伯氏疏螺旋体外膜蛋白C基因在大肠杆菌中的表达
作者：佟玉品 毕胜利 冯方波 贾月萍
单位：佟玉品、冯方波、贾月萍 100094 北京，北京军区第261医院；毕胜利 中国预防医学科学院病毒学研究所
关键词：伯氏疏螺旋体；外膜蛋白；基因表达；聚合酶链反应
中华传染病杂志990409 【摘要】 目的 体外表达伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)，以制备基因工程重组抗原用于莱姆病血清学诊断研究。方法 应用聚合酶链反应技术和基因重组技术，从2个伯氏疏螺旋体中国分离株基因组DNA中扩增得到OspC基因，分别克隆到表达载体LKB2中，在大肠杆菌中进行表达。结果 以天然蛋白形式高效表达了OspC。扫描分析显示，表达的OspC相对分子质量均在23 000左右，表达量占菌体总蛋白的34%～50%。Western blot试验证明，重组OspC蛋白可与莱姆病患者血清发生特异性反应。结论 重组OspC的成功表达为制备新型莱姆病早期诊断试剂奠定了基础。
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Expression of outer surface protein C of Borrelia burgdorferi in Escherichia coli
TONG Yupin, BI Shengli, FENG Fangbo, et al.
Department of Experimental Medicine, 261st Hospital of PLA. Beijing 100094
【Abstract】 Objective In order to express outer surface protein C(OspC) of Borrelia burgdorferi in vitro and make research on the serodiagnosis of Lime disease with recombinant protein. Methods OspC gene, amplified from two Chinese isolates of Borrelia burgdorferi, were cloned into an expression vector LKB2 respectively. Two expressed vectors BT-OspC and BJ-OspC were constructed and then expressed in E.coli. Results OspC proteins were expressed heavily in a nonfused form which weighted 23 000 and accounted for 34%～50% of total bacterial protein. Western blot analysis showed that the expressed protein could be specifically recognized by the sera from patients with Lyme disease. Conclusion The successful expression of recombinant OspC protein makes a foundation for developing early diagnostic agents for Lyme disease.
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【Key words】 Borrelia burgdorferi Outer membrane protein Gene expression Polymerase chain reaction
莱姆病是一种蜱媒疫源性疾病，在某些地区及特殊群体中感染率及发病率较高[1]。但目前国内尚缺少敏感、特异的诊断方法，以做到早期诊断、及时治疗。伯氏疏螺旋体(Borrelia Burgdorferi)是莱姆病的致病病原体，其外膜蛋白有较强的抗原性，国外研究报道，外膜蛋白C(OspC)具有很强的免疫原性，机体在感染早期可产生特异性IgM抗体，应用纯化抗原免疫动物，在实验动物感染后很短时间即可检测到高滴度的IgM抗体，重组OspC已用于莱姆病的血清学诊断[2，3]。为了进一步研究伯氏疏螺旋体中国分离株OspC的免疫原性，我们从2个国内分离株中扩增出OspC基因，插入表达载体LKB2，并在大肠杆菌中进行表达，以期制备基因工程重组抗原，应用于伯氏疏螺旋体OspC的抗原性和免疫原性研究及莱姆病的早期血清学诊断。
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材料与方法
一、菌株培养及基因组DNA制备
伯氏疏螺旋体分离株BT01为北京西山地区长角血蜱分离株，BJ-9011为一莱姆病患者血液分离株[4，5]。均由本室保存并在BSK培养基中培养，其基因组DNA制备按常规方法进行。
二、血清标本
莱姆病IgM、IgG抗体阳性血清均来自北京军区某团战士，经临床诊断及IFA检测证实。
三、质粒和菌种
表达质粒LKB2和宿主菌BL21(DE3)由中国预防医学科学院病毒学研究所肝炎室提供。
四、引物和主要试剂
