长期实验性应激对老龄、青龄糖尿病倾向鼠血糖影响的比较 及其机制①
作者：刘幼硕 胡 敏 杨 川 姚树桥 蔡伟雄 龚耀先
单位：刘幼硕(第二附属医院老年病科 长沙 410011)；胡 敏 杨 川(代谢内分泌研究所 长沙 410011)；姚树桥 蔡伟雄 龚耀先(第二附属医院医学心理研究中心 长沙 410011)
关键词：糖尿病；实验性；血糖过多；应激；链脲佐菌素；疾病模型；动物；胰岛炎；老化；小鼠
湖南医科大学学报990601
提要 目的：比较长期实验性应激源对老龄、青龄糖尿病倾向鼠血糖和胰岛素分泌的不同影响并探讨其机制。方法：取1.5月龄(青龄)和15月龄(老龄)昆明小鼠各40只，用链脲佐菌素诱导糖尿病倾向后(STZ鼠)，各分为应激组与对照组。两组应激STZ鼠均给予6周实验性应激源刺激(限制、旋转、拥挤)，检测其空腹血糖(FBG)、空腹血浆胰岛素(FINS)、胰腺组织脂质过氧化物(LPO)和一氧化氮代谢产物(NO-2，NO-3)水平，观察胰腺组织超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化，并对STZ鼠胰岛炎的严重程度进行评分。结果：经长期实验性应激的老龄STZ鼠FBG水平增高较青龄者显著，且FINS水平明显下降；胰岛炎恶化较青龄STZ鼠严重；胰腺组织LPO和NO-2，NO-3含量增高及SOD活性降低均较青龄STZ鼠明显；上述各指标间存在相关性。结论：长期实验性应激促使老龄STZ鼠血糖增高、胰岛炎加重和胰岛素分泌机能耗竭的效应较青龄STZ鼠明显；胰腺NO过量及过氧化损伤可能参与这一差异的产生机制。
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关键词 糖尿病，实验性； 血糖过多； 应激； 链脲佐菌素； 疾病模型，动物； 胰岛炎； 老化； 小鼠
中国图书分类号 R587.1 R592 R395
Effect of long-term experimental stress on blood glucose level in
mice with diabetes-prone: the age difference and its mechanism
Liu Youshuo Hu Min Yao Shuqiao Cai Weixiong Yang Chuan Gong Yaoxia n
(Department of Geriatrics, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011)
, 百拇医药
Objective: To compare the effects of long-term experimental stressors on blood glucose level and insulin secretion in the aged and young mice with dia betes-prone and to explore the mechanism. Methods: Diabetes-prone was induced by streptozotocin (STZ) in 40 1.5-month-old mice and 40 15-month-old mice. The young and the aged STZ mice were divided randomly into the stress group and the control group, respectively. Each group contained 20 mice. Both the aged and the young stress mice were exposed to multiple stressors (restrain, rotation, c rowding) for 6 weeks. Fasting blood glucose (FBG), fasting plasma insulin (FINS) , pancreas lipid peroxidate (LPO) and the metabolic products of nitric oxide (NO -2, NO-3) levels and superoxide dismutase (SOD) activity were measured. The grade of insulitis in STZ mice was also evaluated. Results: After 6-week stress, FBG level, pancreastissue LPO and NO-2, NO-3 contents were signifi c antly higher while FINS level and SOD activity lower in the aged stress mice than those in the youngs. The insulitis malignization in the aged stress group was severer than that in the young stress group. There were correlativities among the above variables. Conclusion: The effects of long-term stress in promoting hyp erglycemia exacerbating insulitis, and inhibiting insulin secretion are more significant in the aged STZ mice than in the young ones. This difference may result from the excessive NO and the peroxide injury to the pancreas.
