贝氏柯克斯体的分子遗传学研究进展
作者：陈荣
单位：第三军医大学微生物教研室(重庆 400038)
关键词：
中国人兽共患病杂志990227 陈荣 综述 温博海 俞树荣(审校)
Q热是一种世界上常见的人兽共患病，其病原体为贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii，Cb)。柯克斯体是专性细胞内寄生的微生物，在宿主细胞吞噬溶酶体内繁殖[1]。在外界环境中存活久，对人的感染力特别强，是立克次体中唯一可不借助于媒介节肢动物而通过气溶胶使人及动物发生感染的病原体。为了解决Q热的防治问题、探讨贝氏柯克斯体这种独特的病原体与宿主之间的相互作用，国内外学者对柯克斯体的特性进行了深入的研究。本文就近10年来贝氏柯克斯分子遗传学方面的研究进展作一综述。
1 质粒DNA
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在立克次体族中目前证明仅有贝氏柯克斯体携带有质粒。至今已发现的质粒有4种，它们分别为：(1)QpH1，首先由Samuel等[2]等自九里株Ⅰ相分离，大小为36kb，每个细胞中有3个拷贝。已用限制性核酸内切酶SalⅠ、KpnⅠ、PstⅠ及XbaⅠ构建出QpH1的限制酶切图谱。此质粒并不伴随相变异而丢失，与人类急性Q热有关的分离株常含有QpH1质粒。(2)QpRS，分离自慢性心内膜炎病人及流产山羊胎盘。内切酶分析显示QpRS比QpH1大2～3kb，含有独特的DNA序列。有的慢性病人分离株分离不出质粒，可能由于QpRS质粒序列已整合到染色体DNA中[3，4]。Savinelli[5]等用QpRS自无质粒的Ko株染色体DNA基因文库中筛选出阳性克隆，杂交分析证实Ko株的染色体DNA与QpRS具有同源性。(3)QpDG，由野生啮齿动物分离株分离，大小为45kb。带有此质粒的柯克斯体株对豚鼠不致病，对人是否有致病性尚不清楚[6]。(4)QpDV，由Kazar等分离自肺炎患者和牛奶中，大小为33.5kb。急性和慢性Q热分离株中都见有此质粒[7]。
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所有质粒的DNA大部分是保守的，共有约30kb的“核心”区，含有50%的质粒DNA信息。除了共同区域外，每种质粒又各有其特异序列。质粒的功能尚不十分清楚，有人根据它与临床表现的关系，推测其特异序列可能编码株特异性毒力因子。如QpRS质粒特有的cbbE＇基因只存在于慢性分离株的质粒中[8，9]，其它Q热分离株的染色体DNA和质粒(QpH1，QpDG)均未发现。cbbE＇基因的ORF长1485bp，编码55kDa的E＇蛋白。E＇蛋白含495个氨基酸，可能存在于柯克斯体外膜，其功能尚不清楚。而cbhE＇为急性Q热分离株的QpH1质粒特有[10]，其ORF长1022bp，编码的cbhE＇蛋白含341个氨基酸，分子量约为39kDa，成熟的cbhE＇蛋白在柯克斯体的胞质中。近年来PCR分析证明，cbhE＇基因可为柯克斯体的急、慢性分离株所共有，提示其质粒的类型与Q热的临床类型无关。
2 贝氏柯克斯体基因
据文献报道，迄今为止已分离的贝氏柯克斯体基因达十多种。根据功能可分为编码代谢及调节有关酶的基因，与毒力相关的基因，编码免疫保护性抗原的基因。
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2.1 编码代谢及调节有关酶的基因
2.1.1 gltA基因[11，12] 枸橼酸合成酶(gltA)基因是第一个在大肠杆菌中克隆和表达的贝氏柯克斯体基因。它编码的46kDa的多肽与其它细菌的枸橼酸合成酶单体的分子量相符。gltA基因带有自身启动子，其ORF长1290bp。枸橼酸合成酶是三羧酸循环中的第一个酶，催化乙酰辅酶CoA与草酰乙酸缩合生成柠檬酸，在生物合成和能量生成中起重要作用。贝氏柯克斯体枸橼酸合成酶基因演绎的氨基酸顺序与G-菌的“大”型酶同源性更高，但其酶活性却与G菌和真核细胞的“小”型酶相似，受4mM ATP的抑制，而不受4mM a-酮戊二酸的影响。
