丙烷盐酸盐抑制自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖及对HSP70和P53的影响
作者：熊一力 钱家庆
单位：
关键词：
中华医学杂志971124 血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖是高血压病的主要病理特征，此病变涉及许多VSMC促增殖因子及基因调控[1，2]。1-(2，6-二甲基苯氧基 )-2-(3，4-二甲氧基苯乙胺基)丙烷盐酸盐(DDPH)是抗高血压新型化合物。已发现该药具有较明显而持久的降压作用，与钙拮抗及α1受体阻断机制有关[3]。但此作用是否与拮抗VSMC增殖相关及其机制，有待证实。
一、材料与方法
1.动物分组及血压测量：共分3组，每组7只大鼠，自发性高血压大鼠(SHR)14只，220～260g，随机分为SHR对照组(SHR)及SHR+DDPH(中国药科大学合成)治疗组 (SHRD)。另用同系wistar-kyoto鼠7只，180～250g，作为正常血压对照组(WKY)。SHRD组用DDPH(蒸溜水配制)灌胃每天 50mg/kg，持续8周。SHR与WKY不灌药，但于同一时间灌等容积蒸溜水。给药8周时，处死3组大鼠，摘取肾动脉。所有动物在 给药前、给药后4周、给药后8周常规测尾动脉收缩压各1次。
, 百拇医药
2.氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入量测定：取各肾动脉2/3浅层中膜组织制作2 mm2组织片，孵育24小时收样，收样前6小时加 3 H-TdR，37kBq/孔，恒温振荡，洗涤，称重及消融后，在液体闪烁计数仪上行放射活性计数测定。
3.电镜观察：分别将肾动脉切成1 mm3，常规制样，透射电镜下观察摄片。
4.免疫组织化学检测：肾动脉冰冻切片，用酶标链霉亲和素-生物素[4]法检测。HSP70单克隆抗体由加拿大Tanguay教授惠赠。随机选30个VSMC，行图像分析，以细胞阳性染色(胞浆呈棕黄色)的积分光密度(A值)表示抗原表达量。
5.原位杂交：探针标记按照地高辛标记试剂盒(Boehringer Mannhei公司)方法，以地高辛标记的HSP70及野生型p53探针，行各动脉原位cDNA-mRNA分子杂交[5]。每组选30个VSMC图像分析，以细胞阳性染色平均光密度(A值)表示各mRNA表达量。
, 百拇医药
二、结果
SHRD组给药前血压与SHR组相似，明显高于WKY组(P<0.01)，而给药8周时血压已明显低于SHR组(P<0.01)(表1)。3H-TdR掺入量在SHRD组比SHR明显降低(P<0.01)，比WKY组稍高。从免疫组化结果看，SHRD组HSP70抗原表达比SHR组显著减弱(P<0.01)。原位杂交结果显示，SHRD组HSP70 mRNA表达比SHR组明显减弱(P<0.01)，P53 mRNA表达增强(P<0.05)(表2)。电镜下SHR组VSMC线粒体，粗面内质网较WKY组明显增多，胞膜下肌丝成分较少。SHRD组线粒体，粗面内质网不如SHR组丰富，肌丝位于胞膜周边。
表1 3组鼠在给药前后不同时相尾动脉收缩压的比较(kPa,
±s) 组别
鼠数
, http://www.100md.com
给药前
给药后4周
给药后8周
SHRD组
7
20.0±1.6
16.7±1.8
15.4±1.7
SHR组
7
19.6±1.6
19.8±1.4*
, 百拇医药
20.1±1.7**
WKY组
7
13.6±1.3**
13.6±1.4*
13.6±1.1
与SHRD组相比* P<0.05，** P<0.01表2 3组鼠肾动脉VSMC3 H-TdR掺入量、HSP70表达积分光密度和HSP70与P53 mRNA
表达平均光密度比较(±s) 组别
, 百拇医药
鼠
数
3 H-TdR
掺入量
(cpm)
HSP70
表达积分
光密度(A值)
mRNA表达平均光密度(A值)
HSP70
P53
SHRD组
, http://www.100md.com 7
512
±95
36
±13
0.0622
±0.0027
0.058
±0.005
SHR组
7
864
±83**
, http://www.100md.com
45
±12**
0.1276
±0.0036**
0.089
±0.005*
WKY组
7
499
±75
36
±10
, http://www.100md.com
0.0598
±0.0041
0.051
±0.005
与SHRD组相比* P<0.05，** P<0.01
三、讨论
