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编号:10282626
IL-2 重组毒素的克隆、表达及对IL-2R+淋巴细胞的特异性细胞毒效应
http://www.100md.com 《中国免疫学杂志》 2000年第3期
     作者:毕美霞 杨渝珍 舒平 韩玲

    单位:毕美霞(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室,北京100021); 杨渝珍(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室,北京100021); 舒平(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室,北京100021); 韩玲(北京协和医科大学肿瘤医院肿瘤研究所病因室,北京100021);杨渝珍(同济医科大学实验医学研究中心分子生物学研究室,武汉 430030)

    关键词:重组毒素;白细胞介素2;绿脓杆菌外毒素;免疫抑制

    中国免疫学杂志000301 摘 要:目的:为了探讨肿瘤细胞的靶向性杀伤途径。方法:采用PCR-Cloning技术和DNA重组技术,构建了2类IL-2-PE40’嵌合基因的表达载体,分别由IPTG和温度(42℃)诱导表达,并对表达产物进行了酶切片段大小、电泳迁移率、分子量、IL-2和PE40’组分抗原性及细胞学效应的检测。结果:发现重组毒素对表面表达IL-2受体的活化T淋巴细胞具有明显杀伤效应,并有抑制混合淋巴细胞反应的作用。结论:该IL-2-PE40’融合蛋白确实具有明显的特异性免疫抑制效应。
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    中国图书分类号:R392.11 Q784

    The cloning,expressing of IL-2-PE40’ chimeric gene and cytotoxic effect on the activated IL-2R+ lymphocytes

    BI Mei-Xia

    (Department of Ethology,Institute of Oncology,Peking Union Medical College & Chinese Academy Medical Science,Beijing 100021.)

    YANG Yu-Zhen

    (Department of Medical Molecular Biology ,Research Center of Experimental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030)
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    SHU Ping

    (Department of Medical Molecular Biology ,Research Center of Experimental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030)

    Abstract:b:To find a therapeutic pathway special to kill tumour cells.Methods:The PCR-cloning technique was used to construct three prokaryotic expressing vectors into which chimeric IL-2-PE40’ gene fragment was inserted and induced to express by IPTG or 42℃ respectively.The SDS-PAGE、ELISA、cytological and enzymological assay were also used to identify the different characteristic of the expressed product.Results:It was found that IL-2-PE40’ fusion protein was very toxic to the activated IL-2R+ T-lymphocytes and able to inhibit mixed lymphocytes reaction in vitro.Conclusion:The IL-2-PE40’ fusion constructed had obvious inhibition to body immune function.
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    Key words:Recombination toxin IL-2 Pseudomonas exotoxin Immune inhibition

    PE(Pseudomonas Exotoxin A)是绿脓杆菌分泌的毒素蛋白,其分子由3个结构域组成。利用DNA重组技术,用IL-2的cDNA片段取代PE基因的细胞识别功能区(domain la)后所构建成的嵌合基因[1],所表达的融合蛋白能特异性地作用于IL-2受体阳性细胞(IL-2R+),由受体介导的内吞途径进入细胞内,使多肽延长因子EF-2因ADP核糖基化失活,导致细胞死亡。IL-2重组毒素有望作为一种新型的特异性免疫抑制剂,用于抗移植排斥反应、自身免疫性疾病的治疗[2,3]。本课题研究了IL-2重组毒素的克隆、表达及表达产物的特异性细胞杀伤效应。

    1 材料与方法

, 百拇医药     1.1 材料

    1.1.1 质粒、菌株及细胞系 pUC19及pTLIL-2克隆载体为本室保存;表达载体pRSET(A)、(B)、(C) 为Invitrogen公司产品;表达载体pBV200和pBV201由中国预防医学科学院病毒所构建。HL60细胞、JM109、DH5α、BL21(DE3)均为本组自存;绿脓杆菌产外毒素标准株PA103由美籍华人张延龄教授惠赠。

    1.1.2 试剂 基因工程实验所用的各种试剂均购于华美生物工程公司,IL-2单克隆抗体由卫生部武汉生物制品所提供,PA103抗血清由军事医学科学院微生物及流行病研究所购得。

    1.1.3 仪器 PE480 DNA热循环仪、CO2培养箱及基因工程实验所需仪器设备。

    1.2 方法

    1.2.1 原核表达载体Y1、Y2、Y3的构建 我们分别设计了2对引物,序列如下:P1 5’-CCGctgcagAGTCATCGCCTGCACTTT-3',P2 5'-CCGgaattcTTACTTCAG-GTCCTCGC-3',5'端分别加入Pst I和EcoR I 的酶切位点,用于扩增和克隆PE基因的I b+II+III区的DNA片段;第2对引物的序列为:P3 5’-CTCgaattccatatgGCACCTACTTCAAGT-3',P4 5'-GGCActgcagTGTTGAGATCATGCTTTGAC-3', 5'端分别加入EcoR I+Nde I和Pst I的酶切位点,用于扩增和克隆IL-2的DNA片段,见图1。嵌合基因表达载体pBIP40'(简称Y1)的构建及鉴定见文献[4]。嵌合基因表达载体pBV220-IP40'、pBV221-IP40'(简称Y2、Y3)为先用EcoR I酶切Y1和载体pBV220或pBV221,去磷酸化处理后,进行连接及转化实验,用菌落PCR方法筛选阳性菌落,再经酶切鉴定,筛出含正向插入片段的质粒。
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    图1 Y1、Y2、Y3载体构建图