2.1.2 pyrB基因[13] 天冬氨酸转氨基甲酰酶(ATCase)是嘧啶核苷酸合成过程中一个重要的调节酶，它可催化L-天冬氨酸和氨甲酰磷酸转变成氨甲酰天冬氨酸和磷酸，氨甲酰天冬氨酸进一步环化形成嘧啶环。此途径的终产物UTP和CTP是核苷酸生物合成的基质。
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ATCase由pyrB基因编码，细菌中此酶活性受ATP活化而受CTP抑制。柯克斯体的pyrB基因位于一7kb的EcoR Ⅰ DNA酶切片段内，其ORF长954bp，编码含310个氨基酸的多肽，它可能为一个操纵元的一部分。
大肠杆菌的ATCase由6个调节多肽和6个催化多肽组成，2个催化三聚体与3个调节二聚体相连。而柯克斯体的ATCase是三聚体，不含调节多肽。柯克斯体与大肠杆菌、枯草杆菌的pyrB基因的核苷酸同源性分别为44%、50%，而ATCase的催化部分氨基酸序列在这三种亲缘关系较远的微生物中具有高度同源性，提示ATCase的催化机制是相同的。
2.1.3 Sdh基因簇[14] 琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸的内膜结合酶复合物，由细胞色素b556(SdhC)、疏水蛋白(SdhD)、黄素蛋白(SdhA)和铁硫蛋白(SdhB)组成。柯克斯体SdhCDAB与gltA基因紧密相邻，以相反方向阅读。SdhC靠gltA最近，长375nt，然后依次是SdhD(339nt)、SdhA(长1761nt，编码587个氨基酸的蛋白)、SdhB(705nt)。另外编码α-酮戊二酸的基因sucA始于sdh终止密码下游24p，柯克斯体和E.coli的与三羧酸循环相关的基因在排列上相似，但二者的基因间距有所不同。
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贝氏柯克斯体的sdh基因簇是以多顺反子转录的，它受sdhC上游单一启动子调控，可在大肠杆菌中功能性表达。
2.2 与毒力有关的基因
2.2.1 sod基因[15] 吞噬细胞产生的超氧离子(O2-)对细菌有杀伤作用，而超氧化物歧化酶(SOD)可通过将(O2-)转变成过氧化氢而去除其毒性作用，因此SOD在某些细菌的致病性中可作为毒力因子。
Heinzen等用PCR方法直接从柯克斯体中扩增出编码超氧化物歧化酶的基因sod。sod基因的ORF长579bp，编码含193个氨基酸、分子量约23kDa的蛋白。柯克斯体SOD的氨基酸顺序与大肠杆菌的FeSOD同源性最高，并能在大肠杆菌中功能性表达。
2.2.2 qrsA基因[16] 在感染过程中，柯克斯体可表达酸性磷酸酶(ACP)活性作为毒力因子。在沙门氏菌中，编码ACP的基因的表达受一对基因phoQ和phoP的调节，这对基因为二元调节系统的同源物。二元调节系统可调节多种细菌一系列的胞内过程，且该系统编码的传感蛋白在C端高度保守。根据这一特点，Mo等在柯克斯体中筛选出编码传感蛋白的基因qrsA。qrsA的ORF长1275bp，编码425个氨基酸、分子量42kDa的蛋白QrsA。QrsA与CpxA、PhoR和PhoQ等传感蛋白有显著同源性，其亲水位点与CpxA的非常相似。传感蛋白家族在多种细菌环境适应性中发挥重要作用，对柯克斯体qrsA基因的研究可帮助了解其在感染过程中如何适应胞外环境的变化。
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2.2.3 Cbmip基因[17] 肺炎军团杆菌可产生24kDa的表面蛋白Mip(吞噬细胞感染增强因子)，此蛋白在肺炎军团菌的毒力中起重要作用。Mo等克隆了柯克斯体中这一基因，其编码的蛋白能与抗肺炎军团菌Mip的特异抗体反应，此基因称为Cbmip。Cbmip位于一1.7kb的EcoR Ⅰ Cla Ⅰ片段内，有自身启动子，编码含230个氨基酸、分子量25.5kDa的蛋白。氨基酸序列与军团菌和衣原体中的Mip或类Mip蛋白的同源性分别为46%和30%，因此可认为Cbmip编码的是Mip类似物。CbMip是否位于细胞表面尚不清楚，它可能在功能上与军团菌和肺炎衣原体的Mip相类似，在柯克斯体的致病中起作用。