, 百拇医药
Key words diabetes mellitus,experimental; hyperglycemia; stress; streptozotocin; disease model,animal; insulitis; aging; mice
随着医学模式的转变，心理、社会因素如何通过应激影响糖尿病的发生、发展已日益受到人们的关注[1]。糖尿病发病率随增龄而明显增加，通常认为内在的糖尿病倾向与高龄等环境因素以及二者之间复杂的相互关系是导致其发病率增加的主要原因，但其作用机制至今仍远未明了。近年大量研究表明，健康的老龄、青龄鼠对短暂应激刺激的血糖反应性有着明显区别，部分与胰岛β细胞的增龄性改变有关。但对具有糖尿病倾向或胰岛病理缺陷的老龄鼠，长期应激刺激对其血糖水平的影响与青龄鼠有何差异及其机制则尚未见报道。为此，笔者利用链脲佐菌素(STZ)诱导的有糖尿病倾向的不同月龄昆明小鼠作研究对象，观察长期实验性应激源(限制、旋转、拥挤)对老、青龄鼠血糖的影响及其与胰岛结构和机能改变的关系，以探讨具有糖尿病倾向的衰老个体经过长期应激刺激后糖代谢变化的可能机制。
, 百拇医药
1 实验动物与方法
1.1 动物与分组 昆明小鼠80只，其中1.5月龄(青龄)鼠和15月龄(老龄)鼠各40只，腹腔内注射STZ(美国Sigma公司产品，溶解在0.1mol.L-1柠檬酸缓冲液内，pH4.0)，剂量为40mg.kg-1，1次.d-1，连续2d。按血糖、性别匹配后青龄鼠随机分为对照组和应激组各20只；老龄鼠亦依上法分为对照组和应激组各20只。4组实验鼠血糖基础值差异无显著性。动物室内光照时间上午8点至下午8点，室温保持24℃，通风良好，喂以全价营养饲料，自由进食饮水，除实验应激外无其他不良刺激。
1.2 方法
1.2.1 实验性应激源 参照Carter等[2]建立的慢性、多相性应激法，经改良后建立本实验的应激方法。(1)限制：将小鼠置于12cm×5cm×5cm空底铁盒的栅板上，保证小鼠不受压，但运动受限，且无光源。限制刺激每周随机择时进行3次，每次30min。(2)旋转：自制旋转器，转速为33r.min-1(此转速离心力最小)。旋转刺激每45～150min进行1次，每次15min。(3)拥挤：标准小鼠笼，按应激组每笼10只，对照组每笼5只的密度喂养。老、青龄鼠应激组分别给予以上应激源，持续6周；对照组则否。
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1.2.2 标本采集 ①应激实验6周前、后剪鼠尾取血各测空腹血糖1次。②应激实验6周后，断头处死全部实验鼠，将血液收集于预冷试管内(含1mg.L-1Na2EDTA20μl，抑肽酶20μl)，充分混匀后于4℃低温离心3000r.min-1，20min，取上清液贮于-70℃冰箱待测胰岛素。③钝性分离胰腺，从胰尾部取约2mm×2mm×2mm组织块用新鲜配制的Bouin氏液固定，石蜡包埋，HE染色作光镜组织学检查。④每个胰腺取部分组织按1∶10(W∶V=1g∶10ml)加入匀浆液(0.15mol.L-1磷酸盐缓冲液，pH7.4，含1mg.ml-1大豆胰蛋白酶抑制剂)，冰浴匀浆后分装待测胰腺组织脂质过氧化物(LPO)含量；部分胰腺组织匀浆于4℃低温离心10000r.min-1,30min，取上清，待测总蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和NO代谢产物(NO-2和NO-3)含量。
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1.2.3 检测方法 (1)空腹血糖(FBG)：采用美国Lifescan公司生产的ONETOUCHⅡ快速血糖仪及其配套的试纸测试。测试时间固定在上午8点至10点。测血糖前12h内动物禁食。测定值批内变异系数2.94%，批间变异系数4.92%。(2)空腹血浆胰岛素(FINS)：采用放射免疫分析法，试剂盒由华西糖尿病科技开发研究所提供。测定值批内变异系数2.71%，批间变异系数3.62%。(3)胰岛炎的严重程度评分：光学显微镜下，胰岛周围和胰岛内无淋巴细胞浸润记0分；胰腺导管周围有淋巴细胞浸润记1分；胰岛周围有淋巴细胞浸润记2分；胰岛内有淋巴细胞浸润记3分；胰岛内淋巴细胞浸润并有胰岛破坏记4分。从4张不同的切片观察每一个胰腺的10个胰岛，每一个胰腺的胰岛炎平均评分等于10个胰岛的总分数除以10。0分表示无胰岛炎，1分和2分表示胰岛周围炎，3分和4分表示胰岛内炎。盲法阅片并评分。(4)其他指标的测定：胰腺组织LPO，总蛋白，SOD，NO代谢产物NO-2和NO-3的测定。用硫代巴比妥酸荧光比色法测LPO，其浓度以每克湿组织含LPO…μmol表示，批内变异系数3.43%；Bradford法测总蛋白浓度，批内变异系数3.87%；Manklunds邻苯三酚自氧化法测SOD，以每毫克总蛋白含SOD…mU表示其活性，批内变异系数4.25%；Griess法测NO代谢产物NO-2和NO-3含量，试剂盒由中国军事医学科学院提供，亦以每毫克总蛋白含NO-2和NO-3…μmol表示其浓度，批内变异系数1.2%。
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1.2.4 统计学处理 定量及半定量数据以x±s表示；显著性检验采用单因素方差分析；相对数以百分率表 示，组间比较用χ2检验；各检测指标间作直线相关分析。
2 结 果
2.1 各实验组空腹血糖、空腹血浆胰岛素浓度比较 表1示，经6周应激实验，青龄及老龄STZ鼠空腹血糖水平均较对照组明显升高，老龄STZ鼠空腹血糖水平高于青龄STZ鼠(P<0.05)，表明长期应激刺激促使老龄STZ鼠空腹血糖升高的作用强于青龄STZ鼠。对各实验组空腹血浆胰岛素浓度进行比较发现，仅应激的老龄STZ鼠胰岛素水平下降(P<0.05)，提示衰老、应激的联合作用可降低STZ鼠空腹胰岛素分泌水平。