    Fig.1 The construction of vector Y1,Y2,Y3

    1.2.2 重组毒素的诱导表达及表达产物的鉴定 加入IPTG诱导Y1载体表达,Y2和Y3为温敏载体,升温至42℃诱导表达。于3、6 h和过夜3个时间点分别收集菌液,超声破菌,进行SDS-PAGE电泳分析,离心后收集上清和沉淀,进行ELISA检测[5]

    1.2.3 重组毒素IL-2-PE40'初纯品的制备 超声破菌后,离心收集包涵体,按文献[6]进行变性、复性,在最后得到的上清中加入复性液,对 0.01 mmol/L的PBS透析48 h,期间共换液6次。于透析前、中、后分别取样,加到培养的HL60细胞中, 共同孵育6、12、24、48 h,同时设PBS、盐酸胍、RPMI1640等作为对照,观察纯化过程中所使用的化学试剂对细胞有无直接毒性作用,以确定进行细胞学实验时应该采用的最大无毒浓度。
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    1.2.4 IL-2-PE40'初纯品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定 取健康人抗凝外周血,按常规制备转化的淋巴母细胞,悬浮后加入适当浓度的IL-2以维持活化淋巴细胞的生长,继续培养3 d,换液后按2×106 ml-1的密度,以100 μl/孔的量重新铺于96孔培养板中,分别加入不同稀释度的IL-2-PE40'初纯品孵育,于6、24、48 h各取上清用MTT法测定IL-2-PE40'对淋巴细胞的毒性作用,为维持活化淋巴细胞的正常生长,曾经使用过0、1、5、10 U/孔不同浓度的rIL-2,以确定对IL-2-PE40'杀伤活性测定干扰最小的rIL-2的维持浓度。

    1.2.5 IL-2-PE40'初纯品对混合淋巴细胞杀伤效应的测定 取2份健康人外周血,分离单个核细胞,按常规方法进行单向和双向混合淋巴细胞培养,分别加入IL-2-PE40'初制品原液(98 μg/ml)、1∶2稀释液(RPMI1640稀释)、同样处理的未转化菌(简称空白菌)的胞浆原液(87 μg/ml)及其1∶2稀释液各100 μl于混合细胞培养孔中,一式3份,同时设PBS与RPMI1640对照,培养24 h后用MTT法测定细胞的增殖率。
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    2 结果

    2.1 IL-2-PE40'融合蛋白表达产物的鉴定 诱导表达后转化菌的SDS-PAGE电泳显示在5.5 kD处有一新的融合蛋白条带(图2),空载菌中则无此条带。由于我们设计的毒素片段比文献报道的大些,故以PE40’表示,薄层扫描显示该蛋白的表达量为18%~20%,用ELISA方法鉴定表达产物的免疫原性,证明确有IL-2和PE组份,并多以包涵体的方式存在,详见文献[5]。

    图2 IL-2-PE40’嵌合基因表达产物的SDS-PAGE图谱

    Fig.2 The SDS-PAGE of expressing products of IL-2-PE40’ chimeric gene

    Note:Line 1(O/N)、2(6 h)、3(3 h):the expressing product of vector Y1 in E.coli;line 5(O/N)、6(6 h)、7(3 h):the expressing product of vector Y2/Y3 in E.coli;line 4:protein bands of standard molecular weight;line 8:cytosol protein of untransformed bacteria as a blank control.The arrow directs the band of fusion protein
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    2.2 IL-2-PE40'初纯品最大无毒量的确定 结果表明,透析48 h后的初纯品对细胞生长基本无影响,与细胞共孵育6、12、24、48 h后,细胞活度分别为90%、85%、80%、60%,与同时设立的RPMI1640对照组的细胞活度基本相同。未经透析或透析不彻底的初纯品中由于盐酸胍存在,孵育后48 h可致细胞全部死亡。由此可确定透析48 h后样品中盐酸胍已基本去除,其浓度即指定为它的最大无毒浓度。

    2.3 IL-2-PE40'初纯品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定 表1可见在不同IL-2浓度下(10、5、1、0 U/孔,96孔),以透析后的原液杀伤效应最大,48 h仍有一定的杀伤作用,而1∶2、1∶4稀释后,杀伤效应也依次降低。

    表1 IL-2-PE40'对活化淋巴细胞的杀伤效应(±s,OD570,n=6)
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    Tab.1 Killing effect of IL-2-PE40' on activated lymphocytes (±s,OD570,n=6) Groups

    Dilution degree

    Undilution(98 μg/ml)

    1∶0

    1∶2

    1∶4

    Incubation time

    (A)

    6 h
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    24 h

    48 h

    0.80±0.002

    0.82±0.020

    1.00±0.010

    0.62±0.0201)

    0.36±0.0201)