2.2.4 dnaJ基因[18] 柯克斯体的dnaJ基因存在于一2kb的EcoRⅠ-Hind Ⅲ酶切DNA片段上，基因的核苷酸序列已经测出。柯克斯体的dnaJ基因可在大肠杆菌中表达，产物能与抗大肠杆菌DnaJ蛋白的多克隆抗体发生反应。
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大肠杆菌中的dnaJ基因编码42kDa的热休克蛋白DnaJ。DnaJ和DnaK、GrpE热休克蛋白一起与细胞分裂、RNA和DNA合成、蛋白折叠和分泌、噬菌体λ和P1的复制、热休克反应的调节以及鞭毛合成有关。温度调节在病原菌毒力基因的表达中发挥重要作用，柯克斯体dnaJ基因的克隆、测序和表达，将有助于了解温度调控基因的表达。
2.2.5 mucZ基因[19] 将柯克斯体基因组DNA的一个1.2kb EcoR Ⅰ片段克隆到一多拷贝质粒中，可诱导大肠杆菌荚膜合成(粘液化)。核酸序列分析显示有一长810bp的ORF，可编码含270个氨基酸的蛋白，由于它能诱导粘液化(mucoidy)，将此基因称作mucZ。在mucZ基因单一的Nru Ⅰ限制酶切点插入一tet盒子可使其诱导粘液化的能力丧失。MucZ蛋白的C末端与DnaJ蛋白的J区及其同源物具有同源性，提示MucZ和DnaK-chaperon系统的组分间有相互作用。大肠杆菌lon-RcsA介导的荚膜合成需DnaK热休克系统，而MucZ诱导荚膜合成不依赖于lon-RcsA，而是通过二元调节因子RcsC和RcsB的作用，另外还需DnaK和GrpE而不需DnaJ。故推测MucZ是类DnaJ chaperone蛋白，在有活性的RcsA-RcsB复合物形成和RcsB依赖RcsC的磷酸化中是必需的。
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荚膜合成可帮助某些病原菌逃避宿主吞噬细胞的吞噬，是一种重要的毒力因子，但是柯克斯体尚未发现有荚膜形成。
2.2.6 rnc操纵元[20] 大肠杆菌中rnc操纵元由三个结构基因rnc、era、rec0构成，rnc基因编码的RNase Ⅲ为双链RNA依赖的RNA内切酶，带有mRNA转录子的RNase Ⅲ可活化或抑制基因表达；Era蛋白为大肠杆菌生存所必需；rec0基因产物与基因重组和修复有关。
柯克斯体的rnc操纵元位于一3.2kb的EcoR Ⅰ 片段上，与构成大肠杆菌rnc位点的三个结构基因具有同源序列，且都为多顺反式操纵元，二者的ORF所编码的蛋白的氨基酸顺序也有同源性。该柯克斯体的EcoR Ⅰ 酶切片段可在大肠杆菌中表达分子量为35kDa、27kDa和25kDa的蛋白。抗大肠杆菌Era蛋白的抗体能与35kDa蛋白发生交叉反应。柯克斯体的rnc基因、era基因可分别异源互补大肠杆菌的rnc、era缺陷株。
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2.3 编码免疫保护性抗原的基因
2.3.1 htpB基因[21] Vodkin等在cosmid载体PHC78所构建的柯克斯体基因文库中筛选出一个可产生14kDa和62kDa两种蛋白的克隆PJB196。这两种蛋白分别由htpA和htpB基因编码，两基因紧密相连，基因间距为27bp，ORF分别长291bp和1656bp。htpA基因上游58bp处有一热诱导启动子(HSP)，htpA和htpB在大肠杆菌中的转录受HSP的调节，在37℃可产生两种蛋白，在23℃则无表达产物生成。htpB编码的62kDa蛋白与3种来自分枝杆菌、1种来自大肠杆菌的序列具高度同源性。由于此蛋白具有免疫抗原性，因此可用作抗柯克斯体和其它表达此保守抗原的微生物的有效疫苗。
2.3.2 coml[22] 自柯克斯体克隆出编码27kDa外膜蛋白的基因，称为coml。coml的ORF长756bp，编码区G+C含量为42mol%，与柯克斯体全基因组的G+C含量43%非常相近。coml基因带有自身启动子，可在大肠杆菌中表达，它编码的27kDa蛋白能与抗柯克斯体九里株的抗血清反应，为免疫反应性蛋白。以前的研究发现感染柯克斯体或接种疫苗后的豚鼠能识别27kDa蛋白，高度纯化的27kDa表面蛋白能够在豚鼠、小鼠以及牛体内诱导产生抗Q热免疫。因此，该蛋白可能用以制备抗Q热感染的疫苗。
