TNF-α在肠源性内毒素血症中的作用及丹参防治机制研究
作者：郑晓宾 韩德五 马学惠 许瑞龄 赵元昌
单位：山西医科大学病理生理教研室(太原 030001)
关键词：肿瘤坏死因子；肝脏病；内毒素类；中草药
中国病理生理杂志990116 摘 要 目的：研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在肠源性内毒素血症中的作用及丹参防治肝损伤机制。方法：用硫代乙酰胺(TAA)诱发大鼠急性肝损伤，检测血浆内毒素、TNF-α及丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平变化，并与丹参治疗组进行比较。结果：TAA诱发急性肝损伤大鼠血浆内毒素及TNF-α含量升高，二者呈正相关；血浆ALT亦升高，与TNF-α亦呈正相关。丹参治疗组大鼠血浆TNF-α及ALT水平均低于肝损伤对照组。结论：TAA引起肠源性内毒素血症，内毒素促进TNF-α释放，TNF-α进一步介导肝损伤。丹参防治肝损伤作用机制之一可能是通过降低TNF-α水平而实现的。
, 百拇医药
Effect of tumor necrosis factor-α on gut-derived endotoxemia in rats
ZHENG Xiao-Bin, HAN De-Wu, MA Xue-Hui, XU Rui-Ling, ZHAO Yuan-Chang
Department of Pathophysiology, Shanxi Medical University, Taiyuan (030001)
Abstract AIM:To study the effects of tumor necrosis factor-αon gut-derived endotoxemia in rats and the preventive and therapeutive effects of Radix Salviac Miltiorrhizac (RSM). METHODS: Endotoxin, TNF-α and ALT (alanine aminotransferase) levels were determined in plasma of acute hepatic injury rats induced by TAA (thioacetamide), the results were compared with that obtained from RSM group. RESULTS:Plasma endotoxin and TNF-α levels were increased in rats of TAA group and there were a positive correlation between endotoxin and TNF-α contents (r=0.8326,P<0.05).Plasma ALT contents also increased in TAA group and correlated with TNF-α level(r=0.8237, P<0.05).RSM decreased plasma TNF-α and ALT contents at the same time. CONCLUSION:TNF-α might played an important role in endotoxin-mediated hepatic injury. RSM may displayed its preventive and therapeutic effects by way of TNF-α level down-regulation.
, 百拇医药
MeSH Tumor necrosis factor; Liver diseases; Endotoxins; Drugs, Chinese herbal
正常肠道产生的内毒素在肝脏经Kupffer细胞解毒。肝损伤时，kuffer细胞受损，解毒功能下降，而导致肠源性内毒素血症[1～6]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)为内毒素刺激巨噬细胞释放的细胞因子之一，参与引起发热、休克等病理过程。关于内毒素与TNF-α关系的研究报道多是采用外源性注射内毒素，对肠源性内毒素与TNF-α关系的报道则很少。本研究是采用肝毒物硫代乙酰胺( thioacetamide,TAA)诱发急性肝损伤，观察急性肝损伤时肠源性内毒素血症与TNF-α的关系，以探讨内毒素致肝损伤机制，同时观察了丹参的防治作用。
材料与方法
(一)实验动物：Wistar大鼠，体重180～220 g，雌雄兼用。
, 百拇医药
(二)实验方法：实验动物随机分为正常对照组、TAA组、TAA+丹参组。实验第1天开始TAA+丹参组动物皮下注射丹参注射液(丹参经水煎醇沉后，取上清液制成，每mL含生药0.5 g)，每天1次，每次1 mL/200 g体重。TAA组给等量生理盐水。实验第3天，TAA组与TAA+丹参组动物皮下注射TAA，600 mg/kg体重。TAA组在注射TAA后1、6、12、24、48 h处死动物，TAA+丹参组于注射TAA后24 h与正常对照组同时处死。在乙醚轻麻下，由腹主动脉无菌取肝素抗凝血，测定血浆内毒素、TNF-α及丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)水平。取动物肝脏，10%福尔马林固定，石腊包埋，切片，HE染色，进行组织学观察。
(三)检测方法：
1.内毒素：鲎试剂法，上海医学化验所提供药盒。
2.TNF-α：酶联免疫吸附法，军事医学科学院提供药盒。
, 百拇医药
