不同转移潜能人肺癌细胞系KAI1基因的表达
作者：李珊珊 方伟岗 任秀花 闫爱华 沈琼
单位：李珊珊(河南医科大学第一附属医院病理科,河南省肿瘤病理学重点实验室 郑州450052)；方伟岗(北京医科大学病理系 北京 100083)；闫爱华 任秀花 沈琼(河南医科大学癌前期研究室 郑州 450052)
关键词：基因，抑制，肿瘤转移；KAI1基因；肺肿瘤；腺癌
河南医科大学学报000202
摘 要：目的：探讨KAI1基因与人肺癌细胞系转移潜能的关系。方法：利用逆转录-PCR和Northern blot杂交法分析不同转移潜能人肺癌细胞系中KAI1 mRNA的表达，并用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测与突变的关系。结果：在高转移潜能细胞系PG中KAI1 mRNA表达降低，在无转移潜能的PAa细胞中KAI1的表达量比PG细胞高10倍以上(积分光密度比值分别为0.7313和0.0549)。PCR-SSCP结果显示在PG细胞KAI1基因第7外显子出现异常改变。结论：肺癌细胞的转移潜能可能与KAI1基因表达量有关，KAI1基因的低表达可能由基因突变所致。
, http://www.100md.com
分类号：R734.2
Expressions of KAI1 gene in human lung cancer cells with different metastatic potentials
LI Shanshan
(Department of Pathology,the First Affiliated Hospital，Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
FANG Weigang
(Department of Pathology,Beijing Medical University,Beijing 100083)
, 百拇医药 REN Xiuhua,YAN Aihua,SHEN Qiong
(Department of Precancerous Studies,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
Abstract：Aim:To study the relation between KAI1 gene and metastatic potentials of human lung cancer cells.Methods:Expressions of KAI1 in human lung cancer cell lines with different metastasis potentials were detected by RT-PCR and Northern blot hybridization,and the mutation were examined by PCR-SSCP analysis.Results:In highly metastatic lung cancer cell line PG,expression of KAI1 mRNA was decreased and expression level in PAa,a lung cancer cell line with no metastasis potential was ten times higher than that in PG(integral light density values were 0.7313 and 0.0549 respectively).PCR-SSCP analysis showed the exon 7 of KAI1 gene in PG appeared abnormal.Conclusion:Enhanced metastatic potential in human lung cancer cells may be associated with KAI1 expression.The decreased expression may be induced by mutation of KAI1 gene.
, http://www.100md.com
Key words：gene,suppressor,neoplasm metastasis；KAI1 gene;lung neoplasms;gland cancer▲
恶性肿瘤侵袭和转移的分子调控机制是当前肿瘤分子生物学研究的前沿领域，其中转移抑制基因的研究更有重要意义。肿瘤细胞内可能存在一系列的转移抑制基因，这类基因可在某种程度上抑制转移的发生。当这些基因丢失或表达下调时，可诱导癌转移发生。KAI1基因是最近发现的一个新的肿瘤转移抑制基因[1]，它的转移抑制作用已在前列腺癌得到证实，KAI1基因的低表达，可导致人前列腺癌转移的发生[1,2]。PG细胞是一株具有稳定高转移性的肺巨细胞癌系，它的高转移性是否与KAI1基因功能的丧失有关？作者观察了KAI1基因在高转移PG细胞和无转移潜能人肺腺癌PAa细胞中的表达，以探讨PG细胞高转移性与KAI1基因的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 细胞培养 PG细胞是由北京医科大学病理系建立的高转移肺巨细胞癌系[3]。PAa细胞是无转移潜能的肺腺癌细胞系(以上两种细胞均由北京医科大学病理系提供)。两种细胞系的转移能力均经裸鼠体内实验确认。用含体积分数10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养基，37 ℃,体积分数5%CO2条件下培养。
1.2 RT-PCR(逆转录-多聚酶链式反应) 取对数生长期细胞，按异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA[4]。逆转录反应参见文献[5]。PCR反应：KAI1 cDNA引物：上游,5'-CAAGCTGAAGCAGGAGATGG-3'; 下游,5'-CACAAGCAGATGGACAGGAC-3'，β-微球蛋白引物：上游,5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'；下游,5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'。两者扩增片段分别为426 bp和120 bp，退火温度均为55 ℃。
