单胺类递质在光化学诱导树血栓性脑缺血中心区及半暗区形成中的作用
作者：孟强 李树清
单位：昆明医学院病理生理教研室(昆明 650031)
关键词：光化学；脑缺血；神经调节剂；神经元；坏死
单胺类递质在光化学诱导树血栓性脑缺血 中心区及半暗区形成中的作用 单胺类递质在光化学诱导树
血栓性脑缺血
中心区及半暗区形成中的作用*
摘 要 目的和方法：光化学诱导树鼠 句血栓性脑缺血，用荧光分光光度法检测实验后4、24及72 h中心区及半暗区单胺类递质的变化，并用密度梯度法测定以上各区脑水份含量，以探讨单胺类递质代谢紊乱在缺血性脑损伤中的作用。结果：光化学反应后中心区与半暗区的多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)含量分别在4、24及72 h降至最低点(与假手术组相比P均<0.01)，然而5-HT的代谢产物—5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)逐渐升高。中心区及半暗区脑水含量于实验后24 h均达峰值(P均<0.01)。结论：单胺类递质在光化学诱导树鼠 句血栓性脑缺血，尤其是半暗区形成中具重要作用；其病理生理改变，既是血栓性脑缺血的结果，又是继发性脑损伤、脑水肿以及迟发性神经元坏死(DND)的原因。
, http://www.100md.com
Effect of monoamine neurotransmitters on the formation of thrombotic ischemic core and penumbra induced by photochemistry in tree shrews
MENG Qiang, LI Shu-Qing
Department of Pathophysiology,Kunming Medical College, Kunming (650031)
Abstract AIM and METHODS：The sequent alterations of norepinephrine (NE), dopamine(DA), 5-hydroxytryptamine (5-HT) and its metabolite 5-hydroxyindole-3-acetic acid(5-HIAA) were assessed by fluorescence spectrophotometry and water contents were measured by gravimetric technique in ischemic core, penumbra and contralateral regions at 4, 24 and 72 h after photochemical reaction in order to elucidate the mechanism of cerebral ischemic injury. RESULTS：The contents of DA, NE and 5-HT in the above regions decreased to their lowest levels at 4, 24 and 72 h , respectively (P<0.01) and 5-HIAA increased gradually during ischemia (P<0.01). Simultaneously, the water contents of core, penumbra reached the highest levels at 24 h (P<0.01).CONCLUSION：The changes of monoamine neurotransmitter were not only the result of thrombotic cerebral ischemia, but also the reason of secondary cerebral damage, cerebral edema and delayed neuronal death.
, 百拇医药
MeSH Photochemistry; Cerebral ischemia; Neuroregulators; Neurons; Necrosis
缺血性脑血管病是临床常见、多发病，也是威胁人类健康和致残、致死的主要疾病之一。已知单胺类神经递质的代谢异常与缺血性脑损伤关系密切，为揭示脑血栓形成后不同类型的单胺递质在不同缺血状态下的代谢改变及分布规律，进而阐明其在继发性脑缺血及神经元迟发性坏死(delayed neuron death，DND)中的作用机制，本文采用光化学诱导树鼠 句局灶性脑血栓形成模型，模拟人类缺血性脑卒中发病过程，观察中心区、半暗区及对侧区单胺类递质的动态变化，以探讨其在缺血性脑卒中发生发展中的病理生理作用。