    0.23±0.0141)

    0.70±00.0182)

    0.65±0.0301)
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    0.50±0.0221)

    0.77±0.030

    0.72±0.0192)

    0.66±0.0152)

    (B)

    6 h

    24 h

    48 h

    0.80±0.005

    0.81±0.010

    1.00±0.030
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    0.68±0.0051)

    0.42±0.0211)

    0.38±0.0181)

    0.79±0.005

    0.65±0.0211)

    0.55±0.0151)

    0.82±0.010

    0.70±0.0202)

    0.60±0.0272)
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    (C)

    6 h

    24 h

    48 h

    0.80±0.002

    0.83±0.010

    0.88±0.001

    0.62±0.0181)

    0.46±0.0201)

    0.41±0.0051)

    0.78±0.008
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    0.61±0.0091)

    0.52±0.0141)

    0.80±0.005

    0.72±0.011

    0.70±0.0091)

    (D)

    6 h

    24 h

    48 h

    0.75±0.002

    0.67±0.022
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    0.65±0.010

    0.62±0.0181)

    0.47±0.0091)

    0.40±0.0081)

    0.67±0.0112)

    0.59±0.0301)

    0.51±0.0111)

    0.74±0.014

    0.66±0.015

    0.62±0.0142)
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    Note:The culture medium of (A)、(B)、(C)、(D) group contains 10、5、1、0 U/well rIL-2 respectively.Compared with control,1) P<0.001,2)P<0.01

    2.4 IL-2-PE40'对混合淋巴细胞培养的抑制作用 加PBS或RPMI1640的对照组,反映细胞活性的OD570值分别为0.51~0.58和0.78,而加入重组毒素初纯原液的实验组,单向和双向混合培养的淋巴细胞OD值分别降至0.28和0.47;加入1∶2稀释的重组毒素后,OD值则为0.45和0.53,略有升高,但仍低于对照组,结果说明重组毒素对混合淋巴细胞反应均有明显的抑制作用(P<0.01和P<0.001)。3 讨论

    我们利用PCR-Cloning技术,构建了2类分别由IPTG和温度诱导的原核表达载体pBIP40'和V220-IP40'/pBV221-IP40',并对其表达产物进行了酶切、电泳、抗原活性、生物学活性等方面的检测和鉴定。在对表达产物的初纯品进行细胞杀伤效应研究时,为排除各种杂质的干扰,我们设计了多种不同的实验,证明盐酸胍对细胞的毒性最大,必须充分透析样品至少48 h,以排除残留盐酸胍的毒性作用。
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    活化后的淋巴母细胞表面表达IL-2受体,细胞的增殖和生长均需依赖IL-2,表2的结果也说明当细胞对照中不加IL-2时(0 U/ml),6~48 h期间,细胞生长不良,加入rIL-2后,细胞才能维持生长,考虑到IL-2和IL-2-PE40'都能与IL-2R竞争结合,因此,加入的rIL-2的浓度不能过高,本实验中使用的IL-2-PE40'的浓度远远大于rIL-2的浓度,在竞争中完全占优势。

    混合淋巴细胞反应可以测定受体和供体之间HLA抗原相容程度和移植后排斥反应的强烈程度,IL-2-PE40'对单向和双向混合淋巴细胞反应均有抑制作用,综合以上结果,肯定了IL-2-PE40'的免疫抑制效果[7],但整体实验效果还有待深入研究。

    编辑:许四平

    基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.39370701)

, 百拇医药     作者简介:毕美霞, 女, 26岁,博士生;

    指导教师,杨渝珍,女,教授,研究方向为分子免疫和分子肿瘤

    作者单位:舒平(同济医科大学实验医学研究中心分子生物学研究室,武汉 430030)

    参考文献:

    [1]Haya L G,David F,Vijay C et al.Cytotoxic activity of an interleukin-2-pseudomonas exotoxin chimeric protein produced in Escherichia Coli.Proc Natl Acad Sci USA,1988;85:1922

    [2]John P C,Haya L G,Robert L et al. Chimeric cytotoxin IL-2-PE40' delays and mitigates adjuvant-induced arthritis in rats.Proc Natl Acad Sci USA,1989;86:287
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    [3]Kozak R W,Haya L G,Jonesl P K et al.IL-2-PE40 prevents the development of tumours in mice injected with IL-2 receptor expressing EL4 transfected tumour cells. J Immunol,1991;145:2766

    [4]杨渝珍,舒 平,祁学忠 et al.重组毒素IL-2-PE40'的克隆和初步表达.武汉大学学报(自然科学),1996;生物工程专刊:121

    [5]毕美霞,杨渝珍,韩 玲 et al.用ELISA鉴定原核细胞中IL-2-PE40'的表达产物. 同济医科大学学报,1998;27(3):238

    [6]卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社,1995:379-384

    [7]Robert L,Haya L G,Le H P et al.Selective immunosuppression of activated T cell with the chimeric toxin IL-2-PE40'inhibition of experimental autoimmune uneoretinitis.J Immunol,1989;143:3498

    收稿日期:1998-08-09

    修改日期:1999-11-10, 百拇医药