不同剂量照射对大鼠伤口愈合影响规律的分子病理研究
作者：谷庆阳 王德文 崔彩林 高亚兵 崔雪梅 熊呈琦 夏国伟 宋良文
单位：100850 北京：北京放射医学研究所
关键词：
不同剂量照射对大鼠伤口愈合影响规律的分子病理研究
在辐射对伤口愈合影响的研究中，尚没有明确的剂量-效应关系可供我们参考[1]。本实验在大鼠放射复合伤口愈合模型的基础上，采用5～55Gy共6个剂量对动物进行局部照射，从宏观、光镜、电镜和分子水平对伤口愈合的病变过程进行较系统地观察，为阐明辐射对创伤愈合影响的特点、规律和机制提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及动物模型制备：雌性Wistar大白鼠，体重200±20克，随机分为7组，剂量分别为0，5，15，25，35，45，55Gy，照射组动物均为12只。经备皮并以30mg/kg体重戊巴比妥纳腹腔注射麻醉后，在每只大鼠背部切3个创面，创面与大鼠脊椎平行，长1.2cm，宽0.7cm，深达皮下组织全层，间隔1.0cm。以无菌纱布包扎伤口，动物置于单笼饲养。
, 百拇医药
1.2 照射方式及条件：于致伤后1～4分钟内采用60Coγ射线进行局部照射，照射野为创面及其周围0.5cm范围，吸收剂量率为0.234Gy/min。
1.3 观察指标：包括动物全身状况及伤口局部变化。将动物创面大小描印在透明薄膜上，然后用QTM970型图像分析仪测量其大小，并进行统计学处理。分别于伤后3，7，14，21天各活杀3只动物取材，将伤处皮肤置于4%多聚甲醛-PBS-Mg++液中固定，石蜡包埋，常规切片后行HE染色、免疫组化染色和原位杂交；另取材经戊二醛固定后制作超薄切片，以Philips CM200型透射电镜观察超微结构改变。
1.4 免疫组化染色方法：Ⅲ型胶原单克隆抗体由第四军医大学病理室提供，1∶50稀释，以羊抗鼠抗体(1∶200)和ABC试剂盒(1∶1∶100，Vector)检测，DAB显色。以PBS代替一抗作为阳性对照。
, 百拇医药 1.5 原位杂交：Ⅰ型胶原cDNA全长序列克隆于pUC19k ,c Xho Ⅰ单酶切，控针长度为867bp；Ⅲ型胶原cDNA全长序列克隆于pBR322中，以EcoR Ⅰ单酶切，探针长度1500bp。采用Boehringer Mannheim公司的“DIG DNA Labeling and Detection Kit”进行标记和检测[2]。以不加探针和杂交前以RNaseA消化切片30分钟作为阴性对照。
2 结果
2.1 动物一般状况及伤口局部宏观观察：在照射后喂养期间，35Gy以下照射组动物活动及进食水情况良好，全部活存，45，55Gy照射组在受照射7天后可见活动较少，消瘦且有喘息现象，其中55Gy照射组动物于照后第15天和16天全部死亡，死因为急性放射性肺炎并发呼吸衰竭。
伤后5天始见照射组动物25%创面轻微感染，经抗感染处理后好转。25Gy、35Gy照射组各2个；45Gy、55Gy照射组各4个创面出现溃烂，深及肌层(此创面未纳入研究)。
, 百拇医药
2.2 不同剂量照射组动物的平均创面面积变化如附图。
图1 不同剂量照射组动物的创面平均面积变化
从图1可见，随着照射剂量的加大，伤口愈合时间依次延长。
2.3 光镜观察：伤后3天，未照射组创面渗出非常明显，渗出物中有大量巨噬细胞和中性粒细胞；而照射组随着照射剂量的加大，创面渗出物越来越少，尤以白细胞渗出减少为著，并有灶状出血发生。
伤后7天：①未照射组创面出现较多量肉芽组织，其中成纤维细胞增殖旺盛，毛细血管数量较多，表皮细胞增殖旺盛渐覆盖创面(图2A)。②5Gy照射组肉芽组织层较对照组薄，其中新生血管数量减少尤为明显(图2B)。③15，25Gy照射组创面肉芽组织明显减少，其中出现大型、畸形的放射性成纤维细胞，可能是受到亚致死放射损伤的细胞[1]；肉芽组织中新生血管数量较5Gy组少，伤口底部组织中血管结构损害严重，出现血淤滞、血管闭塞。④35，45，55Gy照射组创面于伤后7天未形成肉芽组织灶，其表面覆盖少量坏死组织(图2C)；创面底部组织中除少量淋巴细胞浸润外，尚可见大型的放射性成纤维细胞；血管结构损坏严重，出血和血管闭塞现象多见；未见表皮细胞增生。
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伤后21天：①15，25Gy照射组创面已完全愈合，且已演变为较成熟的纤维组织。②35Gy照射组创面肉芽组织含量增多，但尚未完全愈合。近伤口表面成纤维细胞增殖较为活跃，新生血管数量亦较多，其余均转化为纤维细胞，可见到形态细小弯曲的畸形纤维细胞，称之为“放射性纤维细胞”。③45Gy照射组可见典型的肉芽组织由创面周边向中心生长的现象，成纤维细胞和新生血管仅在新生肉芽组织与坏死组织交界处较多。畸形的放射性纤维细胞多见。新生表皮细胞逐渐覆盖创面。
2.4 电镜观察：伤后7天，未照射组成纤维细胞呈旺盛增殖、分泌像。5～25Gy照射组肉芽组织中成纤维细胞变性较严重(粗面内质网扩张、脱颗粒，线粒体扩张或出现致密钙颗粒)，部分细胞核碎裂或染色质边集成块(图2D)，可见坏死细胞碎片。35～55Gy照射组创面底部组织中成纤维细胞变性、坏死现象加重，常见粗面内质网极度扩极而使细胞呈地图状，坏死细胞碎片多见。