材料与方法
(一)实验动物：健康树鼠 句(n=60),雌雄不拘，体重(120±20) g。
, 百拇医药
(二)实验试剂及仪器：孟加拉红(瑞士Fluka公司产品)：以生理盐水溶解，浓度15 g.L-1避光保存。三苯基四唑氯化物(TTC)(瑞士Fluka公司产品)：配制成2%生理盐水溶液，避光保存。盐酸多巴胺(DA)，去甲肾上腺素(NE)，硫酸肌酐5-羟色胺(5-HT)，5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)均为Sigma公司产品。邻苯二甲醛(OPT)：瑞士Fluka公司产品。其余为国产分析纯级试剂。SQ-Ⅲ型脑血栓形成仪及密度梯度制备装备(本室研制)。RF-5000型荧光分光光度计(日本岛津产品)。LIBROR AEG-220型电子天平(日本岛津产品)。
(三)实验方法：1.局灶性脑缺血模型的建立：参考Li等[1]光化学诱导血栓形成方法并加以改进。动物麻醉，固定，消毒右顶部皮肤，矢状切开1 cm，剥离软组织，于切口处嵌一消毒铝片，其中心含一直径0.5 cm的窗孔，以便光束透照于颅骨表面。实验组：舌下静脉注射孟加拉红1.33 mL.kg-1体重。假手术组：注射等量生理盐水。均循环10 min，用SQ-Ⅲ型血栓形成仪照射暴露的颅骨表面10 min [(36±1)℃]。于术后4、24及72 h检测有关指标。2.缺血中心区、半暗区及对侧区的确定：(1)用光镜及TTC组织化学染色观察确定直径0.5 cm的光照区为中心区，其边缘0.3 cm的环状带为半暗区[2]。(2)中心区的左侧对应区为对侧区。并分别观察实验后4、24及72 h上述各区的组织病理学改变。3.各区单胺类递质及脑水含量测定：4、24及72 h断头取脑，分区测定各区皮层单胺类递质含量(ng/g wt)[3]及脑组织水含量(g水分/g湿×100%)[4]。
, 百拇医药
(四)统计处理：实验数据以
±s表示，用SPSS Win 5.0统计软件包行方差分析，方差齐性检验，成组t检验及配对t检验。
结 果
一、光化学反应后组织病理学改变：
光镜显示，光化学反应后4 h中心区血管内大量血细胞淤积，血管闭塞，神经元密度减少，残存神经元核固缩，呈三角形及不规则形，胞浆空化，提示细胞内明显水肿。组织间隙扩大，组织内水份聚积明显。半暗区神经元数目较正常区为少，部分细胞肿胀，胞核呈不规则形。缺血24 h组，中心区血管内病理变化更明显，神经元周围大片空化，水肿加重。缺血72 h中心区空化有所减轻，水肿减轻。
, http://www.100md.com 二、脑缺血后中心区及半暗区单胺类递质的动态变化：
实验后24 h中心区及半暗区NE、DA含量均明显下降(P<0.01)，但DA于4 h即达最低值。其中半暗区的NE，中心区的DA在3个时点居于最低水平(P<0.05)，(见图1，2)。
Fig 1 Changes of DA content in ischemic core and penumbra
*P<0.05, **P<0.01, vs sham and contralateral
图1 缺血中心区及半暗区DA含量的变化
, 百拇医药
Fig 2 Changes of NE content in ischemic core and penumbra
*P<0.05, **P<0.01, vs sham and contralateral
图2 缺血中心区及半暗区NE含量的变化
脑血栓形成后4 h半暗区5-HT含量即开始下降(P<0.01)，24 h中心区也开始下降(P<0.01)，72 h中心区、半暗区及对侧区均降至最低点(P<0.01)。各时点中心区较对侧区高，对侧区较半暗区高(P<0.01)(见图3)。伴随着各脑区5-HT的减少，其代谢产物5-HIAA呈升高趋势。
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Fig 3 Changes of 5-HT content in ischemic core and penumbra
*P<0.05, **P<0.01, vs sham and contralateral
图3 缺血中心区及半暗区5-HT含量的变化
三、缺血心中区及半暗区脑水含量的变化：
实验后4 h中心区和半暗区水含量高于假手术组[(78.55±0.51)%]分别为(87.16±0.90)%(P<0.01)和(82.41±0.78)%(P<0.01)，在24 h均达峰值，分别为(88.42±0.98)%及(83.85±0.80)%(与4 h组相比P均<0.05)。72 h后中心区、半暗区水含量仍具有显著差异。4，24及72 h 3个时点中心区与半暗区，半暗区与假手术组比较差异均具统计学意义。但半暗区脑水含量介于中心区与假手术组之间(P<0.01)。
, 百拇医药
讨 论