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2.3.3 17kDa外膜蛋白基因[23] 在用λgtll表达载体构建的柯克斯体七医株基因文库中筛选出两个阳性噬斑，可表达外源蛋白与β-半乳糖苷酶的融合蛋白。外源蛋白的分子量约为17kDa，可与七医株多价血清及针对17kDa外膜蛋白的单克隆抗体发生反应，证实该蛋白为七医株的外膜蛋白。编码此17kDa蛋白的基因的序列分析等研究正在进行中，由于17kDa蛋白具有免疫反应性，故对其基因的研究可为研制基因工程疫苗打下基础。
3 结语
随着分子遗传学的发展，柯克斯体的分子遗传学研究进入了一个崭新的阶段，对染色体DNA、质粒DNA的特性有了进一步的了解，基因克隆、测序及表达也取得很大进展，除了上面提及的基因外，还有与Cb分隔机制相关的qsop AB基因[25]以及rRNA操纵元中的23S rRNA和5S rRNA[26]基因都已被分离。但由于柯克斯体专性细胞内寄生的特点，使其分子遗传学研究受到限制，目前仍有许多不清楚之处，例如，以前认为cbhE＇基因为急性分离株特有，其核酸序列可用以鉴别急、慢性分离株，但最近有研究表明不是所有急性株都有cbhE＇基因，相反部分慢性株也带有此基因，因此QpH1质粒或cbhE＇基因作为区分急、慢性株的标志不再成立。推测Q热感染有急、慢性之分不仅与其基因特性有关，还与宿主个体之间免疫能力的差别有一定关系[24。此外，柯克斯体的毒力决定因子、一些酶类与致病性及生存能力之间的关系，以及相变异的机制等，都尚需进行深入的研究
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4 参考文献
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1998年7月15日收稿, 百拇医药
单位：第三军医大学微生物教研室(重庆 400038)
关键词：
中国人兽共患病杂志990227 陈荣 综述 温博海 俞树荣(审校)
Q热是一种世界上常见的人兽共患病，其病原体为贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii，Cb)。柯克斯体是专性细胞内寄生的微生物，在宿主细胞吞噬溶酶体内繁殖[1]。在外界环境中存活久，对人的感染力特别强，是立克次体中唯一可不借助于媒介节肢动物而通过气溶胶使人及动物发生感染的病原体。为了解决Q热的防治问题、探讨贝氏柯克斯体这种独特的病原体与宿主之间的相互作用，国内外学者对柯克斯体的特性进行了深入的研究。本文就近10年来贝氏柯克斯分子遗传学方面的研究进展作一综述。
1 质粒DNA
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在立克次体族中目前证明仅有贝氏柯克斯体携带有质粒。至今已发现的质粒有4种，它们分别为：(1)QpH1，首先由Samuel等[2]等自九里株Ⅰ相分离，大小为36kb，每个细胞中有3个拷贝。已用限制性核酸内切酶SalⅠ、KpnⅠ、PstⅠ及XbaⅠ构建出QpH1的限制酶切图谱。此质粒并不伴随相变异而丢失，与人类急性Q热有关的分离株常含有QpH1质粒。(2)QpRS，分离自慢性心内膜炎病人及流产山羊胎盘。内切酶分析显示QpRS比QpH1大2～3kb，含有独特的DNA序列。有的慢性病人分离株分离不出质粒，可能由于QpRS质粒序列已整合到染色体DNA中[3，4]。Savinelli[5]等用QpRS自无质粒的Ko株染色体DNA基因文库中筛选出阳性克隆，杂交分析证实Ko株的染色体DNA与QpRS具有同源性。(3)QpDG，由野生啮齿动物分离株分离，大小为45kb。带有此质粒的柯克斯体株对豚鼠不致病，对人是否有致病性尚不清楚[6]。(4)QpDV，由Kazar等分离自肺炎患者和牛奶中，大小为33.5kb。急性和慢性Q热分离株中都见有此质粒[7]。