表1 各组动物空腹血糖、空腹血浆胰岛素 浓度(x±s) 鼠龄
组别
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鼠数
FBG(mmol.L-1)
FINS(mIU.L-1 )
基础值
实验后
实验后
1.5月龄
对照组
20
7.9±1.6
6.7±1.6
, 百拇医药 22±10
应激组
20
8.0±1.5
10.3±6.2①
20±6
15月龄
对照组
20
8.1±2.0
7.3±1.9
19±9
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应激组
20
8.3±1.8
15.2±3.6①②
13±5① ②
①与同龄对照组比较P<0.05；②与1.5月龄鼠应激组比较P<0.05
2.2 各组胰岛炎评分及其构成比的比较 表2示，各组均有不同程 度的胰岛炎。经6周应激实验，青龄及老龄STZ鼠胰岛炎评分增高(P<0.05)，有胰岛内炎且伴胰岛破坏的高评分胰岛所占比重增大(P<0.05)，其中老龄STZ鼠经长期应激刺激后胰岛炎评分增高及高评分胰岛所占比重增大较青龄STZ鼠更为显著(P<0.05)。
表2 各组动物胰岛炎评分 鼠龄
, 百拇医药
组别
鼠数
胰 岛炎评分
胰岛炎评分构成比(%)
0分
1～2分
3分
4分
1.5月龄
对照组
20
2.2 ±0.4
3
, 百拇医药
67.5
16.5
13.0
应激组
20
2.9±0.4①
0
42.0
25.5
32.5①
15月龄
对照组
, 百拇医药 20
2.1±0.5
4
69.0
15.0
12.0
应激组
20
3.2±0.3①②
0
20.0
30.0
50.0①②
, 百拇医药
①与同龄对照组比较P<0.05；②与1.5月龄鼠应激组比较P<0.05
2.3 各组胰腺组织LPO含量、SOD活性、NO-2及NO-3含量的比较 表3示，6周实验性应激后，青龄及老龄STZ鼠胰腺组织均有LPO和NO-2及NO-3升高( 均为P<0.05)SOD活性降低(P<0.05)，尤以老龄STZ鼠为著(P<0.05)。
表3 各组动物胰腺组织LPO，SOD，NO-2 和NO-3(x±s) 鼠龄
组别
鼠数
, 百拇医药
L PO
(μmol.g-1)
SOD
(mU.mg-1)
NO-2和NO-3
( μmol.mg-1)
1.5月龄
对照组
20
3.8±1.3
, 百拇医药
1142±95
14.3±4.1
应激组
20
5.3±1.4①
908±252①
28.0±9.5①
15月龄
对照组
20
4.1±2.5
1088±182
, 百拇医药
16.2±8.5
应激组
20
8.2±2.2①②
632±86①②
36.8±5.1①②
①与同龄对照组比较P<0.05；②与1.5月龄鼠应激组比较P<0.05
2.4 各指标之间的相关性 实验鼠FBG与FINS呈低度负相关(r=-0.103,P<0.01)；FINS与胰岛炎评分中度负相关(r=-0.634,P<0.01)；胰岛炎评分与胰腺组织LPO，NO-2及NO-3含量中度正相关(r=0.651,0.530,P均<0.01)，与胰腺组织SOD活性呈中度负相关(r=-0.478,P<0.01)。
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3 讨 论
Odio等[3]的系列实验以正常鼠为对象，研究了应激和衰老及其相互作用对血糖调节的影响，发现正常鼠经过长期应激，无论是由此诱发的血糖升高，还是糖负荷后胰岛素分泌的水平，老龄鼠与青龄鼠无异。然而，若实验动物已有糖尿病倾向，长期应激对于老龄与青龄鼠血糖和胰岛素分泌是否也有相同的影响内在的糖尿病倾向与外界的应激刺激又是通过何种途径相互作用的呢这些重大问题均尚无定论。
STZ是一种选择性破坏胰岛β细胞的化学制剂。单次大剂量注射可通过其短暂的细胞毒作用直接破坏胰岛β细胞，故常用于制作糖尿病动物模型；而多次小剂量重复注射仅导致胰岛轻微的病理改变，相当于诱导出糖尿病倾向，故认为该方法系用于研究糖尿病环境致病因素的较恰当的动物模型[4]。本文研究发现，长期实验性应激促使老龄STZ鼠血糖增高的作用大于青龄STZ鼠；应激后的青龄STZ鼠血浆胰岛素未随血糖增高而分泌增加，表现为胰岛素的相对不足，而老龄STZ鼠长期应激后血糖增高更明显但血浆胰岛素水平反而明显下降。此结果提示长期应激趋向于使老龄STZ鼠胰岛β细胞机能耗竭，出现胰岛素绝对缺乏。本资料还显示，长期实验性应激加重老龄STZ鼠胰岛炎的作用强于青龄STZ鼠，说明长期应激刺激(外因、心因)与STZ对胰岛的损伤(内因、体因)相互作用，形成恶性循环；这种恶性循环对于老龄STZ鼠血糖调节和胰岛素分泌的损害似更具累加作用，也可能是老龄STZ鼠在长期应激作用下其糖尿病更易发生、发展的基本环节。
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胰岛的氧自由基清除酶类活性低，因而对氧自由基损伤易感。糖尿病的发生、发展即与此有关。STZ破坏胰岛β细胞的最终通道也主要涉及STZ抑制胰岛SOD活性，导致局部氧自由基蓄积[5]。近来还发现，多次小剂量STZ重复注射所致小鼠胰岛炎的严重程度还与局部NO合成过多有关[6]；许多资料表明，老龄动物体内存在氧化/抗氧化失衡的状况，应激可使这种失衡加重，且NO也参与了应激使该失衡加重的过程[7]。笔者的研究发现，对于已有胰岛病理损害的STZ鼠，长期实验性应激使老龄鼠胰腺中LPO浓度增高和SOD活性降低较青龄鼠更为显著，NO-2及NO-3的增高也明显大于青龄鼠，胰岛损伤程度(胰岛炎评分)与血浆胰岛素水平、胰腺组织SOD活性呈中度负相关，与LPO及NO-2和NO-3含量呈中度正相关。提示长期实验性应激可能通过某种尚未阐明的机制加重了STZ鼠的胰岛炎，诱导胰岛NO的过量产生，而对于老龄STZ鼠这种诱导作用更形显著。过多的NO既可直接加重胰岛β细胞的损伤，又可通过失活胰岛局部SOD[8]，使其脂质过氧化作用进一步加强，可能加重老龄STZ鼠胰岛细胞生物膜系统的氧化损伤，从而使其β细胞分泌胰岛素明显减少，甚至机能衰竭。