3.ALT：赖氏法。
(四)统计分析：采用方差分析及直线相关分析。数据以
±s表示。
结 果
(一)急性肝损伤动物血浆内毒素含量动态变化：见图1，实验动物在注射TAA后1 h，血浆内毒素水平明显高于正常对照组，12、24 h内毒素水平高于1、6 h，48 h达高峰，表明TAA引起肝损伤可导致肠源性内毒素血症，并随时间变化而升高。
Fig 1 Changes of plasma endotoxin levels in rats of normal and TAA group after TAA injection 1\, 6\, 12\,24\, 48h.(n=6,±s) *P<0.01, vs normal
, 百拇医药
图1 正常对照组与TAA组注射TAA后1、6、12、24、48 h血浆内毒素含量动态变化
(二)急性肝损伤动物血浆TNF-α浓度动态变化：见图2，动物注射TAA后1 h，血浆TNF-α明显高于正常对照组，48 h达高峰。给TAA后24 h TNF-α与血浆内毒素含量相关分析表明二者呈正相关(r=0.8326,P<0.05)。
Fig 2 Changes of plasma TNF-α levels in rats of normal and TAA group after TAA injection 1\, 6\, 12\,24\, 48h.(n=6,±s), *P<0.01, vs normal
, 百拇医药 图2 正常对照组与TAA组注射TAA后1、6、12、24、48 h血浆TNF-α含量动态变化
Fig 3 Changes of plasma ALT levels in rats of normal and TAA group after TAA injection 1\, 6\, 12\,24\, 48h.(n=6,±s) *P<0.05,**P<0.01, vs normal
图3 正常对照组与TAA组注射TAA后1、6、12、24、48 h血浆ALT动态变化
(三)急性肝损伤动物血浆ALT水平动态变化：见图3，动物注射TAA后24 h，ALT水平开始升高，48 h达高峰。注射TAA后24 h血浆ALT与TNF-α含量相关分析表明二者呈明显正相关(r=0.8237,P<0.05)。从3个附图可看出，动物注射TAA后，血浆内毒素及TNF-α先升高，24 h后ALT 升高，提示可能是TAA导致肠源性内毒素血症，以TNF-α介导进一步引起肝损伤。
, 百拇医药
(四)丹参的防治作用：从表1可看出，TAA+丹参组动物注射TAA 24 h后，血浆TNF-α及ALT含量明显低于TAA组，表明丹参防治肝损伤可能与其降低TNF-α浓度有关。表1 注射TAA后24 h血浆TNF-α及ALT含量比较
Tab 1 Comparison of plasma TNF-α, ALT levels at
24 hours after injection of TAA(±s, n=6) Group
TNF-α(μg/L)
ALT(U)
Normal control
, 百拇医药 1.09±1.30
58.96±14.20
TAA
14.79±1.82
180.14±100.57
TAA+RSM
11.71±3.00*
94.59±47.02*
*P<0.05， vs TAA group； RSM:Radix Salviae Miltiorrhizae
(五)组织学观察：TAA组动物注射TAA后1、6 h，肝细胞轻度肿胀，12 h逐渐加重，24 h肝细胞明显水变性，并见点状坏死，汇管区有淋巴细胞及巨噬细胞浸润，48 h坏死加重。TAA+丹参组动物注射TAA后24 h，肝细胞坏死及炎症反应均较TAA组轻。组织学观察与ALT测定结果相一致。讨 论
, 百拇医药
韩德五曾提出“肠源性内毒素血症假说”，该假说认为：在肝损伤时，由于Kupffer细胞功能下降，不能有效地清除肠道来源的内毒素，致内毒素进入大循环，造成肠源性内毒素血症，从而引起肝功能不全甚至肝功能衰竭的一系列症状与体征[6]。本实验采用TAA诱发急性肝损伤，TAA为常用的肝毒物，也是弱致癌物，小剂量长期应用可致肝癌，大剂量可致急性肝损伤。实验动物接受TAA注射后，迅速产生肠源性内毒素血症，并随时间变化而加重，进一步支持了上述理论。
已知内毒素能刺激巨噬细胞产生TNF-α，TNF-α进一步介导内毒素的效应[7]。本实验结果表明，动物注射TAA后，血浆内毒素升高的同时，TNF-α亦升高，二者呈正相关。ALT正常存在于肝细胞内，当肝细胞变性、坏死时，细胞膜通透性升高，ALT入血，使血浆ALT水平升高，因此测定ALT水平可反映肝细胞损伤程度。本实验观察到，动物注射TAA后1 h血浆内毒素及TNF-α升高，而24 h后ALT明显升高，且与TNF-α含量呈正相关，因而可以推断，内毒素血症刺激巨噬细胞产生、释放TNF-α，后者参与引起肝细胞损伤，即内毒素引起肝细胞损伤可能是通过TNF-α进一步介导的。
, 百拇医药
值得一提的是，国内外曾有内毒素、TNF-α与肝损伤关系的研究报道，如Harbrecht等是从体外注射内毒素[8]，与内源性产生内毒素尚有区别；国内报道给大鼠D-氨基半乳糖后有TNF-α产生，但未检测内毒素，不能圆满解释TNF-α增多的起因[9]。本实验研究肠源性内毒素血症与TNF-α产生及肝损伤的关系更接近于临床病人情况。
丹参是常用的活血化瘀药物，我们曾多次实验证明丹参具有抗肝损伤作用。本实验显示丹参在降低血浆TNF-α含量的同时，降低了ALT水平，表明丹参防治肝损伤途径之一是通过降低TNF-α而实现的，这对进一步研究丹参作用机制及临床应用提供了一定的理论基础。
参考文献
1 韩德五主编.肝脏病理生理学.第一版.太原：山西高校联合出处社，1992.248～265.