, http://www.100md.com 1.3 Northern blot杂交 制备12 g/L甲醛变性凝胶，RNA上样量20 μg，电泳,转膜。质粒PCMV.KAI1(美国国立卫生研究院董刚博士惠赠)，以PCR法获得一1.030 kb的基因片段[5]，以α-32P-dCTP标记该片段(采用美国Promega 公司产品Primer-α-Gene标记体系)。以同样方法标记β-actin内参照。在68 ℃预杂交30～60 min，将前述已标记探针变性后加入杂交袋中，68 ℃继续杂交12～16 h。洗膜：A液(40 mmol/L Na2HPO4,50 g/L SDS,1 mmol/L EDTA)漂洗两次(68 ℃)，20 min 1次。B液(40 mmol/L Na2PHO4,10 g/L SDS,1 mmol/L EDTA)洗2次(68 ℃)，15 min 1次。-20 ℃放射自显影10～14 d。观察Northern blot杂交结果。
, http://www.100md.com 1.4 PCR-SSCP(PCR-单链构象多态性分析) 以酚-氯仿抽提法提取细胞DNA。PCR扩增KAI1基因第3～9外显子。引物序列及反应条件见文献[5]。将PCR产物进行SSCP分析。取PCR产物5 μl加入SSCP上样缓冲液5 μl[体积分数95%去离子甲酰胺，10 mmol/L EDTA(pH 8.0)，0.5 g/L溴酚蓝，0.5 g/L二甲苯晴蓝]，变性后上样于100 g/L聚丙烯酰胺凝胶，恒压50 V，恒温15 ℃，电泳12 h。以1 g/L AgNO3染色→显色。
2 结果
2.1 PG和PAa细胞KAI1的RT-PCR结果 见图1。PG及PAa细胞中均可见426 bp的特异带扩增，说明KAI1 mRNA在两种不同转移潜能的肺癌细胞中均有表达。
图1 PG,PAa细胞KAI1的RT-PCR结果
, 百拇医药
a： KAI1 RT-PCR扩增出426 bp片段；b：β-微球蛋白
M:标准分子量(100 bp ladder)；1： PG细胞；2：PAa细胞
2.2 PG和PAa细胞KAI1的Northern blot杂交结果 见图2。图2a显示了KAI1 mRNA在PG细胞和PAa细胞中的表达，图2b为内参照β-actin。将KAI1与β-actin杂交信号进行光密度分析并计算两者之间的比值。由图2可见KAI1 mRNA在PG细胞中几乎不表达，而在PAa中则高表达，PAa的表达量是PG细胞的10倍以上(积分光密度值分别是0.731 3和0.054 9)。
图2 PG,PAa细胞KAI1的Northern blot杂交结果
a： KAI1； b：β-actin
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1：PG细胞； 2：PAa细胞
2.3 PG和PAa细胞KAI1的 PCR-SSCP结果 图3显示KAI1基因第7外显子在PG细胞出现泳动变位。
图3 PG,PAa细胞KAI1基因第7外显子SSCP结果
(箭头示泳动变位)
1： 正常对照；2：PG细胞；3：PAa细胞
3 讨论
KAI1基因的转移抑制作用已在人前列腺癌得到证实[1]。为探讨KAI1基因与人肺癌细胞转移潜能间的关系及其机制，作者采用RT-PCR,Northern blot杂交及PCR-SSCP技术，分别对PG和PAa两种肺癌细胞系进行观察。Northern blot杂交结果显示，KAI1基因在高转移潜能的人肺巨细胞癌系PG中几乎不表达，而在无转移性的人肺腺癌细胞系PAa则高表达。在RT-PCR中，二者KAI1 mRNA均呈现同样的表达。由此不难看出，KAI1 mRNA在PG细胞中不是绝对不表达，而是低表达。在检测mRNA表达的两种方法中，RT-PCR法灵敏，即使很微量的表达也能被检出，但不能进行定量分析。Northern blot杂交则可用来定量检测。本研究中无转移潜能的PAa细胞KAI1 mRNA表达量(积分光密度值0.731 3)比高转移的PG细胞的表达量(积分光密度值0.054 9)高10倍以上。因此认为PG细胞的高转移性可能与KAI1基因功能的丧失有关。Dong等[6]认为KAI1基因功能的部分丧失便可导致肿瘤发展到转移阶段。
, 百拇医药
基因突变是原癌基因激活和抑癌基因失活的重要机制之一。PG细胞中KAI1 mRNA的表达降低是否与该基因的突变失活有关？作者利用PCR-SSCP的方法对此进行了分析。结果显示，KAI1基因第7外显子在PG细胞出现带型的异常改变。说明在PG细胞可能存在KAI1基因第7外显子的突变，推测PG细胞中KAI1基因的功能降低可能与该基因的突变失活有关。
高转移PG细胞系是一个在裸鼠体内具有稳定转移表型的细胞系，已为国内多个实验室引用，成为研究癌转移的细胞及分子机制的一个良好实验模型。研究结果提示KAI1肿瘤转移抑制基因功能的降低可能与PG细胞的高转移性有关。这为人们研究KAI1基因与肺癌转移的关系提供了理论依据。有学者将KAI1基因的表达作为评估非小细胞肺癌预后的因素[5,7,8]，认为KAI1表达的病例其预后好于无表达者，生存率前者也明显高于后者。作者认为可能与KAI1基因抑制了肺癌的转移有关，KAI1基因限制了肺癌向浸润转移阶段的发展。
, http://www.100md.com 基金项目：博士研究生课题
参考文献：
[1]Dong JT,Lamb PW,Rinker-Schaeffer CW,et al.KAI1,a metastasis suppressor gene for prostate cancer on human chromosome 11p11.2.Science,1995,268:884
[2]Ward JM,Konishi N,Ohshima M,et al.Expression of KAI1 in paraffin-embedded normal,hyperplastic and neoplastic prostate and prostate carcinoma cell lines.Pathol Int,1998,48:87