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老年期的应激反应与青年期有明显区别，往往成为老年疾病的发生、发展不同于青年的病理生理基础。老年期应激反应的特殊性涉及神经、内分泌、免疫及氧化损伤等各个方面。新近有文献报道[9]，对受长期应激刺激的机体，经非ACTH途径和免疫途径的神经内分泌调节较ACTH途径更为重要，但对胰岛的调节尚缺乏研究。本研究提示，长期应激可能通过氧化损伤和NO途径加重胰岛破坏，促进糖尿病的发生、发展，此机制对于老龄机体更形显著。本文为寻找新的途径以全面防治糖尿病，尤其防治老年糖尿病提供了理论依据，同时让人们对长期应激在糖尿病发生、发展中的作用有更深刻的认识。
本所的系列研究已发现，交感-肾上腺髓质系统、下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)等中枢因素参与了长期应激使青龄STZ鼠血糖增高的中介过程[10]。然而长期应激对老龄STZ鼠上述中枢因素和对胰岛结构、机能等外周环节的作用强度及其相互作用与青龄STZ鼠又有何差异，尚待进一步探讨。至于避免外界环境中的负性应激源长期刺激，或降低应激反应水平，或纠正长期应激所致的胰岛氧化/抗氧化失衡等措施，是否可阻止或延缓老年糖尿病的发生、发展，同样值得深入研究。
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本课题承第二附属医院病理科李代强副教授阅胰岛病理切片，谨致谢意
参 考 文 献
1 龚耀先，姚树桥，戴晓阳，等.心理社会因素在糖尿病发生过程中的 作用及其机理研究(一)理论框架.中国临床心理学杂志，1997，5：69～73
2 Carter WR, Herman J, Stokes K. Promotion of diabetes onset by stress in BB rats. Diabetologia, 1987,30:674～675
3 Odio MR, Brodish A. Glucoregulatory responses of adult and aged rats after ex posure to chronic stress. Exp Gerontol, 1990,25:159～172
, 百拇医药
4 Surwit RS, Williams PG. Animal models provide insight into psychosomatic fact ors in diabetes. Psychosomatic Med, 1996,58:582～589
5 Mendola J, Wright JR, Lacy PE. Oxygen free-radical scavengers and immune des truction of murine islets in allograft rejection and multiple low-dose streptoz otocin-induced insulitis. Diabetes, 1989,38:379～385
6 Lukic ML, Stosic GS, Ostojic N, et al. Inhibition of nitric oxide generation affects the induction of diabetes by streptozotocin in mice. Biochem Biophys Res Commun, 1991,178:913～920
, 百拇医药
7 Milakofsky L, Harris N, Vogel WH. Effects of repeated stress on plasma argigine levels in young and old rats. Physiol Behav, 1993,54:725～728
8 Grow JP, Beckman JS. Reaction between nitric oxide, superoxide and peroxynitr ite: footprints of peroxynitrite in vivo. Adv Pharmacol, 1995,34:17～43
9 Bornstein SR, Chrousos GP. Adrenocorticotropin (ACTH) and non-ACTH-mediated regulation of the adrenal cortex: neural and immune inputs. J Clin Endocrinol M etab, 1999,84:1729～1736
10 姚树桥，蔡伟雄，戴晓阳，等.实验性应激对链脲佐菌素诱导鼠血糖增高的机理研究.中华医学杂志，1999，79：332～334, 百拇医药
单位：刘幼硕(第二附属医院老年病科 长沙 410011)；胡 敏 杨 川(代谢内分泌研究所 长沙 410011)；姚树桥 蔡伟雄 龚耀先(第二附属医院医学心理研究中心 长沙 410011)
关键词：糖尿病；实验性；血糖过多；应激；链脲佐菌素；疾病模型；动物；胰岛炎；老化；小鼠