, http://www.100md.com 2 邢桦云，韩德五，马学惠，等.内毒素对实验性肝功能不全的作用.中国病理生理杂志，1986，2：147.
3 陈贤明，韩德五，许瑞玲，等.内毒素对实验性急性肝功能不全的作用.中国病理生理杂志，1989，5：164.
4 韩德五.内毒素与肝功能不全.中国病理生理杂志，1986，2：39.
5 韩德五.肝功能衰竭发病机制的研究进展.中国病理生理杂志，1993，9：770.
6 韩德五.肝功能衰竭发病机制的研究——肠源性内毒素血症假说.肝脏病杂志，1995，3：134.
7 Beutler B, Cerami A. Cachectin and tumor necrosis factor as two sides of the same coin. Nature, 1986, 320:584.
, http://www.100md.com
8 Harbrecht BG, Silvio MD, Demetris AJ, et al. Tumor necrosis factor-α regulates in vivo nitric oxide synthesis and induced liver injury during indotoxemia. Hepatology, 1994, 20:1055.
9 张惠珍，姚志强，周小兴，等.肿瘤坏死因子在实验性急性肝坏死中的作用.临床肝胆病杂志，1994，10：19.
收稿日期：1996年9月23日
修稿日期：1997年4月15日, 百拇医药
单位：山西医科大学病理生理教研室(太原 030001)
关键词：肿瘤坏死因子；肝脏病；内毒素类；中草药
中国病理生理杂志990116 摘 要 目的：研究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在肠源性内毒素血症中的作用及丹参防治肝损伤机制。方法：用硫代乙酰胺(TAA)诱发大鼠急性肝损伤，检测血浆内毒素、TNF-α及丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平变化，并与丹参治疗组进行比较。结果：TAA诱发急性肝损伤大鼠血浆内毒素及TNF-α含量升高，二者呈正相关；血浆ALT亦升高，与TNF-α亦呈正相关。丹参治疗组大鼠血浆TNF-α及ALT水平均低于肝损伤对照组。结论：TAA引起肠源性内毒素血症，内毒素促进TNF-α释放，TNF-α进一步介导肝损伤。丹参防治肝损伤作用机制之一可能是通过降低TNF-α水平而实现的。
, 百拇医药
Effect of tumor necrosis factor-α on gut-derived endotoxemia in rats
ZHENG Xiao-Bin, HAN De-Wu, MA Xue-Hui, XU Rui-Ling, ZHAO Yuan-Chang
Department of Pathophysiology, Shanxi Medical University, Taiyuan (030001)
Abstract AIM:To study the effects of tumor necrosis factor-αon gut-derived endotoxemia in rats and the preventive and therapeutive effects of Radix Salviac Miltiorrhizac (RSM). METHODS: Endotoxin, TNF-α and ALT (alanine aminotransferase) levels were determined in plasma of acute hepatic injury rats induced by TAA (thioacetamide), the results were compared with that obtained from RSM group. RESULTS:Plasma endotoxin and TNF-α levels were increased in rats of TAA group and there were a positive correlation between endotoxin and TNF-α contents (r=0.8326,P<0.05).Plasma ALT contents also increased in TAA group and correlated with TNF-α level(r=0.8237, P<0.05).RSM decreased plasma TNF-α and ALT contents at the same time. CONCLUSION:TNF-α might played an important role in endotoxin-mediated hepatic injury. RSM may displayed its preventive and therapeutic effects by way of TNF-α level down-regulation.