[3]吴秉铨，孙毓恺，郑杰，等.裸鼠体内建立的人类高转移癌系.中华肿瘤杂志，1985,7:324
, 百拇医药
[4]Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Ana Biochem,1987,162:156
[5]Adachi M,Taki T,Ieki Y,et al.Correlation of KAI1 gene expression with good prognosis in patients with non-small cell lung cancer.Cancer Res,1996,56:1751
[6]Dong JT,Suzuki H,Pin SS,et al.Down-regulation of the KAI1 metastasis suppressor gene during the progression of human prostatic cancer infrequently involves gene mutation or allellic loss.Cancer Res,1996,56:4387
, 百拇医药
[7]Higashiyama M,Kodama K,Yokouchi,et al.KAI1 expression in nonsmall cell lung carcinoma is a novel favourable prognostic factor：An immunohistochemical analysis.Cancer,1998;83:466
[8]Adachi M,Taki T,Konish T,et al.Novel staging protocol for non-small cell lung cancers according to MRP-1/CD9 and KAI1 gene expression.J Clin Oncol,1998,16:1397
(收稿日期：1999-12-25), 百拇医药
单位：李珊珊(河南医科大学第一附属医院病理科,河南省肿瘤病理学重点实验室 郑州450052)；方伟岗(北京医科大学病理系 北京 100083)；闫爱华 任秀花 沈琼(河南医科大学癌前期研究室 郑州 450052)
关键词：基因，抑制，肿瘤转移；KAI1基因；肺肿瘤；腺癌
河南医科大学学报000202
摘 要：目的：探讨KAI1基因与人肺癌细胞系转移潜能的关系。方法：利用逆转录-PCR和Northern blot杂交法分析不同转移潜能人肺癌细胞系中KAI1 mRNA的表达，并用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测与突变的关系。结果：在高转移潜能细胞系PG中KAI1 mRNA表达降低，在无转移潜能的PAa细胞中KAI1的表达量比PG细胞高10倍以上(积分光密度比值分别为0.7313和0.0549)。PCR-SSCP结果显示在PG细胞KAI1基因第7外显子出现异常改变。结论：肺癌细胞的转移潜能可能与KAI1基因表达量有关，KAI1基因的低表达可能由基因突变所致。
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分类号：R734.2
Expressions of KAI1 gene in human lung cancer cells with different metastatic potentials
LI Shanshan
(Department of Pathology,the First Affiliated Hospital，Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
FANG Weigang
(Department of Pathology,Beijing Medical University,Beijing 100083)
, 百拇医药 REN Xiuhua,YAN Aihua,SHEN Qiong
(Department of Precancerous Studies,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
Abstract：Aim:To study the relation between KAI1 gene and metastatic potentials of human lung cancer cells.Methods:Expressions of KAI1 in human lung cancer cell lines with different metastasis potentials were detected by RT-PCR and Northern blot hybridization,and the mutation were examined by PCR-SSCP analysis.Results:In highly metastatic lung cancer cell line PG,expression of KAI1 mRNA was decreased and expression level in PAa,a lung cancer cell line with no metastasis potential was ten times higher than that in PG(integral light density values were 0.7313 and 0.0549 respectively).PCR-SSCP analysis showed the exon 7 of KAI1 gene in PG appeared abnormal.Conclusion:Enhanced metastatic potential in human lung cancer cells may be associated with KAI1 expression.The decreased expression may be induced by mutation of KAI1 gene.