湖南医科大学学报990601
提要 目的：比较长期实验性应激源对老龄、青龄糖尿病倾向鼠血糖和胰岛素分泌的不同影响并探讨其机制。方法：取1.5月龄(青龄)和15月龄(老龄)昆明小鼠各40只，用链脲佐菌素诱导糖尿病倾向后(STZ鼠)，各分为应激组与对照组。两组应激STZ鼠均给予6周实验性应激源刺激(限制、旋转、拥挤)，检测其空腹血糖(FBG)、空腹血浆胰岛素(FINS)、胰腺组织脂质过氧化物(LPO)和一氧化氮代谢产物(NO-2，NO-3)水平，观察胰腺组织超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化，并对STZ鼠胰岛炎的严重程度进行评分。结果：经长期实验性应激的老龄STZ鼠FBG水平增高较青龄者显著，且FINS水平明显下降；胰岛炎恶化较青龄STZ鼠严重；胰腺组织LPO和NO-2，NO-3含量增高及SOD活性降低均较青龄STZ鼠明显；上述各指标间存在相关性。结论：长期实验性应激促使老龄STZ鼠血糖增高、胰岛炎加重和胰岛素分泌机能耗竭的效应较青龄STZ鼠明显；胰腺NO过量及过氧化损伤可能参与这一差异的产生机制。
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关键词 糖尿病，实验性； 血糖过多； 应激； 链脲佐菌素； 疾病模型，动物； 胰岛炎； 老化； 小鼠
中国图书分类号 R587.1 R592 R395
Effect of long-term experimental stress on blood glucose level in
mice with diabetes-prone: the age difference and its mechanism
Liu Youshuo Hu Min Yao Shuqiao Cai Weixiong Yang Chuan Gong Yaoxia n
(Department of Geriatrics, The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011)
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Objective: To compare the effects of long-term experimental stressors on blood glucose level and insulin secretion in the aged and young mice with dia betes-prone and to explore the mechanism. Methods: Diabetes-prone was induced by streptozotocin (STZ) in 40 1.5-month-old mice and 40 15-month-old mice. The young and the aged STZ mice were divided randomly into the stress group and the control group, respectively. Each group contained 20 mice. Both the aged and the young stress mice were exposed to multiple stressors (restrain, rotation, c rowding) for 6 weeks. Fasting blood glucose (FBG), fasting plasma insulin (FINS) , pancreas lipid peroxidate (LPO) and the metabolic products of nitric oxide (NO -2, NO-3) levels and superoxide dismutase (SOD) activity were measured. The grade of insulitis in STZ mice was also evaluated. Results: After 6-week stress, FBG level, pancreastissue LPO and NO-2, NO-3 contents were signifi c antly higher while FINS level and SOD activity lower in the aged stress mice than those in the youngs. The insulitis malignization in the aged stress group was severer than that in the young stress group. There were correlativities among the above variables. Conclusion: The effects of long-term stress in promoting hyp erglycemia exacerbating insulitis, and inhibiting insulin secretion are more significant in the aged STZ mice than in the young ones. This difference may result from the excessive NO and the peroxide injury to the pancreas.