一、脑缺血后中心区、半暗区及对侧区单胺类递质的动态变化：
实验后4 h中心区、半暗区NE、DA及5-HT即开始下降，可能与合成减少和释放增加有关，前者系由于神经元缺血缺氧所致，后者可因神经元去极化，NE、DA及5-HT大量释放至细胞间隙[5，6]并向周围组织弥散，促使中心区的边缘带血管收缩而形成缺血半暗区[2]。其中由于5-HT的耗竭而致其代谢产物5-HIAA增多。缺血24 h出现的NE、DA及5-HT进一步减少，可能与早期大量释放的NE、DA通过影响脑血流，代谢，加强兴奋性氨基酸的神经毒作用[7]以及5-HT通过5-HT受体介导的血管收缩、血小板聚积及其神经毒性作用[8]产生的继发性脑损伤有关[5]。同时单胺类递质的进一步减少了也反映了神经元的损伤和功能抑制逐步加重。缺血72 h单胺类递质有所恢复，是否与残存神经元的机能代偿活动有关，尚待研究。
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对侧脑区NE、DA及5-HT降低可能与左右大脑半球神经元的联系及单胺能神经元胞体的逆行性反应有关。
DA于缺血4 h就降至最低点，而NE于24 h方才降至最低水平。可能是脑血栓形成后，机体处于应激状态，血液中以NE为主的儿茶酚胺增多，通过受损的血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)进入缺血脑组织所致。实验后4 h半暗区5-HT含量即开始下降，然而中心区于72 h方才降低，可能由于中心区血小板聚积、激活释放大量的血小板源性5-HT，使得该区5-HT早期下降不明显，而脑缺血过程中中心区5-HT值高于半暗也可能与此有关。缺血72 h当NE、DA都开始恢复时，皮层5-HT水平仍在下降，可能是NE、DA能神经元对缺血更敏感[5]，所以递质的变化较早，而5-HT降低缓慢，可能是DND发生的体液因素之一。
二、脑血栓形成后中心后、半暗区水含量的变化：
, 百拇医药 由于光化学反应早期BBB受损，即产生血管源性脑水肿。故缺血4 h中心区、半暗区水含量即达较高水平。随着缺血的进一步加重以及早期大量释放的NE、DA及5-HT产生的继发性脑损伤[9，10]及DND，造成血栓形成后24 h中心区、半暗区水含量达峰值，半暗区部分神经元由可逆性向不可逆性损伤的转变，使得中心区扩大，脑损伤亦因此而加重，可能正是临床所见的进展性脑卒中病理改变的机制所在。
* 国家自然科学基金资助(No 39560031)
云南省自然科学基金资助(No 95c072M)
参考文献
1 Li SQ, Han H, He J. Histidine ameliorated brain edema and cardiac dysfunction during local thrombotic cerebral ischemia in rats. Acta Pharmacologica Sinica, 1995, 16:156.
, http://www.100md.com
2 Marc F, Julio HG. Evolving stroke and the ischemic penumbra. Neurology, 1996, 47:884.
3 匡培根，周新富，徐 波.脑组织中单胺类神经介质的提取和荧光分光光度测定法.中国人民解放军军医进修学院学报，1982，3：181.
4 杨世方.闵宝珍，于占久.脑组织比重测定法的改进及实验性脑水肿的应用.中国病理生理杂志，1993，9：670.
5 Kondoh T, korosue K, Lee SH, et al. Evaluation of monoaminergic neurotransmitters in the rat striatum during varied global cerebral ischemia. Neurosurg, 1994, 35:278.
, 百拇医药
6 Obrenovitch TP, Sarna GS, Matsumoto I, et al. Extracellular striatal dopamine and its metabolites during transient cerebral ischemia. J Neurochem, 1990, 54:1526.
7 Baker AJ, Zornow MH, Scheller MS, et al. Changes in extracellular concentrations of glutamate, aspartate, glycine, dopamine, serotonine and dopamine metabolites after transient global ischemia in rabbit brain. J Neurochem, 1991, 57:1370.