本实验说明，DDPH在降低血压同时的确具有抑制VSMC DNA合成及VSMC增殖作用。在蛋白翻译水平DDPH可抑制HSP70抗原阳性表达；在mRNA转录水平，DDPH则 能抑制HSP70基因阳性表达，并能增强野生型p53基因表达。可见DDPH对VSMC增殖的抑制涉及到HSP及p53。HSP70基因启动子与野生型p53基因重组后转染细胞可降低HSP70的转录激活作用，抑制细胞增殖[5]。本实验用DDPH后HSP70及野生型p53表达的改变可能与药物直接作用于两者有关，也可能药物使野生型p53增加，后者与HSP70相互作用使HSP减少，或是增高的HSP70在突变型向野生型p53表型转化的调节方面起一定作用，从而抑制VSMC增殖。使VSMC增殖的血管活性物质作用于VSMC受体后可直接通过一系列受体介导激活第二信使系统引起Ca2+内流，胞浆Ca2+浓度增高，酶活化，使HSP70表达增强，基因异常表达引起VSMC增殖[6]。故推测DDPH对HSP及p53表达的影响，可能与已证实的DDPH钙拮抗作用有关。综上所述，DDPH降压作用与抑制VSMC增殖作用协同，其抑制VSMC增殖的作用与HSP70减少，野生型p53表达增强相关。但药物对两者的确切作用点，两者的相互调控以及是否与钙拮抗等机制直接相关，还待进一步证实。
, 百拇医药
参考文献
1 Bohr DF, Dominiczak AF, Webb RC. Pathophysiology of vasculature in hypertension. Hypertension, 1991, 18(supple Ⅲ)：115.
2 熊一力，赵华月.穿心莲成分API0134对猪主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用.中华心血管病杂志，1995，23：214.
3 倪西平，钱家庆，胡崇家 .1-(2,6-二甲基苯氧基)-2-(3，4-二甲氧基苯乙胺基)丙烷盐酸盐的降压作用.中国药理学报，1988，9：64.
4 刘绍春，吴人亮主编.免疫组织化学.第三版.武汉：同济医科大学出版社，1993：30.
5 Nicholas A, Jeannie H, Daniel HL. Regulation of human HSP70 promoter by P53. Sicience, 1993, 259：64.
6 Currie RW, Tanguay RW, Kingma JR. Heat shock response and limilation of tissue necrosis duing occusion/reperfusion in rabbit hearts. Circulasion, 1993, 87：963.
(收稿：1996-12-12 修回：1997-08-04)
(本文编辑：袁桂清), http://www.100md.com
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关键词：
中华医学杂志971124 血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖是高血压病的主要病理特征，此病变涉及许多VSMC促增殖因子及基因调控[1，2]。1-(2，6-二甲基苯氧基 )-2-(3，4-二甲氧基苯乙胺基)丙烷盐酸盐(DDPH)是抗高血压新型化合物。已发现该药具有较明显而持久的降压作用，与钙拮抗及α1受体阻断机制有关[3]。但此作用是否与拮抗VSMC增殖相关及其机制，有待证实。
一、材料与方法
1.动物分组及血压测量：共分3组，每组7只大鼠，自发性高血压大鼠(SHR)14只，220～260g，随机分为SHR对照组(SHR)及SHR+DDPH(中国药科大学合成)治疗组 (SHRD)。另用同系wistar-kyoto鼠7只，180～250g，作为正常血压对照组(WKY)。SHRD组用DDPH(蒸溜水配制)灌胃每天 50mg/kg，持续8周。SHR与WKY不灌药，但于同一时间灌等容积蒸溜水。给药8周时，处死3组大鼠，摘取肾动脉。所有动物在 给药前、给药后4周、给药后8周常规测尾动脉收缩压各1次。
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2.氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入量测定：取各肾动脉2/3浅层中膜组织制作2 mm2组织片，孵育24小时收样，收样前6小时加 3 H-TdR，37kBq/孔，恒温振荡，洗涤，称重及消融后，在液体闪烁计数仪上行放射活性计数测定。
3.电镜观察：分别将肾动脉切成1 mm3，常规制样，透射电镜下观察摄片。
4.免疫组织化学检测：肾动脉冰冻切片，用酶标链霉亲和素-生物素[4]法检测。HSP70单克隆抗体由加拿大Tanguay教授惠赠。随机选30个VSMC，行图像分析，以细胞阳性染色(胞浆呈棕黄色)的积分光密度(A值)表示抗原表达量。
5.原位杂交：探针标记按照地高辛标记试剂盒(Boehringer Mannhei公司)方法，以地高辛标记的HSP70及野生型p53探针，行各动脉原位cDNA-mRNA分子杂交[5]。每组选30个VSMC图像分析，以细胞阳性染色平均光密度(A值)表示各mRNA表达量。
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二、结果