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Key words diabetes mellitus,experimental; hyperglycemia; stress; streptozotocin; disease model,animal; insulitis; aging; mice
随着医学模式的转变，心理、社会因素如何通过应激影响糖尿病的发生、发展已日益受到人们的关注[1]。糖尿病发病率随增龄而明显增加，通常认为内在的糖尿病倾向与高龄等环境因素以及二者之间复杂的相互关系是导致其发病率增加的主要原因，但其作用机制至今仍远未明了。近年大量研究表明，健康的老龄、青龄鼠对短暂应激刺激的血糖反应性有着明显区别，部分与胰岛β细胞的增龄性改变有关。但对具有糖尿病倾向或胰岛病理缺陷的老龄鼠，长期应激刺激对其血糖水平的影响与青龄鼠有何差异及其机制则尚未见报道。为此，笔者利用链脲佐菌素(STZ)诱导的有糖尿病倾向的不同月龄昆明小鼠作研究对象，观察长期实验性应激源(限制、旋转、拥挤)对老、青龄鼠血糖的影响及其与胰岛结构和机能改变的关系，以探讨具有糖尿病倾向的衰老个体经过长期应激刺激后糖代谢变化的可能机制。
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1 实验动物与方法
1.1 动物与分组 昆明小鼠80只，其中1.5月龄(青龄)鼠和15月龄(老龄)鼠各40只，腹腔内注射STZ(美国Sigma公司产品，溶解在0.1mol.L-1柠檬酸缓冲液内，pH4.0)，剂量为40mg.kg-1，1次.d-1，连续2d。按血糖、性别匹配后青龄鼠随机分为对照组和应激组各20只；老龄鼠亦依上法分为对照组和应激组各20只。4组实验鼠血糖基础值差异无显著性。动物室内光照时间上午8点至下午8点，室温保持24℃，通风良好，喂以全价营养饲料，自由进食饮水，除实验应激外无其他不良刺激。
1.2 方法
1.2.1 实验性应激源 参照Carter等[2]建立的慢性、多相性应激法，经改良后建立本实验的应激方法。(1)限制：将小鼠置于12cm×5cm×5cm空底铁盒的栅板上，保证小鼠不受压，但运动受限，且无光源。限制刺激每周随机择时进行3次，每次30min。(2)旋转：自制旋转器，转速为33r.min-1(此转速离心力最小)。旋转刺激每45～150min进行1次，每次15min。(3)拥挤：标准小鼠笼，按应激组每笼10只，对照组每笼5只的密度喂养。老、青龄鼠应激组分别给予以上应激源，持续6周；对照组则否。
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1.2.2 标本采集 ①应激实验6周前、后剪鼠尾取血各测空腹血糖1次。②应激实验6周后，断头处死全部实验鼠，将血液收集于预冷试管内(含1mg.L-1Na2EDTA20μl，抑肽酶20μl)，充分混匀后于4℃低温离心3000r.min-1，20min，取上清液贮于-70℃冰箱待测胰岛素。③钝性分离胰腺，从胰尾部取约2mm×2mm×2mm组织块用新鲜配制的Bouin氏液固定，石蜡包埋，HE染色作光镜组织学检查。④每个胰腺取部分组织按1∶10(W∶V=1g∶10ml)加入匀浆液(0.15mol.L-1磷酸盐缓冲液，pH7.4，含1mg.ml-1大豆胰蛋白酶抑制剂)，冰浴匀浆后分装待测胰腺组织脂质过氧化物(LPO)含量；部分胰腺组织匀浆于4℃低温离心10000r.min-1,30min，取上清，待测总蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和NO代谢产物(NO-2和NO-3)含量。
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1.2.3 检测方法 (1)空腹血糖(FBG)：采用美国Lifescan公司生产的ONETOUCHⅡ快速血糖仪及其配套的试纸测试。测试时间固定在上午8点至10点。测血糖前12h内动物禁食。测定值批内变异系数2.94%，批间变异系数4.92%。(2)空腹血浆胰岛素(FINS)：采用放射免疫分析法，试剂盒由华西糖尿病科技开发研究所提供。测定值批内变异系数2.71%，批间变异系数3.62%。(3)胰岛炎的严重程度评分：光学显微镜下，胰岛周围和胰岛内无淋巴细胞浸润记0分；胰腺导管周围有淋巴细胞浸润记1分；胰岛周围有淋巴细胞浸润记2分；胰岛内有淋巴细胞浸润记3分；胰岛内淋巴细胞浸润并有胰岛破坏记4分。从4张不同的切片观察每一个胰腺的10个胰岛，每一个胰腺的胰岛炎平均评分等于10个胰岛的总分数除以10。0分表示无胰岛炎，1分和2分表示胰岛周围炎，3分和4分表示胰岛内炎。盲法阅片并评分。(4)其他指标的测定：胰腺组织LPO，总蛋白，SOD，NO代谢产物NO-2和NO-3的测定。用硫代巴比妥酸荧光比色法测LPO，其浓度以每克湿组织含LPO…μmol表示，批内变异系数3.43%；Bradford法测总蛋白浓度，批内变异系数3.87%；Manklunds邻苯三酚自氧化法测SOD，以每毫克总蛋白含SOD…mU表示其活性，批内变异系数4.25%；Griess法测NO代谢产物NO-2和NO-3含量，试剂盒由中国军事医学科学院提供，亦以每毫克总蛋白含NO-2和NO-3…μmol表示其浓度，批内变异系数1.2%。
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1.2.4 统计学处理 定量及半定量数据以x±s表示；显著性检验采用单因素方差分析；相对数以百分率表 示，组间比较用χ2检验；各检测指标间作直线相关分析。
2 结 果
