRNA在4种人黑色素瘤细胞中的表达
KAI1基因Northern blots杂交结果见图1。图1a为KAI1 mRNA在4种不同转移潜能人黑色素瘤细胞中的表达。图1b为β-actin在4种细胞系中的表达。图1显示KAI1 mRNA在4种人黑色素瘤细胞中均有表达。将KAI1与β-actin杂交信号进行光密度分析，计算它们之间的比值，以降低细胞之间的误差。积分光密度值WM35，0.179 8；WM451，0.180 0；WM983a，0.150 1；WM1341b，0.158 2。
图1 4种人黑色素瘤细胞中KAI1的Nothern blot杂交结果
a：KAI1基因； b：β-actin内参照
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1：WM35； 2：WM451； 3：WM983a； 4.WM1341b
2.2 nm23 mRNA在4种人黑色素瘤细胞中的表达
nm23基因Northern blot杂交结果见图2。图2a为nm23 mRNA在WM35，WM451，WM983a，WM1341b中的表达。图2b为β-actin在这4种细胞中的表达。由图2可见nm23 mRNA在4种人黑色素瘤细胞中均有表达。计算nm23与β-actin之间的光密度比值。4种黑色素瘤细胞的积分光密度比值分别是1.0428,1.0607,1.0141,1.0754，其表达量无明显差异。
图2 4种人黑色素瘤细胞中nm23的Nothern blot杂交结果
a：nm23基因； b：β-actin内参照
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1：WM35； 2：WM451； 3：WM983a； 4：WM1341b
3 讨论
癌转移的发生涉及到多种分子遗传学改变。目前对于转移抑制基因的研究已获得了较快的进展，并得到公认。KAI1和nm23基因是两个已被证实的肿瘤转移抑制基因，它们的表达降低与某些肿瘤发展与转移有关[4～8] 。已有报道KAI1和nm23与鼠黑色素瘤的转移抑制相关[2，9,10]。
作者的研究结果显示：KAI1 mRNA在WM35,WM1341b,WM983a,WM451 4种不同转移潜能的人黑色素瘤细胞中均有表达。其积分光密度值无明显差异。这一结果提示，KAI1基因可能不是抑制人黑色素瘤转移发生的主导基因。本研究结果与Takaoka等[9]和White等[10]的结果不一致。造成这种分歧的原因可能与所采用的研究对象不同有关。Takaoka等研究中采用的B16-BL6为鼠的黑色素瘤细胞系，White等研究小组使用的NZM系列亦为鼠类。由于种属的不同，基因所起的作用可能也有差异。
, 百拇医药
nm23 mRNA在4种人黑色素瘤细胞中均有表达，且其表达量也基本一致。nm23基因最初是从鼠的黑色素瘤细胞株中分离出来的一种肿瘤转移抑制基因，它在低转移细胞株中的表达强度是高转移细胞株中的10倍[2]。然而本研究中所采用的人黑色素瘤细胞未能显示nm23与转移潜能的关系。因此认为nm23基因与人黑色素瘤的转移抑制无关。由此可见：KAI1和nm23基因除了具有组织特异性之外，还具有种属特异性，它们在不同种属的动物身上所表现出的作用可以是不同的。KAI1和nm23基因在鼠类黑色素瘤的转移抑制作用未能在人类黑色素瘤细胞得到证实，人类黑色素瘤的转移抑制不受KAI1和nm23基因的控制。它们不是人黑色素瘤的转移抑制基因，其转移抑制作用可能受到其它基因的调节。
基金项目：博士研究生课题
参考文献：
[1]Dong JT,Lamb PW,Rinker-Schaeffer CW,et al.KAI1,a metastasis suppressor gene for prostate cancer on human chromosome 11p11.2.Science,1995,268:884
, http://www.100md.com
[2]Steeg PS,Bevilacqua G,Pozzatti R,et al.Altered expression of nm23,a gene associated with low tumor metastatic potential in adenovirus 2 Ela inhibition of experimental metastasis.Cancer Res,1988,48:6 550
[3]Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Analytical Biochem,1987,162:156
[4]李珊珊，方伟岗，钟镐镐，等.肿瘤转移抑制基因KAI1在不同转移潜能人癌细胞中的表达.中华医学杂志，1999,(9),708
, 百拇医药
[5]Friess H,Guo XZ,Berberat P,et al.Reduced KAI1 expression in pancreatic cancer is associated with lymph node and distant metastases.Int J Cancer,1998,79:349
[6]Yang X,Welch DR,Phillips KK,et al.KAI1,a putative marker for metastatic potential in human breast cancer.Cancer Lett,1997,119:149
