斑点印迹杂交法检测四环素抗性基因
作者：骆 丹 聂刘旺 鲁晓萱 黄澍杰 谢礼豪 徐文严 朱文元
单位：骆丹 朱文元 210029南京医科大学第一附属医院皮肤科；聂刘旺 鲁晓萱 南京铁道医学院生物教研室；徐文严 中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所；黄澍杰 谢礼豪广东省江门市皮肤病防治所
关键词：
中华皮肤科杂志990319
解脲支原体(Uu)是一种缺乏细胞壁、因而对β-内酰胺类抗生素治疗无效的微生物，故对Uu感染引起的临床症状常用四环素、红霉素类等药物治疗。因上述药物的广泛使用，四环素抗性基因(tetM)在各种微生物间的转座或转化作用等，使Uu耐药株不断增加。通过微生物药物敏感性试验(MIC)及聚合酶链反应(PCR)技术可检测耐药程度、耐药种类及四环素耐药决定子(tetM)[1，2]。本研究拟对tetM标准株PCR扩增产物进行地高辛标记制备成核酸探针，再行斑点印迹杂交试验。现报道如下。
, 百拇医药
一、材料与方法
(一)药品、试剂与实验菌株：标准品盐酸四环素由中国生物制品检定所提供；PCR相关试剂均购自华美及复华生物工程公司；Hybond-N尼龙膜为英国Amersham公司产品；地高辛(Dig)标记检测系统试剂盒为德国宝灵曼公司产品。42Uu株为临床非淋菌性尿道炎(宫颈炎)患者泌尿生殖道分泌物培养鉴定后阳性株标本，传代3次后收集备用于MIC测定、PCR扩增模板及基因组DNA提取后的分子杂交。
(二)TRNG-tetMPCR产物的回收、纯化与标记[3]：将200μLTRNG-tetMPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，取出DNA荧光带置Eppendorf管中捣碎，加等体积平衡酚振荡摇匀及-70℃冰冻各10min，12000r/min离心10min后再按酚氯仿抽提法制备纯化DNA，-20℃保存以备标记用。标记前首先变性模板DNA，按试剂盒说明在冰上依次加入相应试剂，37℃保温过夜后，终止标记反应，再行乙醇沉淀漂洗所标记的DNA探针，并以TE溶解保存。
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(三)DotBlot印迹杂交[3]：分别将UutetMPCR产物3μL及Uu分离株DNA提取物模板10μL加热变性冷却后直接点膜于Hybond-N尼龙膜上，80℃烘烤2h固定膜上DNA。以预杂交液(50%去离子甲酰胺，5×Denhart液，0.1μg/mL变性鲑鱼精子DNA等)68℃预杂交2h。变性DNA探针后加入正式杂交体系，68℃杂交过夜。次日经高浓度到低浓度SSC洗涤后，封闭非特异性杂交，依照试剂盒说明进行免疫检测显示杂交结果。
二、结果
(一)Uu株四环素MIC分布与tetM基因扩增检测：42株Uu对四环素敏感性的检测表明，MIC达8μg/mL以上有12株；30例tetM决定子阳性的Uu株其MIC水平分布于0.06～32μg/mL。
(二)tetMPCR产物的斑点印迹杂交：以载tetM的TRNG作为对照，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳回收纯化及标记后，对上述30例PCR阳性产物进行斑点印迹杂交分析。结果出现阳性杂交信号28例，阴性2例。
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(三)不同MIC株DNA提取物的斑点印迹杂交：采用前述核酸探针与各浓度的Uu株DNA提取物直接点膜杂交，结果只有MIC≥16μg/mL以上的Uu株DNA才可出现阳性杂交信号，此探针不能与MIC≤8μg/mL以下的Uu分离株DNA提取物反应出现肉眼可见的杂交信号，12例PCR扩增检测阴性者亦未出现阳性杂交信号。
三、讨论
采用96孔板微量肉汤稀释法筛选药物敏感株是经典的微生物敏感性试验，此法可同时检测某种微生物对多种抗菌药物在不同浓度下的敏感性如何[2，4]，但存在检测时间长，判断易有主观性等问题。分子生物学技术如核酸探针、PCR扩增等均可通过检测微生物自身的药物抗性基因存在与否来检测耐药菌株[1，4]。我们的实验结果发现tetM抗性基因的PCR阳性检测率并非完全与MIC浓度有明确相关性，即tetM抗性基因阳性与否与MIC浓度大小无明显相关，但tetM阳性提示有可能从敏感株发展成中度敏感株(MIC=8μg/mL)或耐药株(MIC≥16μg/mL)，因此在性病临床防治及流行病学研究方面应予重视及监测随访。