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聚合酶链反应(PCR)引物参照文献[6]，PKo株基因序列自行设计，上游引物：5′GCGCCATGAATAATTCAGGGA3′，下游引物：5′TTAAGGTTTTTTTGGAC3′由中国科学院微生物研究所合成。扩增片断为除信号肽外的OspC基因，长度约582bp。限制性内切酶、T4DNA连接酶、Klenow酶等购自Biolab公司，dNTP、Taq DNA聚合酶为Promega公司产品，其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
五、OspC基因克隆
PCR方法及扩增产物鉴定参照文献[7]进行，扩增产物Klenow酶补平后用DEAE-纤维素膜电泳回收法回收，再经NcoI酶切处理。同时将质粒载体LKB2进行NcoI和SmaI双酶切，回收。T4DNA连接酶连接PCR产物和载体，转化大肠杆菌BL21，经NcoI和ClaI双酶切鉴定阳性克隆。
六、OspC基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白SDS-PAGE分析
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将酶切鉴定阳性的重组质粒BT-OspC和BJ-OspC分别转化宿主菌BL21，挑选单斑活化至A600约0.6，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，其诱导浓度为1mM，37℃诱导3小时，收集菌体，离心弃上清，细菌沉淀用12.5%SDS-PAGE电泳检测。并用日本Shimadzu产CS-9301PC型薄层扫描仪分析表达蛋白大小及含量。
七、免疫印迹(Western blot)分析
以空载体的转化菌作对照，用12.5%SDS-PAGE电泳分析两表达质粒，将凝胶分成相同两份，分别进行考马斯亮蓝染色和免疫印迹试验。Western blot方法如下：通过电转仪将凝胶上蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为100V，200mA转印1.5小时。以20%小牛血清室温封闭2小时，洗涤，将膜转入1∶100稀释的莱姆病IgM抗体阳性患者血清，37℃反应1小时，洗涤后，将膜转入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM中，室温反应2小时，以底物4氯-1-萘酚(4CN)和0.01%过氧化氢溶液显色10～20分钟，用去离子水漂洗以终止反应。
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结果
一、PCR扩增产物分析及重组质粒的鉴定
通过PCR反应两株螺旋体皆扩增出580bp左右的DNA片段，与预期实验结果一致。重组质粒BT-OspC和BJ-OspC经内切酶NcoI和ClaI酶切，也都能切下一920bp左右的DNA带(载体LKB2中NcoI和ClaI酶切位点之间为335bp)，表明PCR结果及重组质粒酶切分析与设计相符。
二、重组OspC蛋白表达和免疫印迹分析
经挑选的表达质粒BT-OspC和BJ-OspC经常规IPTG诱导表达，发现在诱导3小时时表达量较高，对照蛋白相对分子质量标准，两重组质粒表达蛋白均大于20 000，经薄层扫描仪分析其相对分子质量均为23 000，与实验设计预期结果相符。表达蛋白占总蛋白的34%～50%。免疫印迹试验表明该两重组蛋白皆可与患者血清发生特异性反应(图1，2)。
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M：蛋白分子质量标准1：BT-OspC 2：BJ-OspC 3：LKB2质粒对照
图1 表达重组蛋白OspC的SDS-PAGE分析
1：BT-OspC 2：BJ-OspC 3：LKB2质粒对照
图2 表达重组蛋白OspC的Western blot分析
讨论
莱姆病可造成机体多系统受损，如做到早期诊断和及时治疗则能减少其对机体损伤程度。利用基因工程重组抗原诊断莱姆病的实验表明，重组抗原可提高检测的敏感性和特异性。尤其OspC对早期诊断具有很大意义。Magnarelli等[8]将重组外膜蛋白OspA、OspB、OspC、OspE、OspF及重组鞭毛蛋白P41-G应用ELISA检测莱姆病患者IgM抗体，结果发现，OspC和P41-G对早期感染的检出率高于其它抗原，提示OspC在莱姆病早期诊断上具有优势。因此，本实验在成功地克隆了2株莱姆病螺旋体OspC基因基础上，应用DNA测序仪对其进行序列分析，结果表明所测2株伯氏疏螺旋体OspC基因与国外分离株在核苷酸和氨基酸水平均有较高的同源性[9]。在应用原核系统表达重组蛋白时，去除编码OspC信号肽的57个碱基，将编码成熟OspC蛋白部分克隆到表达载体LKB2，并在大肠杆菌中进行表达。结果经SDS-PAGE和Western blot及薄层扫描仪分析显示，该蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，表达蛋白占总蛋白的34%以上，最高可达50%，相对分子质量约为23 000，并可与莱姆病患者血清发生特异反应。表达产物经超声处理，离心后分别取上清及沉淀电泳分析，表达蛋白存在于上清中，说明其为可溶性蛋白。国外文献报道的重组OspC蛋白虽然是可溶性，但均以融合蛋白形式存在，如与谷胱苷肽转移酶(GST)融合，应用中可发生非特异反应，本研究将OspC以天然蛋白形式表达，又为可溶性蛋白，为今后蛋白纯化及用于莱姆病血清学诊断及流行病学研究奠定了基础。