SHRD组给药前血压与SHR组相似，明显高于WKY组(P<0.01)，而给药8周时血压已明显低于SHR组(P<0.01)(表1)。3H-TdR掺入量在SHRD组比SHR明显降低(P<0.01)，比WKY组稍高。从免疫组化结果看，SHRD组HSP70抗原表达比SHR组显著减弱(P<0.01)。原位杂交结果显示，SHRD组HSP70 mRNA表达比SHR组明显减弱(P<0.01)，P53 mRNA表达增强(P<0.05)(表2)。电镜下SHR组VSMC线粒体，粗面内质网较WKY组明显增多，胞膜下肌丝成分较少。SHRD组线粒体，粗面内质网不如SHR组丰富，肌丝位于胞膜周边。
表1 3组鼠在给药前后不同时相尾动脉收缩压的比较(kPa,
±s) 组别鼠数
, http://www.100md.com
给药前
给药后4周
给药后8周
SHRD组
7
20.0±1.6
16.7±1.8
15.4±1.7
SHR组
7
19.6±1.6
19.8±1.4*
, 百拇医药
20.1±1.7**
WKY组
7
13.6±1.3**
13.6±1.4*
13.6±1.1
与SHRD组相比* P<0.05，** P<0.01表2 3组鼠肾动脉VSMC3 H-TdR掺入量、HSP70表达积分光密度和HSP70与P53 mRNA
表达平均光密度比较(
±s) 组别, 百拇医药
鼠
数
3 H-TdR
掺入量
(cpm)
HSP70
表达积分
光密度(A值)
mRNA表达平均光密度(A值)
HSP70
P53
SHRD组
, http://www.100md.com 7
512
±95
36
±13
0.0622
±0.0027
0.058
±0.005
SHR组
7
864
±83**
, http://www.100md.com
45
±12**
0.1276
±0.0036**
0.089
±0.005*
WKY组
7
499
±75
36
±10
, http://www.100md.com
0.0598
±0.0041
0.051
±0.005
与SHRD组相比* P<0.05，** P<0.01
三、讨论
本实验说明，DDPH在降低血压同时的确具有抑制VSMC DNA合成及VSMC增殖作用。在蛋白翻译水平DDPH可抑制HSP70抗原阳性表达；在mRNA转录水平，DDPH则 能抑制HSP70基因阳性表达，并能增强野生型p53基因表达。可见DDPH对VSMC增殖的抑制涉及到HSP及p53。HSP70基因启动子与野生型p53基因重组后转染细胞可降低HSP70的转录激活作用，抑制细胞增殖[5]。本实验用DDPH后HSP70及野生型p53表达的改变可能与药物直接作用于两者有关，也可能药物使野生型p53增加，后者与HSP70相互作用使HSP减少，或是增高的HSP70在突变型向野生型p53表型转化的调节方面起一定作用，从而抑制VSMC增殖。使VSMC增殖的血管活性物质作用于VSMC受体后可直接通过一系列受体介导激活第二信使系统引起Ca2+内流，胞浆Ca2+浓度增高，酶活化，使HSP70表达增强，基因异常表达引起VSMC增殖[6]。故推测DDPH对HSP及p53表达的影响，可能与已证实的DDPH钙拮抗作用有关。综上所述，DDPH降压作用与抑制VSMC增殖作用协同，其抑制VSMC增殖的作用与HSP70减少，野生型p53表达增强相关。但药物对两者的确切作用点，两者的相互调控以及是否与钙拮抗等机制直接相关，还待进一步证实。
, 百拇医药
参考文献
1 Bohr DF, Dominiczak AF, Webb RC. Pathophysiology of vasculature in hypertension. Hypertension, 1991, 18(supple Ⅲ)：115.
2 熊一力，赵华月.穿心莲成分API0134对猪主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用.中华心血管病杂志，1995，23：214.
3 倪西平，钱家庆，胡崇家 .1-(2,6-二甲基苯氧基)-2-(3，4-二甲氧基苯乙胺基)丙烷盐酸盐的降压作用.中国药理学报，1988，9：64.
4 刘绍春，吴人亮主编.免疫组织化学.第三版.武汉：同济医科大学出版社，1993：30.
5 Nicholas A, Jeannie H, Daniel HL. Regulation of human HSP70 promoter by P53. Sicience, 1993, 259：64.
6 Currie RW, Tanguay RW, Kingma JR. Heat shock response and limilation of tissue necrosis duing occusion/reperfusion in rabbit hearts. Circulasion, 1993, 87：963.
(收稿：1996-12-12 修回：1997-08-04)
(本文编辑：袁桂清), http://www.100md.com