[7]Royds JA,Stephenson TJ,Rees RC,et al.nm23 protein expression in ductal in situ and invasive human breast carcinoma.J Natl Cancer Inst,1993,85:727
, 百拇医药
[8]Editorial.nm23-A metastasis suppressor gene? J Pathol,1994,173:211
[9]Takaoka A,Hinoda Y,Sato S,et al.Reduced invasive and metastatic potentials of KAI1-transfected melanoma cells.Jpn J Cancer Res,1998,89:397
[10]White A,Lamb PW,Barrett JC.Frequent downregulation of the KAI1(CD82) metastasis suppressor protein in human cancer cell lines.Oncogene,1998,16:3 143
(收稿日期：1999-12-25), 百拇医药
单位：李珊珊(河南医科大学第一附属医院病理科,河南省肿瘤病理学重点实验室 郑州450052)；方伟岗(北京医科大学病理系 北京 100083)；闫爱华 任秀花 沈琼(河南医科大学癌前期研究室 郑州 450052)
关键词：基因，抑制，肿瘤转移；黑色素瘤；KAI1基因；nm23基因
河南医科大学学报000205摘 要：目的：探讨肿瘤转移抑制基因KAI1和nm23与人黑色素瘤细胞转移潜能的关系。方法：应用Northern blot杂交检测不同转移潜能人黑色素瘤细胞中KAI1和nm23基因的表达。结果：4种不同转移潜能的人黑色素瘤细胞中(WM35,WM451，WM983a,WM1341b)，KAI1 mRNA和nm23 mRNA均有表达且表达量基本一致，KAI1在4种细胞中的积分光密度值分别为0.1798,0.1800,0.1501,0.1582；nm23分别为1.0428,1.0607,1.0141,1.0754。结论：KAI1基因与nm23基因的表达降低与人黑色素瘤的浸润转移无关。
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分类号：R739.5
Study on correlation of KAI1 and nm23 expressions with human melanoma metastasis
LI Shanshan
(Department of Pathology,the First Affiliated Hospital,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
FANG Weigang
(Department of Pathology,Beijing Medical University,Beijing 100083)
REN Xiuhua,YAN Aihua,SHEN Qiong
, http://www.100md.com
(Department of Precancerous Studies,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
Abstract：Aim:To investigate the correlation of tumor metastasis suppressor gene KAI1,nm23 with metastatic potential of human melanoma cell lines.Methods:Expressions of KAI1 gene and nm23 gene in human melanoma cell lines with different metastasis potential were studied by Northern blot hybridization.Results:KAI1 mRNA and nm23 mRNA all expressed in four human melanoma cell lines (WM35,WM451,WM983a,WM1341b) and no difference in expression levels were observed in these cancer cell lines(integral light density values in KAI1 gene are 0.1798,0.1800,0.1501,0.1582 respectively and in nm23 gene are 1.0428,1.0607,1.0141,1.0754 respectively).Conclusion:Reduced KAI1 and nm23 expressions may be no association with enhanced potential in human melanoma cells.