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参考文献
1 Coyle PK. Borrelia burgdorferi infection: clinical diagnostic techniques. Immunol Invest, 1997,26:117-128.
2 Fung BP, Mchugh GL, Leong JM, et al. Humoral immnue response to outer surface protein Cof Borrelia burgdorferi in lyme diseases: role of the immunoglobulin M response in the serodiagnosis of early infection. Infect Immun, 1994.62:3213-3221.
3 Gerber MA, Shapiro ED, Bell GL, et al. Recombinant outer surface protein C ELISA for the diagnosis of early lyme diseases, J Infect Dis, 1995,171:724-727.
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4 张薇芬，周国苹，冯方波，等.北京西山地区莱姆病螺旋体的主要生物媒介调查.中国公共卫生，1993，9：58，60.
5 张薇芬，周国苹，冯方波，等.从一例白癜风患者血液中分离出莱姆病螺旋体.中华医学检验杂志，1992，15：94-96.
6 Fuchs R, Jauris S, Lottspeich F, et al. Molecular analysis and expression of a Borrelia burgdorferi gene encoding a 22KD protein (pC) in Escherchia coli. Molecular Microbiology, 1992,6:503-509.
7 Sambrook J, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual 2nd. New York: Cold Spring Harbor laboratory press, 1989,34-75.
8 Magnarelli LA, Fikrig E, Padula SJ, et al. Use of recombinant antigens of in serologic tests for diagnosis of lyme borreliosis. J Clin Microbiol, 1996,34:237-240.
9 佟玉品，杨新科，冯方波，等.莱姆病螺旋体中国分离株外膜蛋白C基因的克隆与序列分析.中华医学杂志，1998，78：551-553.
(收稿：1998-11-22 修回：1999-06-17), 百拇医药
单位：佟玉品、冯方波、贾月萍 100094 北京，北京军区第261医院；毕胜利 中国预防医学科学院病毒学研究所
关键词：伯氏疏螺旋体；外膜蛋白；基因表达；聚合酶链反应
中华传染病杂志990409 【摘要】 目的 体外表达伯氏疏螺旋体外膜蛋白C(OspC)，以制备基因工程重组抗原用于莱姆病血清学诊断研究。方法 应用聚合酶链反应技术和基因重组技术，从2个伯氏疏螺旋体中国分离株基因组DNA中扩增得到OspC基因，分别克隆到表达载体LKB2中，在大肠杆菌中进行表达。结果 以天然蛋白形式高效表达了OspC。扫描分析显示，表达的OspC相对分子质量均在23 000左右，表达量占菌体总蛋白的34%～50%。Western blot试验证明，重组OspC蛋白可与莱姆病患者血清发生特异性反应。结论 重组OspC的成功表达为制备新型莱姆病早期诊断试剂奠定了基础。
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Expression of outer surface protein C of Borrelia burgdorferi in Escherichia coli
TONG Yupin, BI Shengli, FENG Fangbo, et al.
Department of Experimental Medicine, 261st Hospital of PLA. Beijing 100094
【Abstract】 Objective In order to express outer surface protein C(OspC) of Borrelia burgdorferi in vitro and make research on the serodiagnosis of Lime disease with recombinant protein. Methods OspC gene, amplified from two Chinese isolates of Borrelia burgdorferi, were cloned into an expression vector LKB2 respectively. Two expressed vectors BT-OspC and BJ-OspC were constructed and then expressed in E.coli. Results OspC proteins were expressed heavily in a nonfused form which weighted 23 000 and accounted for 34%～50% of total bacterial protein. Western blot analysis showed that the expressed protein could be specifically recognized by the sera from patients with Lyme disease. Conclusion The successful expression of recombinant OspC protein makes a foundation for developing early diagnostic agents for Lyme disease.