, 百拇医药
MeSH Tumor necrosis factor; Liver diseases; Endotoxins; Drugs, Chinese herbal
正常肠道产生的内毒素在肝脏经Kupffer细胞解毒。肝损伤时，kuffer细胞受损，解毒功能下降，而导致肠源性内毒素血症[1～6]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)为内毒素刺激巨噬细胞释放的细胞因子之一，参与引起发热、休克等病理过程。关于内毒素与TNF-α关系的研究报道多是采用外源性注射内毒素，对肠源性内毒素与TNF-α关系的报道则很少。本研究是采用肝毒物硫代乙酰胺( thioacetamide,TAA)诱发急性肝损伤，观察急性肝损伤时肠源性内毒素血症与TNF-α的关系，以探讨内毒素致肝损伤机制，同时观察了丹参的防治作用。
材料与方法
(一)实验动物：Wistar大鼠，体重180～220 g，雌雄兼用。
, 百拇医药
(二)实验方法：实验动物随机分为正常对照组、TAA组、TAA+丹参组。实验第1天开始TAA+丹参组动物皮下注射丹参注射液(丹参经水煎醇沉后，取上清液制成，每mL含生药0.5 g)，每天1次，每次1 mL/200 g体重。TAA组给等量生理盐水。实验第3天，TAA组与TAA+丹参组动物皮下注射TAA，600 mg/kg体重。TAA组在注射TAA后1、6、12、24、48 h处死动物，TAA+丹参组于注射TAA后24 h与正常对照组同时处死。在乙醚轻麻下，由腹主动脉无菌取肝素抗凝血，测定血浆内毒素、TNF-α及丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)水平。取动物肝脏，10%福尔马林固定，石腊包埋，切片，HE染色，进行组织学观察。
(三)检测方法：
1.内毒素：鲎试剂法，上海医学化验所提供药盒。
2.TNF-α：酶联免疫吸附法，军事医学科学院提供药盒。
, 百拇医药
3.ALT：赖氏法。
(四)统计分析：采用方差分析及直线相关分析。数据以
±s表示。结 果
(一)急性肝损伤动物血浆内毒素含量动态变化：见图1，实验动物在注射TAA后1 h，血浆内毒素水平明显高于正常对照组，12、24 h内毒素水平高于1、6 h，48 h达高峰，表明TAA引起肝损伤可导致肠源性内毒素血症，并随时间变化而升高。
Fig 1 Changes of plasma endotoxin levels in rats of normal and TAA group after TAA injection 1\, 6\, 12\,24\, 48h.(n=6,
±s) *P<0.01, vs normal, 百拇医药
图1 正常对照组与TAA组注射TAA后1、6、12、24、48 h血浆内毒素含量动态变化
(二)急性肝损伤动物血浆TNF-α浓度动态变化：见图2，动物注射TAA后1 h，血浆TNF-α明显高于正常对照组，48 h达高峰。给TAA后24 h TNF-α与血浆内毒素含量相关分析表明二者呈正相关(r=0.8326,P<0.05)。
Fig 2 Changes of plasma TNF-α levels in rats of normal and TAA group after TAA injection 1\, 6\, 12\,24\, 48h.(n=6,
±s), *P<0.01, vs normal, 百拇医药 图2 正常对照组与TAA组注射TAA后1、6、12、24、48 h血浆TNF-α含量动态变化
Fig 3 Changes of plasma ALT levels in rats of normal and TAA group after TAA injection 1\, 6\, 12\,24\, 48h.(n=6,
±s) *P<0.05,**P<0.01, vs normal图3 正常对照组与TAA组注射TAA后1、6、12、24、48 h血浆ALT动态变化
(三)急性肝损伤动物血浆ALT水平动态变化：见图3，动物注射TAA后24 h，ALT水平开始升高，48 h达高峰。注射TAA后24 h血浆ALT与TNF-α含量相关分析表明二者呈明显正相关(r=0.8237,P<0.05)。从3个附图可看出，动物注射TAA后，血浆内毒素及TNF-α先升高，24 h后ALT 升高，提示可能是TAA导致肠源性内毒素血症，以TNF-α介导进一步引起肝损伤。
, 百拇医药
(四)丹参的防治作用：从表1可看出，TAA+丹参组动物注射TAA 24 h后，血浆TNF-α及ALT含量明显低于TAA组，表明丹参防治肝损伤可能与其降低TNF-α浓度有关。表1 注射TAA后24 h血浆TNF-α及ALT含量比较