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为进一步阐明耐药基因与MIC检测的关系，本研究采用核酸探针技术分别对药物抗性基因的PCR产物及基因组DNA进行斑点印迹杂交分析。结果表明地高辛标记的TRNGtetMPCR产物核酸探针可与Uu株28/30份PCR产物产生阳性杂交信号，其阳性率为93.3%，将此探针直接与分离株DNA提取物点膜杂交后发现，只有MIC≥16μg/mL和MIC=32μg/mL者可出现阳性杂交信号，低于此浓度者未获阳性杂交结果。此说明耐药基因经过PCR扩增后，tetM决定子的拷贝数可能增多，可通过核酸探针这一敏感性相对较低的方法检测之；MIC达16μg/mL以上的培养物DNA提取物模板能被标记的tetM核酸探针检测出来是否与拷贝多少相关尚不清楚。值得提出的是若以MIC≥16μg/mL判为Uu耐四环素药物的水平标准，则核酸探针检测的结果与之吻合，此亦便于为临床治疗提供参考。而PCR检测法颇为灵敏，在MIC=0.06μg/mL时即可出现阳性结果。因此可将PCR扩增作为筛查耐药基因携带株的检测手段，并以核酸探针杂交分析对PCR结果进一步肯定证实，同时亦可对MIC测定的耐药程度或耐药性加以佐证。
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参考文献
1朱慧兰，徐广坤，赖维，等.解脲支原体中tetM基因的检测及临床应用评价.中华皮肤科杂志,1998,31:185-186.
2骆丹，黄澍杰，谢礼豪，等.解脲支原体对七种抗菌药物的敏感性测定及其与相关耐药基因检测的比较.中华皮肤科杂志,1998,31:152-155.
3卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社.1993.
4 Kenny GE, Cartwright FD, Susceptibilities of Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae, and Ureaplasma urealyticum to new glycyclines in comparison with those older tetracyclines. Antimicrob Agents Chemother, 1994,38:2628- 2632.
(收稿：1998-08-04修回：1999-01-04), 百拇医药
单位：骆丹 朱文元 210029南京医科大学第一附属医院皮肤科；聂刘旺 鲁晓萱 南京铁道医学院生物教研室；徐文严 中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所；黄澍杰 谢礼豪广东省江门市皮肤病防治所
关键词：
中华皮肤科杂志990319
解脲支原体(Uu)是一种缺乏细胞壁、因而对β-内酰胺类抗生素治疗无效的微生物，故对Uu感染引起的临床症状常用四环素、红霉素类等药物治疗。因上述药物的广泛使用，四环素抗性基因(tetM)在各种微生物间的转座或转化作用等，使Uu耐药株不断增加。通过微生物药物敏感性试验(MIC)及聚合酶链反应(PCR)技术可检测耐药程度、耐药种类及四环素耐药决定子(tetM)[1，2]。本研究拟对tetM标准株PCR扩增产物进行地高辛标记制备成核酸探针，再行斑点印迹杂交试验。现报道如下。
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一、材料与方法
(一)药品、试剂与实验菌株：标准品盐酸四环素由中国生物制品检定所提供；PCR相关试剂均购自华美及复华生物工程公司；Hybond-N尼龙膜为英国Amersham公司产品；地高辛(Dig)标记检测系统试剂盒为德国宝灵曼公司产品。42Uu株为临床非淋菌性尿道炎(宫颈炎)患者泌尿生殖道分泌物培养鉴定后阳性株标本，传代3次后收集备用于MIC测定、PCR扩增模板及基因组DNA提取后的分子杂交。
(二)TRNG-tetMPCR产物的回收、纯化与标记[3]：将200μLTRNG-tetMPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，取出DNA荧光带置Eppendorf管中捣碎，加等体积平衡酚振荡摇匀及-70℃冰冻各10min，12000r/min离心10min后再按酚氯仿抽提法制备纯化DNA，-20℃保存以备标记用。标记前首先变性模板DNA，按试剂盒说明在冰上依次加入相应试剂，37℃保温过夜后，终止标记反应，再行乙醇沉淀漂洗所标记的DNA探针，并以TE溶解保存。