2.1 各实验组空腹血糖、空腹血浆胰岛素浓度比较 表1示，经6周应激实验，青龄及老龄STZ鼠空腹血糖水平均较对照组明显升高，老龄STZ鼠空腹血糖水平高于青龄STZ鼠(P<0.05)，表明长期应激刺激促使老龄STZ鼠空腹血糖升高的作用强于青龄STZ鼠。对各实验组空腹血浆胰岛素浓度进行比较发现，仅应激的老龄STZ鼠胰岛素水平下降(P<0.05)，提示衰老、应激的联合作用可降低STZ鼠空腹胰岛素分泌水平。
表1 各组动物空腹血糖、空腹血浆胰岛素 浓度(x±s) 鼠龄
组别
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鼠数
FBG(mmol.L-1)
FINS(mIU.L-1 )
基础值
实验后
实验后
1.5月龄
对照组
20
7.9±1.6
6.7±1.6
, 百拇医药 22±10
应激组
20
8.0±1.5
10.3±6.2①
20±6
15月龄
对照组
20
8.1±2.0
7.3±1.9
19±9
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应激组
20
8.3±1.8
15.2±3.6①②
13±5① ②
①与同龄对照组比较P<0.05；②与1.5月龄鼠应激组比较P<0.05
2.2 各组胰岛炎评分及其构成比的比较 表2示，各组均有不同程 度的胰岛炎。经6周应激实验，青龄及老龄STZ鼠胰岛炎评分增高(P<0.05)，有胰岛内炎且伴胰岛破坏的高评分胰岛所占比重增大(P<0.05)，其中老龄STZ鼠经长期应激刺激后胰岛炎评分增高及高评分胰岛所占比重增大较青龄STZ鼠更为显著(P<0.05)。
表2 各组动物胰岛炎评分 鼠龄
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组别
鼠数
胰 岛炎评分
胰岛炎评分构成比(%)
0分
1～2分
3分
4分
1.5月龄
对照组
20
2.2 ±0.4
3
, 百拇医药
67.5
16.5
13.0
应激组
20
2.9±0.4①
0
42.0
25.5
32.5①
15月龄
对照组
, 百拇医药 20
2.1±0.5
4
69.0
15.0
12.0
应激组
20
3.2±0.3①②
0
20.0
30.0
50.0①②
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①与同龄对照组比较P<0.05；②与1.5月龄鼠应激组比较P<0.05
2.3 各组胰腺组织LPO含量、SOD活性、NO-2及NO-3含量的比较 表3示，6周实验性应激后，青龄及老龄STZ鼠胰腺组织均有LPO和NO-2及NO-3升高( 均为P<0.05)SOD活性降低(P<0.05)，尤以老龄STZ鼠为著(P<0.05)。
表3 各组动物胰腺组织LPO，SOD，NO-2 和NO-3(x±s) 鼠龄
组别
鼠数
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L PO
(μmol.g-1)
SOD
(mU.mg-1)
NO-2和NO-3
( μmol.mg-1)
1.5月龄
对照组
20
3.8±1.3
, 百拇医药
1142±95
14.3±4.1
应激组
20
5.3±1.4①
908±252①
28.0±9.5①
15月龄
对照组
20
4.1±2.5
1088±182
, 百拇医药
16.2±8.5
应激组
20
8.2±2.2①②
632±86①②
36.8±5.1①②
①与同龄对照组比较P<0.05；②与1.5月龄鼠应激组比较P<0.05
2.4 各指标之间的相关性 实验鼠FBG与FINS呈低度负相关(r=-0.103,P<0.01)；FINS与胰岛炎评分中度负相关(r=-0.634,P<0.01)；胰岛炎评分与胰腺组织LPO，NO-2及NO-3含量中度正相关(r=0.651,0.530,P均<0.01)，与胰腺组织SOD活性呈中度负相关(r=-0.478,P<0.01)。
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3 讨 论
Odio等[3]的系列实验以正常鼠为对象，研究了应激和衰老及其相互作用对血糖调节的影响，发现正常鼠经过长期应激，无论是由此诱发的血糖升高，还是糖负荷后胰岛素分泌的水平，老龄鼠与青龄鼠无异。然而，若实验动物已有糖尿病倾向，长期应激对于老龄与青龄鼠血糖和胰岛素分泌是否也有相同的影响内在的糖尿病倾向与外界的应激刺激又是通过何种途径相互作用的呢这些重大问题均尚无定论。
STZ是一种选择性破坏胰岛β细胞的化学制剂。单次大剂量注射可通过其短暂的细胞毒作用直接破坏胰岛β细胞，故常用于制作糖尿病动物模型；而多次小剂量重复注射仅导致胰岛轻微的病理改变，相当于诱导出糖尿病倾向，故认为该方法系用于研究糖尿病环境致病因素的较恰当的动物模型[4]。本文研究发现，长期实验性应激促使老龄STZ鼠血糖增高的作用大于青龄STZ鼠；应激后的青龄STZ鼠血浆胰岛素未随血糖增高而分泌增加，表现为胰岛素的相对不足，而老龄STZ鼠长期应激后血糖增高更明显但血浆胰岛素水平反而明显下降。此结果提示长期应激趋向于使老龄STZ鼠胰岛β细胞机能耗竭，出现胰岛素绝对缺乏。本资料还显示，长期实验性应激加重老龄STZ鼠胰岛炎的作用强于青龄STZ鼠，说明长期应激刺激(外因、心因)与STZ对胰岛的损伤(内因、体因)相互作用，形成恶性循环；这种恶性循环对于老龄STZ鼠血糖调节和胰岛素分泌的损害似更具累加作用，也可能是老龄STZ鼠在长期应激作用下其糖尿病更易发生、发展的基本环节。