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Key words：neoplasm metastasis;gene,suppressor,neoplasm;KAI1;nm23▲
KAI1基因是最近发现的一个新的肿瘤转移抑制基因，它的转移抑制作用已被证实[1]。另一个肿瘤转移抑制基因nm23是在1988年被报道的[2]，人们已经发现它的低表达与多种肿瘤转移的发生有关。作者观察了不同转移潜能人黑色素瘤细胞中KAI1和nm23基因的表达，探讨这两个肿瘤转移抑制基因在人黑色素瘤的浸润转移过程中所起的作用。
1 材料与方法
1.1 细胞系 WM35：人黑色素瘤早期瘤株(来自辐射生长期)，无转移能力。WM1341b：人黑色素瘤早期垂直生长期瘤株。WM983a：人黑色素瘤进展期瘤株(来自晚期垂直生长期)。WM451：人黑色素瘤远处转移瘤株，具有高转移性。以上4种细胞系来自北京医科大学病理系。
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1.2 细胞培养 采用含体积分数15%小牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃，体积分数5% CO2及恒定相对湿度条件下培养。
1.3 细胞总RNA的提取 取对数生长期细胞，PBS洗两遍。按异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA[3]。按每瓶细胞(100 ml)加入裂解液(4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠，5 g/L Sarcosyl，0.1 mol/L α-巯基乙醇)裂解细胞，再依次加入0.1 ml的2 mol/L乙酸钠(pH 4.0)混匀，1 ml水饱和酚，0.2 ml氯仿-异戊醇(体积比49∶1)，混匀，震荡10 min。4 ℃ 12 000 r/min离心20 min。取水相，加入等体积异丙醇，-20 ℃过夜。离心，弃上清，以裂解液重新溶解沉淀，加等体积异丙醇，-20 ℃ 1 h，离心。沉淀用体积分数75%乙醇洗，然后将沉淀RNA溶于DEPC水，-70 ℃保存备用。
1.4 Northern blot杂交 RNA上样量为20 μg，以12 g/L甲醛变性凝胶进行电泳，转膜。制备探针：质粒，PCMV.KAI1(美国国立卫生研究院提供)；PNM23-H1cDNA重组质粒(北京医科大学病理系提供)。以PCR法(聚合酶链反应)扩增质粒目的基因。KAI1引物：上游，5'-AGTCCTCCCTGCTGCTGTGTG-3'，下游，5'-TCAGTCAGGGTGGGCAAGAGG-3'(扩增片段为1030 bp)；nm23引物：上游，5'-TTGAGCGTACCTCCATTGCGATC-3'，下游，5'-TTTGCACTCTCCACAGAATCACT-3'(扩增片段为366 bp)。以随机引物法标记探针(α-32P-dCTP标记目的基因片段)。同样方法制备β-actin探针。杂交：68 ℃预杂交(预杂交液：0.5 mol/L Na2HPO4,70 g/L SDS,1 mmol/L EDTA)30 min。将已标记探针变性后，加入杂交袋中，混匀。于68 ℃杂交20 h。洗膜，室温晾干，压X光片，-20 ℃放射自显影14 d。观察Northern blot杂交结果。
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2 结果
2.1 KAI1 mRNA在4种人黑色素瘤细胞中的表达
KAI1基因Northern blots杂交结果见图1。图1a为KAI1 mRNA在4种不同转移潜能人黑色素瘤细胞中的表达。图1b为β-actin在4种细胞系中的表达。图1显示KAI1 mRNA在4种人黑色素瘤细胞中均有表达。将KAI1与β-actin杂交信号进行光密度分析，计算它们之间的比值，以降低细胞之间的误差。积分光密度值WM35，0.179 8；WM451，0.180 0；WM983a，0.150 1；WM1341b，0.158 2。
图1 4种人黑色素瘤细胞中KAI1的Nothern blot杂交结果
a：KAI1基因； b：β-actin内参照
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1：WM35； 2：WM451； 3：WM983a； 4.WM1341b
2.2 nm23 mRNA在4种人黑色素瘤细胞中的表达
nm23基因Northern blot杂交结果见图2。图2a为nm23 mRNA在WM35，WM451，WM983a，WM1341b中的表达。图2b为β-actin在这4种细胞中的表达。由图2可见nm23 mRNA在4种人黑色素瘤细胞中均有表达。计算nm23与β-actin之间的光密度比值。4种黑色素瘤细胞的积分光密度比值分别是1.0428,1.0607,1.0141,1.0754，其表达量无明显差异。
图2 4种人黑色素瘤细胞中nm23的Nothern blot杂交结果
a：nm23基因； b：β-actin内参照
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1：WM35； 2：WM451； 3：WM983a； 4：WM1341b