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(三)DotBlot印迹杂交[3]：分别将UutetMPCR产物3μL及Uu分离株DNA提取物模板10μL加热变性冷却后直接点膜于Hybond-N尼龙膜上，80℃烘烤2h固定膜上DNA。以预杂交液(50%去离子甲酰胺，5×Denhart液，0.1μg/mL变性鲑鱼精子DNA等)68℃预杂交2h。变性DNA探针后加入正式杂交体系，68℃杂交过夜。次日经高浓度到低浓度SSC洗涤后，封闭非特异性杂交，依照试剂盒说明进行免疫检测显示杂交结果。
二、结果
(一)Uu株四环素MIC分布与tetM基因扩增检测：42株Uu对四环素敏感性的检测表明，MIC达8μg/mL以上有12株；30例tetM决定子阳性的Uu株其MIC水平分布于0.06～32μg/mL。
(二)tetMPCR产物的斑点印迹杂交：以载tetM的TRNG作为对照，经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳回收纯化及标记后，对上述30例PCR阳性产物进行斑点印迹杂交分析。结果出现阳性杂交信号28例，阴性2例。
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(三)不同MIC株DNA提取物的斑点印迹杂交：采用前述核酸探针与各浓度的Uu株DNA提取物直接点膜杂交，结果只有MIC≥16μg/mL以上的Uu株DNA才可出现阳性杂交信号，此探针不能与MIC≤8μg/mL以下的Uu分离株DNA提取物反应出现肉眼可见的杂交信号，12例PCR扩增检测阴性者亦未出现阳性杂交信号。
三、讨论
采用96孔板微量肉汤稀释法筛选药物敏感株是经典的微生物敏感性试验，此法可同时检测某种微生物对多种抗菌药物在不同浓度下的敏感性如何[2，4]，但存在检测时间长，判断易有主观性等问题。分子生物学技术如核酸探针、PCR扩增等均可通过检测微生物自身的药物抗性基因存在与否来检测耐药菌株[1，4]。我们的实验结果发现tetM抗性基因的PCR阳性检测率并非完全与MIC浓度有明确相关性，即tetM抗性基因阳性与否与MIC浓度大小无明显相关，但tetM阳性提示有可能从敏感株发展成中度敏感株(MIC=8μg/mL)或耐药株(MIC≥16μg/mL)，因此在性病临床防治及流行病学研究方面应予重视及监测随访。
, http://www.100md.com
为进一步阐明耐药基因与MIC检测的关系，本研究采用核酸探针技术分别对药物抗性基因的PCR产物及基因组DNA进行斑点印迹杂交分析。结果表明地高辛标记的TRNGtetMPCR产物核酸探针可与Uu株28/30份PCR产物产生阳性杂交信号，其阳性率为93.3%，将此探针直接与分离株DNA提取物点膜杂交后发现，只有MIC≥16μg/mL和MIC=32μg/mL者可出现阳性杂交信号，低于此浓度者未获阳性杂交结果。此说明耐药基因经过PCR扩增后，tetM决定子的拷贝数可能增多，可通过核酸探针这一敏感性相对较低的方法检测之；MIC达16μg/mL以上的培养物DNA提取物模板能被标记的tetM核酸探针检测出来是否与拷贝多少相关尚不清楚。值得提出的是若以MIC≥16μg/mL判为Uu耐四环素药物的水平标准，则核酸探针检测的结果与之吻合，此亦便于为临床治疗提供参考。而PCR检测法颇为灵敏，在MIC=0.06μg/mL时即可出现阳性结果。因此可将PCR扩增作为筛查耐药基因携带株的检测手段，并以核酸探针杂交分析对PCR结果进一步肯定证实，同时亦可对MIC测定的耐药程度或耐药性加以佐证。
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参考文献
1朱慧兰，徐广坤，赖维，等.解脲支原体中tetM基因的检测及临床应用评价.中华皮肤科杂志,1998,31:185-186.
2骆丹，黄澍杰，谢礼豪，等.解脲支原体对七种抗菌药物的敏感性测定及其与相关耐药基因检测的比较.中华皮肤科杂志,1998,31:152-155.
3卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社.1993.
4 Kenny GE, Cartwright FD, Susceptibilities of Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae, and Ureaplasma urealyticum to new glycyclines in comparison with those older tetracyclines. Antimicrob Agents Chemother, 1994,38:2628- 2632.
(收稿：1998-08-04修回：1999-01-04), 百拇医药