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胰岛的氧自由基清除酶类活性低，因而对氧自由基损伤易感。糖尿病的发生、发展即与此有关。STZ破坏胰岛β细胞的最终通道也主要涉及STZ抑制胰岛SOD活性，导致局部氧自由基蓄积[5]。近来还发现，多次小剂量STZ重复注射所致小鼠胰岛炎的严重程度还与局部NO合成过多有关[6]；许多资料表明，老龄动物体内存在氧化/抗氧化失衡的状况，应激可使这种失衡加重，且NO也参与了应激使该失衡加重的过程[7]。笔者的研究发现，对于已有胰岛病理损害的STZ鼠，长期实验性应激使老龄鼠胰腺中LPO浓度增高和SOD活性降低较青龄鼠更为显著，NO-2及NO-3的增高也明显大于青龄鼠，胰岛损伤程度(胰岛炎评分)与血浆胰岛素水平、胰腺组织SOD活性呈中度负相关，与LPO及NO-2和NO-3含量呈中度正相关。提示长期实验性应激可能通过某种尚未阐明的机制加重了STZ鼠的胰岛炎，诱导胰岛NO的过量产生，而对于老龄STZ鼠这种诱导作用更形显著。过多的NO既可直接加重胰岛β细胞的损伤，又可通过失活胰岛局部SOD[8]，使其脂质过氧化作用进一步加强，可能加重老龄STZ鼠胰岛细胞生物膜系统的氧化损伤，从而使其β细胞分泌胰岛素明显减少，甚至机能衰竭。
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老年期的应激反应与青年期有明显区别，往往成为老年疾病的发生、发展不同于青年的病理生理基础。老年期应激反应的特殊性涉及神经、内分泌、免疫及氧化损伤等各个方面。新近有文献报道[9]，对受长期应激刺激的机体，经非ACTH途径和免疫途径的神经内分泌调节较ACTH途径更为重要，但对胰岛的调节尚缺乏研究。本研究提示，长期应激可能通过氧化损伤和NO途径加重胰岛破坏，促进糖尿病的发生、发展，此机制对于老龄机体更形显著。本文为寻找新的途径以全面防治糖尿病，尤其防治老年糖尿病提供了理论依据，同时让人们对长期应激在糖尿病发生、发展中的作用有更深刻的认识。
本所的系列研究已发现，交感-肾上腺髓质系统、下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)等中枢因素参与了长期应激使青龄STZ鼠血糖增高的中介过程[10]。然而长期应激对老龄STZ鼠上述中枢因素和对胰岛结构、机能等外周环节的作用强度及其相互作用与青龄STZ鼠又有何差异，尚待进一步探讨。至于避免外界环境中的负性应激源长期刺激，或降低应激反应水平，或纠正长期应激所致的胰岛氧化/抗氧化失衡等措施，是否可阻止或延缓老年糖尿病的发生、发展，同样值得深入研究。
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本课题承第二附属医院病理科李代强副教授阅胰岛病理切片，谨致谢意
参 考 文 献
1 龚耀先，姚树桥，戴晓阳，等.心理社会因素在糖尿病发生过程中的 作用及其机理研究(一)理论框架.中国临床心理学杂志，1997，5：69～73
2 Carter WR, Herman J, Stokes K. Promotion of diabetes onset by stress in BB rats. Diabetologia, 1987,30:674～675
3 Odio MR, Brodish A. Glucoregulatory responses of adult and aged rats after ex posure to chronic stress. Exp Gerontol, 1990,25:159～172
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4 Surwit RS, Williams PG. Animal models provide insight into psychosomatic fact ors in diabetes. Psychosomatic Med, 1996,58:582～589
5 Mendola J, Wright JR, Lacy PE. Oxygen free-radical scavengers and immune des truction of murine islets in allograft rejection and multiple low-dose streptoz otocin-induced insulitis. Diabetes, 1989,38:379～385
6 Lukic ML, Stosic GS, Ostojic N, et al. Inhibition of nitric oxide generation affects the induction of diabetes by streptozotocin in mice. Biochem Biophys Res Commun, 1991,178:913～920
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7 Milakofsky L, Harris N, Vogel WH. Effects of repeated stress on plasma argigine levels in young and old rats. Physiol Behav, 1993,54:725～728
8 Grow JP, Beckman JS. Reaction between nitric oxide, superoxide and peroxynitr ite: footprints of peroxynitrite in vivo. Adv Pharmacol, 1995,34:17～43
9 Bornstein SR, Chrousos GP. Adrenocorticotropin (ACTH) and non-ACTH-mediated regulation of the adrenal cortex: neural and immune inputs. J Clin Endocrinol M etab, 1999,84:1729～1736
10 姚树桥，蔡伟雄，戴晓阳，等.实验性应激对链脲佐菌素诱导鼠血糖增高的机理研究.中华医学杂志，1999，79：332～334, 百拇医药