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Key words：gene,suppressor,neoplasm metastasis；KAI1 gene;lung neoplasms;gland cancer▲
恶性肿瘤侵袭和转移的分子调控机制是当前肿瘤分子生物学研究的前沿领域，其中转移抑制基因的研究更有重要意义。肿瘤细胞内可能存在一系列的转移抑制基因，这类基因可在某种程度上抑制转移的发生。当这些基因丢失或表达下调时，可诱导癌转移发生。KAI1基因是最近发现的一个新的肿瘤转移抑制基因[1]，它的转移抑制作用已在前列腺癌得到证实，KAI1基因的低表达，可导致人前列腺癌转移的发生[1,2]。PG细胞是一株具有稳定高转移性的肺巨细胞癌系，它的高转移性是否与KAI1基因功能的丧失有关？作者观察了KAI1基因在高转移PG细胞和无转移潜能人肺腺癌PAa细胞中的表达，以探讨PG细胞高转移性与KAI1基因的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 细胞培养 PG细胞是由北京医科大学病理系建立的高转移肺巨细胞癌系[3]。PAa细胞是无转移潜能的肺腺癌细胞系(以上两种细胞均由北京医科大学病理系提供)。两种细胞系的转移能力均经裸鼠体内实验确认。用含体积分数10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养基，37 ℃,体积分数5%CO2条件下培养。
1.2 RT-PCR(逆转录-多聚酶链式反应) 取对数生长期细胞，按异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA[4]。逆转录反应参见文献[5]。PCR反应：KAI1 cDNA引物：上游,5'-CAAGCTGAAGCAGGAGATGG-3'; 下游,5'-CACAAGCAGATGGACAGGAC-3'，β-微球蛋白引物：上游,5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'；下游,5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'。两者扩增片段分别为426 bp和120 bp，退火温度均为55 ℃。
, http://www.100md.com 1.3 Northern blot杂交 制备12 g/L甲醛变性凝胶，RNA上样量20 μg，电泳,转膜。质粒PCMV.KAI1(美国国立卫生研究院董刚博士惠赠)，以PCR法获得一1.030 kb的基因片段[5]，以α-32P-dCTP标记该片段(采用美国Promega 公司产品Primer-α-Gene标记体系)。以同样方法标记β-actin内参照。在68 ℃预杂交30～60 min，将前述已标记探针变性后加入杂交袋中，68 ℃继续杂交12～16 h。洗膜：A液(40 mmol/L Na2HPO4,50 g/L SDS,1 mmol/L EDTA)漂洗两次(68 ℃)，20 min 1次。B液(40 mmol/L Na2PHO4,10 g/L SDS,1 mmol/L EDTA)洗2次(68 ℃)，15 min 1次。-20 ℃放射自显影10～14 d。观察Northern blot杂交结果。
, http://www.100md.com 1.4 PCR-SSCP(PCR-单链构象多态性分析) 以酚-氯仿抽提法提取细胞DNA。PCR扩增KAI1基因第3～9外显子。引物序列及反应条件见文献[5]。将PCR产物进行SSCP分析。取PCR产物5 μl加入SSCP上样缓冲液5 μl[体积分数95%去离子甲酰胺，10 mmol/L EDTA(pH 8.0)，0.5 g/L溴酚蓝，0.5 g/L二甲苯晴蓝]，变性后上样于100 g/L聚丙烯酰胺凝胶，恒压50 V，恒温15 ℃，电泳12 h。以1 g/L AgNO3染色→显色。
2 结果
2.1 PG和PAa细胞KAI1的RT-PCR结果 见图1。PG及PAa细胞中均可见426 bp的特异带扩增，说明KAI1 mRNA在两种不同转移潜能的肺癌细胞中均有表达。
图1 PG,PAa细胞KAI1的RT-PCR结果
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a： KAI1 RT-PCR扩增出426 bp片段；b：β-微球蛋白
M:标准分子量(100 bp ladder)；1： PG细胞；2：PAa细胞
2.2 PG和PAa细胞KAI1的Northern blot杂交结果 见图2。图2a显示了KAI1 mRNA在PG细胞和PAa细胞中的表达，图2b为内参照β-actin。将KAI1与β-actin杂交信号进行光密度分析并计算两者之间的比值。由图2可见KAI1 mRNA在PG细胞中几乎不表达，而在PAa中则高表达，PAa的表达量是PG细胞的10倍以上(积分光密度值分别是0.731 3和0.054 9)。
图2 PG,PAa细胞KAI1的Northern blot杂交结果
a： KAI1； b：β-actin
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1：PG细胞； 2：PAa细胞
2.3 PG和PAa细胞KAI1的 PCR-SSCP结果 图3显示KAI1基因第7外显子在PG细胞出现泳动变位。