Tab 1 Comparison of plasma TNF-α, ALT levels at
24 hours after injection of TAA(
±s, n=6) GroupTNF-α(μg/L)
ALT(U)
Normal control
, 百拇医药 1.09±1.30
58.96±14.20
TAA
14.79±1.82
180.14±100.57
TAA+RSM
11.71±3.00*
94.59±47.02*
*P<0.05， vs TAA group； RSM:Radix Salviae Miltiorrhizae
(五)组织学观察：TAA组动物注射TAA后1、6 h，肝细胞轻度肿胀，12 h逐渐加重，24 h肝细胞明显水变性，并见点状坏死，汇管区有淋巴细胞及巨噬细胞浸润，48 h坏死加重。TAA+丹参组动物注射TAA后24 h，肝细胞坏死及炎症反应均较TAA组轻。组织学观察与ALT测定结果相一致。讨 论
, 百拇医药
韩德五曾提出“肠源性内毒素血症假说”，该假说认为：在肝损伤时，由于Kupffer细胞功能下降，不能有效地清除肠道来源的内毒素，致内毒素进入大循环，造成肠源性内毒素血症，从而引起肝功能不全甚至肝功能衰竭的一系列症状与体征[6]。本实验采用TAA诱发急性肝损伤，TAA为常用的肝毒物，也是弱致癌物，小剂量长期应用可致肝癌，大剂量可致急性肝损伤。实验动物接受TAA注射后，迅速产生肠源性内毒素血症，并随时间变化而加重，进一步支持了上述理论。
已知内毒素能刺激巨噬细胞产生TNF-α，TNF-α进一步介导内毒素的效应[7]。本实验结果表明，动物注射TAA后，血浆内毒素升高的同时，TNF-α亦升高，二者呈正相关。ALT正常存在于肝细胞内，当肝细胞变性、坏死时，细胞膜通透性升高，ALT入血，使血浆ALT水平升高，因此测定ALT水平可反映肝细胞损伤程度。本实验观察到，动物注射TAA后1 h血浆内毒素及TNF-α升高，而24 h后ALT明显升高，且与TNF-α含量呈正相关，因而可以推断，内毒素血症刺激巨噬细胞产生、释放TNF-α，后者参与引起肝细胞损伤，即内毒素引起肝细胞损伤可能是通过TNF-α进一步介导的。
, 百拇医药
值得一提的是，国内外曾有内毒素、TNF-α与肝损伤关系的研究报道，如Harbrecht等是从体外注射内毒素[8]，与内源性产生内毒素尚有区别；国内报道给大鼠D-氨基半乳糖后有TNF-α产生，但未检测内毒素，不能圆满解释TNF-α增多的起因[9]。本实验研究肠源性内毒素血症与TNF-α产生及肝损伤的关系更接近于临床病人情况。
丹参是常用的活血化瘀药物，我们曾多次实验证明丹参具有抗肝损伤作用。本实验显示丹参在降低血浆TNF-α含量的同时，降低了ALT水平，表明丹参防治肝损伤途径之一是通过降低TNF-α而实现的，这对进一步研究丹参作用机制及临床应用提供了一定的理论基础。
参考文献
1 韩德五主编.肝脏病理生理学.第一版.太原：山西高校联合出处社，1992.248～265.
, http://www.100md.com 2 邢桦云，韩德五，马学惠，等.内毒素对实验性肝功能不全的作用.中国病理生理杂志，1986，2：147.
3 陈贤明，韩德五，许瑞玲，等.内毒素对实验性急性肝功能不全的作用.中国病理生理杂志，1989，5：164.
4 韩德五.内毒素与肝功能不全.中国病理生理杂志，1986，2：39.
5 韩德五.肝功能衰竭发病机制的研究进展.中国病理生理杂志，1993，9：770.
6 韩德五.肝功能衰竭发病机制的研究——肠源性内毒素血症假说.肝脏病杂志，1995，3：134.
7 Beutler B, Cerami A. Cachectin and tumor necrosis factor as two sides of the same coin. Nature, 1986, 320:584.
, http://www.100md.com
8 Harbrecht BG, Silvio MD, Demetris AJ, et al. Tumor necrosis factor-α regulates in vivo nitric oxide synthesis and induced liver injury during indotoxemia. Hepatology, 1994, 20:1055.
9 张惠珍，姚志强，周小兴，等.肿瘤坏死因子在实验性急性肝坏死中的作用.临床肝胆病杂志，1994，10：19.
收稿日期：1996年9月23日
修稿日期：1997年4月15日, 百拇医药