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所有质粒的DNA大部分是保守的，共有约30kb的“核心”区，含有50%的质粒DNA信息。除了共同区域外，每种质粒又各有其特异序列。质粒的功能尚不十分清楚，有人根据它与临床表现的关系，推测其特异序列可能编码株特异性毒力因子。如QpRS质粒特有的cbbE＇基因只存在于慢性分离株的质粒中[8，9]，其它Q热分离株的染色体DNA和质粒(QpH1，QpDG)均未发现。cbbE＇基因的ORF长1485bp，编码55kDa的E＇蛋白。E＇蛋白含495个氨基酸，可能存在于柯克斯体外膜，其功能尚不清楚。而cbhE＇为急性Q热分离株的QpH1质粒特有[10]，其ORF长1022bp，编码的cbhE＇蛋白含341个氨基酸，分子量约为39kDa，成熟的cbhE＇蛋白在柯克斯体的胞质中。近年来PCR分析证明，cbhE＇基因可为柯克斯体的急、慢性分离株所共有，提示其质粒的类型与Q热的临床类型无关。
2 贝氏柯克斯体基因
据文献报道，迄今为止已分离的贝氏柯克斯体基因达十多种。根据功能可分为编码代谢及调节有关酶的基因，与毒力相关的基因，编码免疫保护性抗原的基因。
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2.1 编码代谢及调节有关酶的基因
2.1.1 gltA基因[11，12] 枸橼酸合成酶(gltA)基因是第一个在大肠杆菌中克隆和表达的贝氏柯克斯体基因。它编码的46kDa的多肽与其它细菌的枸橼酸合成酶单体的分子量相符。gltA基因带有自身启动子，其ORF长1290bp。枸橼酸合成酶是三羧酸循环中的第一个酶，催化乙酰辅酶CoA与草酰乙酸缩合生成柠檬酸，在生物合成和能量生成中起重要作用。贝氏柯克斯体枸橼酸合成酶基因演绎的氨基酸顺序与G-菌的“大”型酶同源性更高，但其酶活性却与G菌和真核细胞的“小”型酶相似，受4mM ATP的抑制，而不受4mM a-酮戊二酸的影响。
2.1.2 pyrB基因[13] 天冬氨酸转氨基甲酰酶(ATCase)是嘧啶核苷酸合成过程中一个重要的调节酶，它可催化L-天冬氨酸和氨甲酰磷酸转变成氨甲酰天冬氨酸和磷酸，氨甲酰天冬氨酸进一步环化形成嘧啶环。此途径的终产物UTP和CTP是核苷酸生物合成的基质。
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ATCase由pyrB基因编码，细菌中此酶活性受ATP活化而受CTP抑制。柯克斯体的pyrB基因位于一7kb的EcoR Ⅰ DNA酶切片段内，其ORF长954bp，编码含310个氨基酸的多肽，它可能为一个操纵元的一部分。
大肠杆菌的ATCase由6个调节多肽和6个催化多肽组成，2个催化三聚体与3个调节二聚体相连。而柯克斯体的ATCase是三聚体，不含调节多肽。柯克斯体与大肠杆菌、枯草杆菌的pyrB基因的核苷酸同源性分别为44%、50%，而ATCase的催化部分氨基酸序列在这三种亲缘关系较远的微生物中具有高度同源性，提示ATCase的催化机制是相同的。
2.1.3 Sdh基因簇[14] 琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸的内膜结合酶复合物，由细胞色素b556(SdhC)、疏水蛋白(SdhD)、黄素蛋白(SdhA)和铁硫蛋白(SdhB)组成。柯克斯体SdhCDAB与gltA基因紧密相邻，以相反方向阅读。SdhC靠gltA最近，长375nt，然后依次是SdhD(339nt)、SdhA(长1761nt，编码587个氨基酸的蛋白)、SdhB(705nt)。另外编码α-酮戊二酸的基因sucA始于sdh终止密码下游24p，柯克斯体和E.coli的与三羧酸循环相关的基因在排列上相似，但二者的基因间距有所不同。
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贝氏柯克斯体的sdh基因簇是以多顺反子转录的，它受sdhC上游单一启动子调控，可在大肠杆菌中功能性表达。