伤后14～21天，细胞变性、坏死现象渐减轻。
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2.5 原位杂交及免疫组化染色观察：原位杂交及免疫组化染色观察结果如表2示。可见随着照射剂量的增大，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA转录及Ⅲ型胶原表达渐降低且时间拖后。 表1 伤后14天不同剂量照射组光镜观察结果
动物分组 (Gy)
创面愈合
情况
创部新生组
织含量
新生毛细
血管含量
畸形细胞
数量
表皮细胞
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覆盖情况
伤口底部组织中
血管损伤程度
组织中炎
细胞数量
未照射
已愈
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-
++++
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5
已愈
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25
未愈
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未愈
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未愈
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55
未愈
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+
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表2 不同剂量照射组原位杂交及免疫组化染色观察结果
动物分组 (Gy)
Ⅰ 型胶原mRNA
Ⅲ 型胶原mRNA
Ⅲ 型胶原
7天
, http://www.100md.com 14天
21天
7天
14天
21天
7天
14天
21天
未照射
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3 讨论
从以上结果可见，在5～55Gy范围内，随着照射剂量的加大，伤口愈合过程越来越难以启动，伤口愈合时间越来越长，最终形成难愈合的放射性皮肤溃疡。随着照射剂量的加大，其变化特点是：①早期伤口局部炎症反应逐步减弱，特别是巨噬细胞和中性粒细胞渗出减少，坏死组织增加；②肉芽组织灶的形成逐渐延迟，如35Gy和45Gy照射组在伤后14天才开始产生新生组织；③肉芽组织中毛细血管数量愈来愈少；④成纤维细胞损伤愈来愈严重，畸形细胞即所谓“放射性成纤维细胞”由无到有、逐渐增多；⑤早期肉芽组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成和分泌逐渐减少，愈合质量变差；⑥伤口底部组织中血管结构损害逐渐加重，导致局部血液循环障碍。
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分析其原因，我们认为有如下因素：①伤口局部炎症反应逐渐减弱，其原因可能是动物受照射后外周血中白细胞降低、伤口局部组织结构破坏及血液循环障碍等综合因素作用的结果。②随着辐射剂量的加大，多种细胞成分受到损伤，增殖和分泌功能出现障碍，导致肉芽组织生长迟缓。Rudolph等直接证实了射线对成纤维细胞增殖能力的损害作用[3，4]。③照射剂量越大，创面周围及底部组织中血管系统破坏越严重，不但造成受伤区域缺乏营养和氧，更重要的是血源成分不能正常渗出以调节创伤修复过程[5]。④大剂量照射后，受照射区域组织及细胞结构遭到破坏，微环境发生变化，影响组织修复细胞的迁移和增殖。⑤在剂量照射后，动物全身状况变差，影响创伤愈合。
参考文献
, 百拇医药 1 Tokarek R,Bernstein EF,Sullivan F,et al.Effect of therapeutic radiation on wound healing.Clin Dermatol,1994,12:57～70
2 苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994：49～150.
3 Rodolph R,Berg JV,Schneider JA,et al.Slowed growth of cultured fibroblasts from human radiation wounds.Plast Reconstr Surg,1988,10:669～675.
4 Gorodetsky,McBride WH,Withers HR,et al.Effect of fibroblast implants on wound healing of irradiated skin:assay of wound strength and quantitative immunohistology of collagen.Radiat Res,1991,125:181～186.