3 讨论
癌转移的发生涉及到多种分子遗传学改变。目前对于转移抑制基因的研究已获得了较快的进展，并得到公认。KAI1和nm23基因是两个已被证实的肿瘤转移抑制基因，它们的表达降低与某些肿瘤发展与转移有关[4～8] 。已有报道KAI1和nm23与鼠黑色素瘤的转移抑制相关[2，9,10]。
作者的研究结果显示：KAI1 mRNA在WM35,WM1341b,WM983a,WM451 4种不同转移潜能的人黑色素瘤细胞中均有表达。其积分光密度值无明显差异。这一结果提示，KAI1基因可能不是抑制人黑色素瘤转移发生的主导基因。本研究结果与Takaoka等[9]和White等[10]的结果不一致。造成这种分歧的原因可能与所采用的研究对象不同有关。Takaoka等研究中采用的B16-BL6为鼠的黑色素瘤细胞系，White等研究小组使用的NZM系列亦为鼠类。由于种属的不同，基因所起的作用可能也有差异。
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nm23 mRNA在4种人黑色素瘤细胞中均有表达，且其表达量也基本一致。nm23基因最初是从鼠的黑色素瘤细胞株中分离出来的一种肿瘤转移抑制基因，它在低转移细胞株中的表达强度是高转移细胞株中的10倍[2]。然而本研究中所采用的人黑色素瘤细胞未能显示nm23与转移潜能的关系。因此认为nm23基因与人黑色素瘤的转移抑制无关。由此可见：KAI1和nm23基因除了具有组织特异性之外，还具有种属特异性，它们在不同种属的动物身上所表现出的作用可以是不同的。KAI1和nm23基因在鼠类黑色素瘤的转移抑制作用未能在人类黑色素瘤细胞得到证实，人类黑色素瘤的转移抑制不受KAI1和nm23基因的控制。它们不是人黑色素瘤的转移抑制基因，其转移抑制作用可能受到其它基因的调节。
基金项目：博士研究生课题
参考文献：
[1]Dong JT,Lamb PW,Rinker-Schaeffer CW,et al.KAI1,a metastasis suppressor gene for prostate cancer on human chromosome 11p11.2.Science,1995,268:884
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[2]Steeg PS,Bevilacqua G,Pozzatti R,et al.Altered expression of nm23,a gene associated with low tumor metastatic potential in adenovirus 2 Ela inhibition of experimental metastasis.Cancer Res,1988,48:6 550
[3]Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Analytical Biochem,1987,162:156
[4]李珊珊，方伟岗，钟镐镐，等.肿瘤转移抑制基因KAI1在不同转移潜能人癌细胞中的表达.中华医学杂志，1999,(9),708
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[5]Friess H,Guo XZ,Berberat P,et al.Reduced KAI1 expression in pancreatic cancer is associated with lymph node and distant metastases.Int J Cancer,1998,79:349
[6]Yang X,Welch DR,Phillips KK,et al.KAI1,a putative marker for metastatic potential in human breast cancer.Cancer Lett,1997,119:149
[7]Royds JA,Stephenson TJ,Rees RC,et al.nm23 protein expression in ductal in situ and invasive human breast carcinoma.J Natl Cancer Inst,1993,85:727
, 百拇医药
[8]Editorial.nm23-A metastasis suppressor gene? J Pathol,1994,173:211
[9]Takaoka A,Hinoda Y,Sato S,et al.Reduced invasive and metastatic potentials of KAI1-transfected melanoma cells.Jpn J Cancer Res,1998,89:397
[10]White A,Lamb PW,Barrett JC.Frequent downregulation of the KAI1(CD82) metastasis suppressor protein in human cancer cell lines.Oncogene,1998,16:3 143
(收稿日期：1999-12-25), 百拇医药