图3 PG,PAa细胞KAI1基因第7外显子SSCP结果
(箭头示泳动变位)
1： 正常对照；2：PG细胞；3：PAa细胞
3 讨论
KAI1基因的转移抑制作用已在人前列腺癌得到证实[1]。为探讨KAI1基因与人肺癌细胞转移潜能间的关系及其机制，作者采用RT-PCR,Northern blot杂交及PCR-SSCP技术，分别对PG和PAa两种肺癌细胞系进行观察。Northern blot杂交结果显示，KAI1基因在高转移潜能的人肺巨细胞癌系PG中几乎不表达，而在无转移性的人肺腺癌细胞系PAa则高表达。在RT-PCR中，二者KAI1 mRNA均呈现同样的表达。由此不难看出，KAI1 mRNA在PG细胞中不是绝对不表达，而是低表达。在检测mRNA表达的两种方法中，RT-PCR法灵敏，即使很微量的表达也能被检出，但不能进行定量分析。Northern blot杂交则可用来定量检测。本研究中无转移潜能的PAa细胞KAI1 mRNA表达量(积分光密度值0.731 3)比高转移的PG细胞的表达量(积分光密度值0.054 9)高10倍以上。因此认为PG细胞的高转移性可能与KAI1基因功能的丧失有关。Dong等[6]认为KAI1基因功能的部分丧失便可导致肿瘤发展到转移阶段。
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基因突变是原癌基因激活和抑癌基因失活的重要机制之一。PG细胞中KAI1 mRNA的表达降低是否与该基因的突变失活有关？作者利用PCR-SSCP的方法对此进行了分析。结果显示，KAI1基因第7外显子在PG细胞出现带型的异常改变。说明在PG细胞可能存在KAI1基因第7外显子的突变，推测PG细胞中KAI1基因的功能降低可能与该基因的突变失活有关。
高转移PG细胞系是一个在裸鼠体内具有稳定转移表型的细胞系，已为国内多个实验室引用，成为研究癌转移的细胞及分子机制的一个良好实验模型。研究结果提示KAI1肿瘤转移抑制基因功能的降低可能与PG细胞的高转移性有关。这为人们研究KAI1基因与肺癌转移的关系提供了理论依据。有学者将KAI1基因的表达作为评估非小细胞肺癌预后的因素[5,7,8]，认为KAI1表达的病例其预后好于无表达者，生存率前者也明显高于后者。作者认为可能与KAI1基因抑制了肺癌的转移有关，KAI1基因限制了肺癌向浸润转移阶段的发展。
, http://www.100md.com 基金项目：博士研究生课题
参考文献：
[1]Dong JT,Lamb PW,Rinker-Schaeffer CW,et al.KAI1,a metastasis suppressor gene for prostate cancer on human chromosome 11p11.2.Science,1995,268:884
[2]Ward JM,Konishi N,Ohshima M,et al.Expression of KAI1 in paraffin-embedded normal,hyperplastic and neoplastic prostate and prostate carcinoma cell lines.Pathol Int,1998,48:87
[3]吴秉铨，孙毓恺，郑杰，等.裸鼠体内建立的人类高转移癌系.中华肿瘤杂志，1985,7:324
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[4]Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Ana Biochem,1987,162:156
[5]Adachi M,Taki T,Ieki Y,et al.Correlation of KAI1 gene expression with good prognosis in patients with non-small cell lung cancer.Cancer Res,1996,56:1751
[6]Dong JT,Suzuki H,Pin SS,et al.Down-regulation of the KAI1 metastasis suppressor gene during the progression of human prostatic cancer infrequently involves gene mutation or allellic loss.Cancer Res,1996,56:4387
, 百拇医药
[7]Higashiyama M,Kodama K,Yokouchi,et al.KAI1 expression in nonsmall cell lung carcinoma is a novel favourable prognostic factor：An immunohistochemical analysis.Cancer,1998;83:466
[8]Adachi M,Taki T,Konish T,et al.Novel staging protocol for non-small cell lung cancers according to MRP-1/CD9 and KAI1 gene expression.J Clin Oncol,1998,16:1397
(收稿日期：1999-12-25), 百拇医药