8 Joseph R, Tsering C, Grunfeld S. Serotonin may have neurotoxic properties. Neurosci Lett, 1992, 136:15.
, 百拇医药
9 Buisson A, Calleberl J, Mathien E, et al. Striatal protection induced by lesioning the substantia nigra of rats subjected to focal ischemia. J Neurochem, 1992, 59:1153.
10 Wester P, Busto R, Prado R, et al. Ischemia-induced extracellular release of serotonin plays a role in CA1 neuronal cell death in rats. Stroke, 1992, 23:1595.
(1997年12月8日收稿，1998年8月28日修回), 百拇医药
单位：昆明医学院病理生理教研室(昆明 650031)
关键词：光化学；脑缺血；神经调节剂；神经元；坏死
单胺类递质在光化学诱导树血栓性脑缺血 中心区及半暗区形成中的作用 单胺类递质在光化学诱导树
血栓性脑缺血中心区及半暗区形成中的作用*
摘 要 目的和方法：光化学诱导树鼠 句血栓性脑缺血，用荧光分光光度法检测实验后4、24及72 h中心区及半暗区单胺类递质的变化，并用密度梯度法测定以上各区脑水份含量，以探讨单胺类递质代谢紊乱在缺血性脑损伤中的作用。结果：光化学反应后中心区与半暗区的多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)含量分别在4、24及72 h降至最低点(与假手术组相比P均<0.01)，然而5-HT的代谢产物—5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)逐渐升高。中心区及半暗区脑水含量于实验后24 h均达峰值(P均<0.01)。结论：单胺类递质在光化学诱导树鼠 句血栓性脑缺血，尤其是半暗区形成中具重要作用；其病理生理改变，既是血栓性脑缺血的结果，又是继发性脑损伤、脑水肿以及迟发性神经元坏死(DND)的原因。
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Effect of monoamine neurotransmitters on the formation of thrombotic ischemic core and penumbra induced by photochemistry in tree shrews
MENG Qiang, LI Shu-Qing
Department of Pathophysiology,Kunming Medical College, Kunming (650031)
Abstract AIM and METHODS：The sequent alterations of norepinephrine (NE), dopamine(DA), 5-hydroxytryptamine (5-HT) and its metabolite 5-hydroxyindole-3-acetic acid(5-HIAA) were assessed by fluorescence spectrophotometry and water contents were measured by gravimetric technique in ischemic core, penumbra and contralateral regions at 4, 24 and 72 h after photochemical reaction in order to elucidate the mechanism of cerebral ischemic injury. RESULTS：The contents of DA, NE and 5-HT in the above regions decreased to their lowest levels at 4, 24 and 72 h , respectively (P<0.01) and 5-HIAA increased gradually during ischemia (P<0.01). Simultaneously, the water contents of core, penumbra reached the highest levels at 24 h (P<0.01).CONCLUSION：The changes of monoamine neurotransmitter were not only the result of thrombotic cerebral ischemia, but also the reason of secondary cerebral damage, cerebral edema and delayed neuronal death.