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【Key words】 Borrelia burgdorferi Outer membrane protein Gene expression Polymerase chain reaction
莱姆病是一种蜱媒疫源性疾病，在某些地区及特殊群体中感染率及发病率较高[1]。但目前国内尚缺少敏感、特异的诊断方法，以做到早期诊断、及时治疗。伯氏疏螺旋体(Borrelia Burgdorferi)是莱姆病的致病病原体，其外膜蛋白有较强的抗原性，国外研究报道，外膜蛋白C(OspC)具有很强的免疫原性，机体在感染早期可产生特异性IgM抗体，应用纯化抗原免疫动物，在实验动物感染后很短时间即可检测到高滴度的IgM抗体，重组OspC已用于莱姆病的血清学诊断[2，3]。为了进一步研究伯氏疏螺旋体中国分离株OspC的免疫原性，我们从2个国内分离株中扩增出OspC基因，插入表达载体LKB2，并在大肠杆菌中进行表达，以期制备基因工程重组抗原，应用于伯氏疏螺旋体OspC的抗原性和免疫原性研究及莱姆病的早期血清学诊断。
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材料与方法
一、菌株培养及基因组DNA制备
伯氏疏螺旋体分离株BT01为北京西山地区长角血蜱分离株，BJ-9011为一莱姆病患者血液分离株[4，5]。均由本室保存并在BSK培养基中培养，其基因组DNA制备按常规方法进行。
二、血清标本
莱姆病IgM、IgG抗体阳性血清均来自北京军区某团战士，经临床诊断及IFA检测证实。
三、质粒和菌种
表达质粒LKB2和宿主菌BL21(DE3)由中国预防医学科学院病毒学研究所肝炎室提供。
四、引物和主要试剂
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聚合酶链反应(PCR)引物参照文献[6]，PKo株基因序列自行设计，上游引物：5′GCGCCATGAATAATTCAGGGA3′，下游引物：5′TTAAGGTTTTTTTGGAC3′由中国科学院微生物研究所合成。扩增片断为除信号肽外的OspC基因，长度约582bp。限制性内切酶、T4DNA连接酶、Klenow酶等购自Biolab公司，dNTP、Taq DNA聚合酶为Promega公司产品，其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
五、OspC基因克隆
PCR方法及扩增产物鉴定参照文献[7]进行，扩增产物Klenow酶补平后用DEAE-纤维素膜电泳回收法回收，再经NcoI酶切处理。同时将质粒载体LKB2进行NcoI和SmaI双酶切，回收。T4DNA连接酶连接PCR产物和载体，转化大肠杆菌BL21，经NcoI和ClaI双酶切鉴定阳性克隆。
六、OspC基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白SDS-PAGE分析
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将酶切鉴定阳性的重组质粒BT-OspC和BJ-OspC分别转化宿主菌BL21，挑选单斑活化至A600约0.6，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，其诱导浓度为1mM，37℃诱导3小时，收集菌体，离心弃上清，细菌沉淀用12.5%SDS-PAGE电泳检测。并用日本Shimadzu产CS-9301PC型薄层扫描仪分析表达蛋白大小及含量。
七、免疫印迹(Western blot)分析
以空载体的转化菌作对照，用12.5%SDS-PAGE电泳分析两表达质粒，将凝胶分成相同两份，分别进行考马斯亮蓝染色和免疫印迹试验。Western blot方法如下：通过电转仪将凝胶上蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为100V，200mA转印1.5小时。以20%小牛血清室温封闭2小时，洗涤，将膜转入1∶100稀释的莱姆病IgM抗体阳性患者血清，37℃反应1小时，洗涤后，将膜转入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM中，室温反应2小时，以底物4氯-1-萘酚(4CN)和0.01%过氧化氢溶液显色10～20分钟，用去离子水漂洗以终止反应。
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结果
一、PCR扩增产物分析及重组质粒的鉴定
通过PCR反应两株螺旋体皆扩增出580bp左右的DNA片段，与预期实验结果一致。重组质粒BT-OspC和BJ-OspC经内切酶NcoI和ClaI酶切，也都能切下一920bp左右的DNA带(载体LKB2中NcoI和ClaI酶切位点之间为335bp)，表明PCR结果及重组质粒酶切分析与设计相符。
二、重组OspC蛋白表达和免疫印迹分析
经挑选的表达质粒BT-OspC和BJ-OspC经常规IPTG诱导表达，发现在诱导3小时时表达量较高，对照蛋白相对分子质量标准，两重组质粒表达蛋白均大于20 000，经薄层扫描仪分析其相对分子质量均为23 000，与实验设计预期结果相符。表达蛋白占总蛋白的34%～50%。免疫印迹试验表明该两重组蛋白皆可与患者血清发生特异性反应(图1，2)。