2.2 与毒力有关的基因
2.2.1 sod基因[15] 吞噬细胞产生的超氧离子(O2-)对细菌有杀伤作用，而超氧化物歧化酶(SOD)可通过将(O2-)转变成过氧化氢而去除其毒性作用，因此SOD在某些细菌的致病性中可作为毒力因子。
Heinzen等用PCR方法直接从柯克斯体中扩增出编码超氧化物歧化酶的基因sod。sod基因的ORF长579bp，编码含193个氨基酸、分子量约23kDa的蛋白。柯克斯体SOD的氨基酸顺序与大肠杆菌的FeSOD同源性最高，并能在大肠杆菌中功能性表达。
2.2.2 qrsA基因[16] 在感染过程中，柯克斯体可表达酸性磷酸酶(ACP)活性作为毒力因子。在沙门氏菌中，编码ACP的基因的表达受一对基因phoQ和phoP的调节，这对基因为二元调节系统的同源物。二元调节系统可调节多种细菌一系列的胞内过程，且该系统编码的传感蛋白在C端高度保守。根据这一特点，Mo等在柯克斯体中筛选出编码传感蛋白的基因qrsA。qrsA的ORF长1275bp，编码425个氨基酸、分子量42kDa的蛋白QrsA。QrsA与CpxA、PhoR和PhoQ等传感蛋白有显著同源性，其亲水位点与CpxA的非常相似。传感蛋白家族在多种细菌环境适应性中发挥重要作用，对柯克斯体qrsA基因的研究可帮助了解其在感染过程中如何适应胞外环境的变化。
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2.2.3 Cbmip基因[17] 肺炎军团杆菌可产生24kDa的表面蛋白Mip(吞噬细胞感染增强因子)，此蛋白在肺炎军团菌的毒力中起重要作用。Mo等克隆了柯克斯体中这一基因，其编码的蛋白能与抗肺炎军团菌Mip的特异抗体反应，此基因称为Cbmip。Cbmip位于一1.7kb的EcoR Ⅰ Cla Ⅰ片段内，有自身启动子，编码含230个氨基酸、分子量25.5kDa的蛋白。氨基酸序列与军团菌和衣原体中的Mip或类Mip蛋白的同源性分别为46%和30%，因此可认为Cbmip编码的是Mip类似物。CbMip是否位于细胞表面尚不清楚，它可能在功能上与军团菌和肺炎衣原体的Mip相类似，在柯克斯体的致病中起作用。
2.2.4 dnaJ基因[18] 柯克斯体的dnaJ基因存在于一2kb的EcoRⅠ-Hind Ⅲ酶切DNA片段上，基因的核苷酸序列已经测出。柯克斯体的dnaJ基因可在大肠杆菌中表达，产物能与抗大肠杆菌DnaJ蛋白的多克隆抗体发生反应。
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大肠杆菌中的dnaJ基因编码42kDa的热休克蛋白DnaJ。DnaJ和DnaK、GrpE热休克蛋白一起与细胞分裂、RNA和DNA合成、蛋白折叠和分泌、噬菌体λ和P1的复制、热休克反应的调节以及鞭毛合成有关。温度调节在病原菌毒力基因的表达中发挥重要作用，柯克斯体dnaJ基因的克隆、测序和表达，将有助于了解温度调控基因的表达。
2.2.5 mucZ基因[19] 将柯克斯体基因组DNA的一个1.2kb EcoR Ⅰ片段克隆到一多拷贝质粒中，可诱导大肠杆菌荚膜合成(粘液化)。核酸序列分析显示有一长810bp的ORF，可编码含270个氨基酸的蛋白，由于它能诱导粘液化(mucoidy)，将此基因称作mucZ。在mucZ基因单一的Nru Ⅰ限制酶切点插入一tet盒子可使其诱导粘液化的能力丧失。MucZ蛋白的C末端与DnaJ蛋白的J区及其同源物具有同源性，提示MucZ和DnaK-chaperon系统的组分间有相互作用。大肠杆菌lon-RcsA介导的荚膜合成需DnaK热休克系统，而MucZ诱导荚膜合成不依赖于lon-RcsA，而是通过二元调节因子RcsC和RcsB的作用，另外还需DnaK和GrpE而不需DnaJ。故推测MucZ是类DnaJ chaperone蛋白，在有活性的RcsA-RcsB复合物形成和RcsB依赖RcsC的磷酸化中是必需的。
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荚膜合成可帮助某些病原菌逃避宿主吞噬细胞的吞噬，是一种重要的毒力因子，但是柯克斯体尚未发现有荚膜形成。