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MeSH Photochemistry; Cerebral ischemia; Neuroregulators; Neurons; Necrosis
缺血性脑血管病是临床常见、多发病，也是威胁人类健康和致残、致死的主要疾病之一。已知单胺类神经递质的代谢异常与缺血性脑损伤关系密切，为揭示脑血栓形成后不同类型的单胺递质在不同缺血状态下的代谢改变及分布规律，进而阐明其在继发性脑缺血及神经元迟发性坏死(delayed neuron death，DND)中的作用机制，本文采用光化学诱导树鼠 句局灶性脑血栓形成模型，模拟人类缺血性脑卒中发病过程，观察中心区、半暗区及对侧区单胺类递质的动态变化，以探讨其在缺血性脑卒中发生发展中的病理生理作用。
材料与方法
(一)实验动物：健康树鼠 句(n=60),雌雄不拘，体重(120±20) g。
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(二)实验试剂及仪器：孟加拉红(瑞士Fluka公司产品)：以生理盐水溶解，浓度15 g.L-1避光保存。三苯基四唑氯化物(TTC)(瑞士Fluka公司产品)：配制成2%生理盐水溶液，避光保存。盐酸多巴胺(DA)，去甲肾上腺素(NE)，硫酸肌酐5-羟色胺(5-HT)，5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)均为Sigma公司产品。邻苯二甲醛(OPT)：瑞士Fluka公司产品。其余为国产分析纯级试剂。SQ-Ⅲ型脑血栓形成仪及密度梯度制备装备(本室研制)。RF-5000型荧光分光光度计(日本岛津产品)。LIBROR AEG-220型电子天平(日本岛津产品)。
(三)实验方法：1.局灶性脑缺血模型的建立：参考Li等[1]光化学诱导血栓形成方法并加以改进。动物麻醉，固定，消毒右顶部皮肤，矢状切开1 cm，剥离软组织，于切口处嵌一消毒铝片，其中心含一直径0.5 cm的窗孔，以便光束透照于颅骨表面。实验组：舌下静脉注射孟加拉红1.33 mL.kg-1体重。假手术组：注射等量生理盐水。均循环10 min，用SQ-Ⅲ型血栓形成仪照射暴露的颅骨表面10 min [(36±1)℃]。于术后4、24及72 h检测有关指标。2.缺血中心区、半暗区及对侧区的确定：(1)用光镜及TTC组织化学染色观察确定直径0.5 cm的光照区为中心区，其边缘0.3 cm的环状带为半暗区[2]。(2)中心区的左侧对应区为对侧区。并分别观察实验后4、24及72 h上述各区的组织病理学改变。3.各区单胺类递质及脑水含量测定：4、24及72 h断头取脑，分区测定各区皮层单胺类递质含量(ng/g wt)[3]及脑组织水含量(g水分/g湿×100%)[4]。
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(四)统计处理：实验数据以
±s表示，用SPSS Win 5.0统计软件包行方差分析，方差齐性检验，成组t检验及配对t检验。结 果
一、光化学反应后组织病理学改变：
光镜显示，光化学反应后4 h中心区血管内大量血细胞淤积，血管闭塞，神经元密度减少，残存神经元核固缩，呈三角形及不规则形，胞浆空化，提示细胞内明显水肿。组织间隙扩大，组织内水份聚积明显。半暗区神经元数目较正常区为少，部分细胞肿胀，胞核呈不规则形。缺血24 h组，中心区血管内病理变化更明显，神经元周围大片空化，水肿加重。缺血72 h中心区空化有所减轻，水肿减轻。
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实验后24 h中心区及半暗区NE、DA含量均明显下降(P<0.01)，但DA于4 h即达最低值。其中半暗区的NE，中心区的DA在3个时点居于最低水平(P<0.05)，(见图1，2)。
Fig 1 Changes of DA content in ischemic core and penumbra
*P<0.05, **P<0.01, vs sham and contralateral
图1 缺血中心区及半暗区DA含量的变化
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Fig 2 Changes of NE content in ischemic core and penumbra
*P<0.05, **P<0.01, vs sham and contralateral
图2 缺血中心区及半暗区NE含量的变化
脑血栓形成后4 h半暗区5-HT含量即开始下降(P<0.01)，24 h中心区也开始下降(P<0.01)，72 h中心区、半暗区及对侧区均降至最低点(P<0.01)。各时点中心区较对侧区高，对侧区较半暗区高(P<0.01)(见图3)。伴随着各脑区5-HT的减少，其代谢产物5-HIAA呈升高趋势。
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Fig 3 Changes of 5-HT content in ischemic core and penumbra
*P<0.05, **P<0.01, vs sham and contralateral
图3 缺血中心区及半暗区5-HT含量的变化
三、缺血心中区及半暗区脑水含量的变化：
实验后4 h中心区和半暗区水含量高于假手术组[(78.55±0.51)%]分别为(87.16±0.90)%(P<0.01)和(82.41±0.78)%(P<0.01)，在24 h均达峰值，分别为(88.42±0.98)%及(83.85±0.80)%(与4 h组相比P均<0.05)。72 h后中心区、半暗区水含量仍具有显著差异。4，24及72 h 3个时点中心区与半暗区，半暗区与假手术组比较差异均具统计学意义。但半暗区脑水含量介于中心区与假手术组之间(P<0.01)。