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M：蛋白分子质量标准1：BT-OspC 2：BJ-OspC 3：LKB2质粒对照
图1 表达重组蛋白OspC的SDS-PAGE分析
1：BT-OspC 2：BJ-OspC 3：LKB2质粒对照
图2 表达重组蛋白OspC的Western blot分析
讨论
莱姆病可造成机体多系统受损，如做到早期诊断和及时治疗则能减少其对机体损伤程度。利用基因工程重组抗原诊断莱姆病的实验表明，重组抗原可提高检测的敏感性和特异性。尤其OspC对早期诊断具有很大意义。Magnarelli等[8]将重组外膜蛋白OspA、OspB、OspC、OspE、OspF及重组鞭毛蛋白P41-G应用ELISA检测莱姆病患者IgM抗体，结果发现，OspC和P41-G对早期感染的检出率高于其它抗原，提示OspC在莱姆病早期诊断上具有优势。因此，本实验在成功地克隆了2株莱姆病螺旋体OspC基因基础上，应用DNA测序仪对其进行序列分析，结果表明所测2株伯氏疏螺旋体OspC基因与国外分离株在核苷酸和氨基酸水平均有较高的同源性[9]。在应用原核系统表达重组蛋白时，去除编码OspC信号肽的57个碱基，将编码成熟OspC蛋白部分克隆到表达载体LKB2，并在大肠杆菌中进行表达。结果经SDS-PAGE和Western blot及薄层扫描仪分析显示，该蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，表达蛋白占总蛋白的34%以上，最高可达50%，相对分子质量约为23 000，并可与莱姆病患者血清发生特异反应。表达产物经超声处理，离心后分别取上清及沉淀电泳分析，表达蛋白存在于上清中，说明其为可溶性蛋白。国外文献报道的重组OspC蛋白虽然是可溶性，但均以融合蛋白形式存在，如与谷胱苷肽转移酶(GST)融合，应用中可发生非特异反应，本研究将OspC以天然蛋白形式表达，又为可溶性蛋白，为今后蛋白纯化及用于莱姆病血清学诊断及流行病学研究奠定了基础。
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参考文献
1 Coyle PK. Borrelia burgdorferi infection: clinical diagnostic techniques. Immunol Invest, 1997,26:117-128.
2 Fung BP, Mchugh GL, Leong JM, et al. Humoral immnue response to outer surface protein Cof Borrelia burgdorferi in lyme diseases: role of the immunoglobulin M response in the serodiagnosis of early infection. Infect Immun, 1994.62:3213-3221.
3 Gerber MA, Shapiro ED, Bell GL, et al. Recombinant outer surface protein C ELISA for the diagnosis of early lyme diseases, J Infect Dis, 1995,171:724-727.
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4 张薇芬，周国苹，冯方波，等.北京西山地区莱姆病螺旋体的主要生物媒介调查.中国公共卫生，1993，9：58，60.
5 张薇芬，周国苹，冯方波，等.从一例白癜风患者血液中分离出莱姆病螺旋体.中华医学检验杂志，1992，15：94-96.
6 Fuchs R, Jauris S, Lottspeich F, et al. Molecular analysis and expression of a Borrelia burgdorferi gene encoding a 22KD protein (pC) in Escherchia coli. Molecular Microbiology, 1992,6:503-509.
7 Sambrook J, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual 2nd. New York: Cold Spring Harbor laboratory press, 1989,34-75.
8 Magnarelli LA, Fikrig E, Padula SJ, et al. Use of recombinant antigens of in serologic tests for diagnosis of lyme borreliosis. J Clin Microbiol, 1996,34:237-240.
9 佟玉品，杨新科，冯方波，等.莱姆病螺旋体中国分离株外膜蛋白C基因的克隆与序列分析.中华医学杂志，1998，78：551-553.
(收稿：1998-11-22 修回：1999-06-17), 百拇医药