2.2.6 rnc操纵元[20] 大肠杆菌中rnc操纵元由三个结构基因rnc、era、rec0构成，rnc基因编码的RNase Ⅲ为双链RNA依赖的RNA内切酶，带有mRNA转录子的RNase Ⅲ可活化或抑制基因表达；Era蛋白为大肠杆菌生存所必需；rec0基因产物与基因重组和修复有关。
柯克斯体的rnc操纵元位于一3.2kb的EcoR Ⅰ 片段上，与构成大肠杆菌rnc位点的三个结构基因具有同源序列，且都为多顺反式操纵元，二者的ORF所编码的蛋白的氨基酸顺序也有同源性。该柯克斯体的EcoR Ⅰ 酶切片段可在大肠杆菌中表达分子量为35kDa、27kDa和25kDa的蛋白。抗大肠杆菌Era蛋白的抗体能与35kDa蛋白发生交叉反应。柯克斯体的rnc基因、era基因可分别异源互补大肠杆菌的rnc、era缺陷株。
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2.3 编码免疫保护性抗原的基因
2.3.1 htpB基因[21] Vodkin等在cosmid载体PHC78所构建的柯克斯体基因文库中筛选出一个可产生14kDa和62kDa两种蛋白的克隆PJB196。这两种蛋白分别由htpA和htpB基因编码，两基因紧密相连，基因间距为27bp，ORF分别长291bp和1656bp。htpA基因上游58bp处有一热诱导启动子(HSP)，htpA和htpB在大肠杆菌中的转录受HSP的调节，在37℃可产生两种蛋白，在23℃则无表达产物生成。htpB编码的62kDa蛋白与3种来自分枝杆菌、1种来自大肠杆菌的序列具高度同源性。由于此蛋白具有免疫抗原性，因此可用作抗柯克斯体和其它表达此保守抗原的微生物的有效疫苗。
2.3.2 coml[22] 自柯克斯体克隆出编码27kDa外膜蛋白的基因，称为coml。coml的ORF长756bp，编码区G+C含量为42mol%，与柯克斯体全基因组的G+C含量43%非常相近。coml基因带有自身启动子，可在大肠杆菌中表达，它编码的27kDa蛋白能与抗柯克斯体九里株的抗血清反应，为免疫反应性蛋白。以前的研究发现感染柯克斯体或接种疫苗后的豚鼠能识别27kDa蛋白，高度纯化的27kDa表面蛋白能够在豚鼠、小鼠以及牛体内诱导产生抗Q热免疫。因此，该蛋白可能用以制备抗Q热感染的疫苗。
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2.3.3 17kDa外膜蛋白基因[23] 在用λgtll表达载体构建的柯克斯体七医株基因文库中筛选出两个阳性噬斑，可表达外源蛋白与β-半乳糖苷酶的融合蛋白。外源蛋白的分子量约为17kDa，可与七医株多价血清及针对17kDa外膜蛋白的单克隆抗体发生反应，证实该蛋白为七医株的外膜蛋白。编码此17kDa蛋白的基因的序列分析等研究正在进行中，由于17kDa蛋白具有免疫反应性，故对其基因的研究可为研制基因工程疫苗打下基础。
3 结语
随着分子遗传学的发展，柯克斯体的分子遗传学研究进入了一个崭新的阶段，对染色体DNA、质粒DNA的特性有了进一步的了解，基因克隆、测序及表达也取得很大进展，除了上面提及的基因外，还有与Cb分隔机制相关的qsop AB基因[25]以及rRNA操纵元中的23S rRNA和5S rRNA[26]基因都已被分离。但由于柯克斯体专性细胞内寄生的特点，使其分子遗传学研究受到限制，目前仍有许多不清楚之处，例如，以前认为cbhE＇基因为急性分离株特有，其核酸序列可用以鉴别急、慢性分离株，但最近有研究表明不是所有急性株都有cbhE＇基因，相反部分慢性株也带有此基因，因此QpH1质粒或cbhE＇基因作为区分急、慢性株的标志不再成立。推测Q热感染有急、慢性之分不仅与其基因特性有关，还与宿主个体之间免疫能力的差别有一定关系[24。此外，柯克斯体的毒力决定因子、一些酶类与致病性及生存能力之间的关系，以及相变异的机制等，都尚需进行深入的研究
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1998年7月15日收稿, 百拇医药