5 Aitasalo K.Irradiation\|induced hypoxia in bones and soft tissues:an experimental study.Plast Reconstr Surg,1986,77:256～262.
(收稿：1996-09-23 修回：1997-01-28), 百拇医药
单位：100850 北京：北京放射医学研究所
关键词：
不同剂量照射对大鼠伤口愈合影响规律的分子病理研究
在辐射对伤口愈合影响的研究中，尚没有明确的剂量-效应关系可供我们参考[1]。本实验在大鼠放射复合伤口愈合模型的基础上，采用5～55Gy共6个剂量对动物进行局部照射，从宏观、光镜、电镜和分子水平对伤口愈合的病变过程进行较系统地观察，为阐明辐射对创伤愈合影响的特点、规律和机制提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物分组及动物模型制备：雌性Wistar大白鼠，体重200±20克，随机分为7组，剂量分别为0，5，15，25，35，45，55Gy，照射组动物均为12只。经备皮并以30mg/kg体重戊巴比妥纳腹腔注射麻醉后，在每只大鼠背部切3个创面，创面与大鼠脊椎平行，长1.2cm，宽0.7cm，深达皮下组织全层，间隔1.0cm。以无菌纱布包扎伤口，动物置于单笼饲养。
, 百拇医药
1.2 照射方式及条件：于致伤后1～4分钟内采用60Coγ射线进行局部照射，照射野为创面及其周围0.5cm范围，吸收剂量率为0.234Gy/min。
1.3 观察指标：包括动物全身状况及伤口局部变化。将动物创面大小描印在透明薄膜上，然后用QTM970型图像分析仪测量其大小，并进行统计学处理。分别于伤后3，7，14，21天各活杀3只动物取材，将伤处皮肤置于4%多聚甲醛-PBS-Mg++液中固定，石蜡包埋，常规切片后行HE染色、免疫组化染色和原位杂交；另取材经戊二醛固定后制作超薄切片，以Philips CM200型透射电镜观察超微结构改变。
1.4 免疫组化染色方法：Ⅲ型胶原单克隆抗体由第四军医大学病理室提供，1∶50稀释，以羊抗鼠抗体(1∶200)和ABC试剂盒(1∶1∶100，Vector)检测，DAB显色。以PBS代替一抗作为阳性对照。
, 百拇医药 1.5 原位杂交：Ⅰ型胶原cDNA全长序列克隆于pUC19k ,c Xho Ⅰ单酶切，控针长度为867bp；Ⅲ型胶原cDNA全长序列克隆于pBR322中，以EcoR Ⅰ单酶切，探针长度1500bp。采用Boehringer Mannheim公司的“DIG DNA Labeling and Detection Kit”进行标记和检测[2]。以不加探针和杂交前以RNaseA消化切片30分钟作为阴性对照。
2 结果
2.1 动物一般状况及伤口局部宏观观察：在照射后喂养期间，35Gy以下照射组动物活动及进食水情况良好，全部活存，45，55Gy照射组在受照射7天后可见活动较少，消瘦且有喘息现象，其中55Gy照射组动物于照后第15天和16天全部死亡，死因为急性放射性肺炎并发呼吸衰竭。
伤后5天始见照射组动物25%创面轻微感染，经抗感染处理后好转。25Gy、35Gy照射组各2个；45Gy、55Gy照射组各4个创面出现溃烂，深及肌层(此创面未纳入研究)。
, 百拇医药
2.2 不同剂量照射组动物的平均创面面积变化如附图。
图1 不同剂量照射组动物的创面平均面积变化
从图1可见，随着照射剂量的加大，伤口愈合时间依次延长。
2.3 光镜观察：伤后3天，未照射组创面渗出非常明显，渗出物中有大量巨噬细胞和中性粒细胞；而照射组随着照射剂量的加大，创面渗出物越来越少，尤以白细胞渗出减少为著，并有灶状出血发生。
伤后7天：①未照射组创面出现较多量肉芽组织，其中成纤维细胞增殖旺盛，毛细血管数量较多，表皮细胞增殖旺盛渐覆盖创面(图2A)。②5Gy照射组肉芽组织层较对照组薄，其中新生血管数量减少尤为明显(图2B)。③15，25Gy照射组创面肉芽组织明显减少，其中出现大型、畸形的放射性成纤维细胞，可能是受到亚致死放射损伤的细胞[1]；肉芽组织中新生血管数量较5Gy组少，伤口底部组织中血管结构损害严重，出现血淤滞、血管闭塞。④35，45，55Gy照射组创面于伤后7天未形成肉芽组织灶，其表面覆盖少量坏死组织(图2C)；创面底部组织中除少量淋巴细胞浸润外，尚可见大型的放射性成纤维细胞；血管结构损坏严重，出血和血管闭塞现象多见；未见表皮细胞增生。
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伤后21天：①15，25Gy照射组创面已完全愈合，且已演变为较成熟的纤维组织。②35Gy照射组创面肉芽组织含量增多，但尚未完全愈合。近伤口表面成纤维细胞增殖较为活跃，新生血管数量亦较多，其余均转化为纤维细胞，可见到形态细小弯曲的畸形纤维细胞，称之为“放射性纤维细胞”。③45Gy照射组可见典型的肉芽组织由创面周边向中心生长的现象，成纤维细胞和新生血管仅在新生肉芽组织与坏死组织交界处较多。畸形的放射性纤维细胞多见。新生表皮细胞逐渐覆盖创面。