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一、脑缺血后中心区、半暗区及对侧区单胺类递质的动态变化：
实验后4 h中心区、半暗区NE、DA及5-HT即开始下降，可能与合成减少和释放增加有关，前者系由于神经元缺血缺氧所致，后者可因神经元去极化，NE、DA及5-HT大量释放至细胞间隙[5，6]并向周围组织弥散，促使中心区的边缘带血管收缩而形成缺血半暗区[2]。其中由于5-HT的耗竭而致其代谢产物5-HIAA增多。缺血24 h出现的NE、DA及5-HT进一步减少，可能与早期大量释放的NE、DA通过影响脑血流，代谢，加强兴奋性氨基酸的神经毒作用[7]以及5-HT通过5-HT受体介导的血管收缩、血小板聚积及其神经毒性作用[8]产生的继发性脑损伤有关[5]。同时单胺类递质的进一步减少了也反映了神经元的损伤和功能抑制逐步加重。缺血72 h单胺类递质有所恢复，是否与残存神经元的机能代偿活动有关，尚待研究。
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对侧脑区NE、DA及5-HT降低可能与左右大脑半球神经元的联系及单胺能神经元胞体的逆行性反应有关。
DA于缺血4 h就降至最低点，而NE于24 h方才降至最低水平。可能是脑血栓形成后，机体处于应激状态，血液中以NE为主的儿茶酚胺增多，通过受损的血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)进入缺血脑组织所致。实验后4 h半暗区5-HT含量即开始下降，然而中心区于72 h方才降低，可能由于中心区血小板聚积、激活释放大量的血小板源性5-HT，使得该区5-HT早期下降不明显，而脑缺血过程中中心区5-HT值高于半暗也可能与此有关。缺血72 h当NE、DA都开始恢复时，皮层5-HT水平仍在下降，可能是NE、DA能神经元对缺血更敏感[5]，所以递质的变化较早，而5-HT降低缓慢，可能是DND发生的体液因素之一。
二、脑血栓形成后中心后、半暗区水含量的变化：
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* 国家自然科学基金资助(No 39560031)
云南省自然科学基金资助(No 95c072M)
参考文献
1 Li SQ, Han H, He J. Histidine ameliorated brain edema and cardiac dysfunction during local thrombotic cerebral ischemia in rats. Acta Pharmacologica Sinica, 1995, 16:156.
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2 Marc F, Julio HG. Evolving stroke and the ischemic penumbra. Neurology, 1996, 47:884.
3 匡培根，周新富，徐 波.脑组织中单胺类神经介质的提取和荧光分光光度测定法.中国人民解放军军医进修学院学报，1982，3：181.
4 杨世方.闵宝珍，于占久.脑组织比重测定法的改进及实验性脑水肿的应用.中国病理生理杂志，1993，9：670.
5 Kondoh T, korosue K, Lee SH, et al. Evaluation of monoaminergic neurotransmitters in the rat striatum during varied global cerebral ischemia. Neurosurg, 1994, 35:278.
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6 Obrenovitch TP, Sarna GS, Matsumoto I, et al. Extracellular striatal dopamine and its metabolites during transient cerebral ischemia. J Neurochem, 1990, 54:1526.
7 Baker AJ, Zornow MH, Scheller MS, et al. Changes in extracellular concentrations of glutamate, aspartate, glycine, dopamine, serotonine and dopamine metabolites after transient global ischemia in rabbit brain. J Neurochem, 1991, 57:1370.
8 Joseph R, Tsering C, Grunfeld S. Serotonin may have neurotoxic properties. Neurosci Lett, 1992, 136:15.
, 百拇医药
9 Buisson A, Calleberl J, Mathien E, et al. Striatal protection induced by lesioning the substantia nigra of rats subjected to focal ischemia. J Neurochem, 1992, 59:1153.
10 Wester P, Busto R, Prado R, et al. Ischemia-induced extracellular release of serotonin plays a role in CA1 neuronal cell death in rats. Stroke, 1992, 23:1595.
(1997年12月8日收稿，1998年8月28日修回), 百拇医药