2.4 电镜观察：伤后7天，未照射组成纤维细胞呈旺盛增殖、分泌像。5～25Gy照射组肉芽组织中成纤维细胞变性较严重(粗面内质网扩张、脱颗粒，线粒体扩张或出现致密钙颗粒)，部分细胞核碎裂或染色质边集成块(图2D)，可见坏死细胞碎片。35～55Gy照射组创面底部组织中成纤维细胞变性、坏死现象加重，常见粗面内质网极度扩极而使细胞呈地图状，坏死细胞碎片多见。
伤后14～21天，细胞变性、坏死现象渐减轻。
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2.5 原位杂交及免疫组化染色观察：原位杂交及免疫组化染色观察结果如表2示。可见随着照射剂量的增大，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA转录及Ⅲ型胶原表达渐降低且时间拖后。 表1 伤后14天不同剂量照射组光镜观察结果
动物分组 (Gy)
创面愈合
情况
创部新生组
织含量
新生毛细
血管含量
畸形细胞
数量
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覆盖情况
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表2 不同剂量照射组原位杂交及免疫组化染色观察结果
动物分组 (Gy)
Ⅰ 型胶原mRNA
Ⅲ 型胶原mRNA
Ⅲ 型胶原
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从以上结果可见，在5～55Gy范围内，随着照射剂量的加大，伤口愈合过程越来越难以启动，伤口愈合时间越来越长，最终形成难愈合的放射性皮肤溃疡。随着照射剂量的加大，其变化特点是：①早期伤口局部炎症反应逐步减弱，特别是巨噬细胞和中性粒细胞渗出减少，坏死组织增加；②肉芽组织灶的形成逐渐延迟，如35Gy和45Gy照射组在伤后14天才开始产生新生组织；③肉芽组织中毛细血管数量愈来愈少；④成纤维细胞损伤愈来愈严重，畸形细胞即所谓“放射性成纤维细胞”由无到有、逐渐增多；⑤早期肉芽组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成和分泌逐渐减少，愈合质量变差；⑥伤口底部组织中血管结构损害逐渐加重，导致局部血液循环障碍。
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分析其原因，我们认为有如下因素：①伤口局部炎症反应逐渐减弱，其原因可能是动物受照射后外周血中白细胞降低、伤口局部组织结构破坏及血液循环障碍等综合因素作用的结果。②随着辐射剂量的加大，多种细胞成分受到损伤，增殖和分泌功能出现障碍，导致肉芽组织生长迟缓。Rudolph等直接证实了射线对成纤维细胞增殖能力的损害作用[3，4]。③照射剂量越大，创面周围及底部组织中血管系统破坏越严重，不但造成受伤区域缺乏营养和氧，更重要的是血源成分不能正常渗出以调节创伤修复过程[5]。④大剂量照射后，受照射区域组织及细胞结构遭到破坏，微环境发生变化，影响组织修复细胞的迁移和增殖。⑤在剂量照射后，动物全身状况变差，影响创伤愈合。
参考文献
, 百拇医药 1 Tokarek R,Bernstein EF,Sullivan F,et al.Effect of therapeutic radiation on wound healing.Clin Dermatol,1994,12:57～70
2 苏慧慈.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994：49～150.
3 Rodolph R,Berg JV,Schneider JA,et al.Slowed growth of cultured fibroblasts from human radiation wounds.Plast Reconstr Surg,1988,10:669～675.
4 Gorodetsky,McBride WH,Withers HR,et al.Effect of fibroblast implants on wound healing of irradiated skin:assay of wound strength and quantitative immunohistology of collagen.Radiat Res,1991,125:181～186.
5 Aitasalo K.Irradiation\|induced hypoxia in bones and soft tissues:an experimental study.Plast Reconstr Surg,1986,77:256～262.
(收稿：1996-09-23 修回：1997-01-28), 百拇医药