标记基因在造血干/祖细胞基因转导中的研究
作者：赵志钢
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所血液内科) 重庆，400042
关键词：造血干细胞；逆转录病毒载体；标记基因
第三军医大学学报990812 赵志钢 综述 张书模 审校
中图法分类号 R394.2
Marker genes in gene transduction of primary hematopoie tic cells
造血干细胞的研究和应用，为一些血液系统疾病，恶性肿瘤和遗传病的治疗带来了希望 。造血干细胞能自我更新，能多向分化，是永不枯竭的造血源泉，是基因转移最理想的靶细 胞，然而，显微镜无法分辨造血干细胞，而只能借助单克隆抗体等免疫学方法。逆转录病毒 载体是基因治疗的经典工具，但在造血干细胞的研究中，如何达到更理想的境界尚需全面和 深入的长期探索。小动物实验非常成功，而大动物实验和人体试验却不尽如人意。造血干细 胞作为基因治疗的靶细胞 ，固然有其理想的一面，但它固有的特性，又决定了其基因转导 的效率很低，它阻碍了造血干细胞基础和临床的深入研究。影响转导效率的因素是多方面的 ，人们正致力于各个关键环节的探索，如：多种转导方式的尝试，体外培养体系的完善，造 血生长因子调控和细胞周期及细胞表面受体水平调节的探索等。本文着重讨论，在逆转录病 毒载体介导的基因转移造血干细胞过程中，标记基因的研究策略。文中论述的某些方法，目前可能并未有造血干细胞的实例报道，但对于今后的研究无疑是有益的启示。
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1 标记基因的产生背景和双基因载体的表达策略
逆转录病毒载体转染造血干细胞的效率是由两者，即转染工具和靶细胞的特性决定的。首 先，逆转录病毒是一类单链RNA病毒，其特点是：只感染分裂期细胞，在宿主基因组内可随 机整合；病毒载体携带的外源基因表达持久；逆转录病毒的受体在人造血干细胞表面表达水 平很低。其次，研究表明：CD34+细胞中少量造血干细胞，且99.5%的干细胞处于G0期， 因此逆转录病毒载体转导人造血干细胞的效率是极低的。从多个环节力求提高基因转导效率 的同时，将已导入基因的细胞富集起来，使细胞群落中表达目的基因细胞的比例增加，在基 因治疗中将会有广阔的应用前景。标记基因，正是在这样的构想中建立起来的。
其基本思想是构建同时携带目的基因和标记基因的载体。标记基因真正发挥作用的前提是实 现双基因的共同表达。共表达策略主要有三：①应用两个独立的启动子；②用目的基因和 标记基因产物构建一个嵌合的双功能蛋白质；③应用内部核糖体进入位点(IRES)序列。 在实践中，研究者们发现：应用双启动子存在启动子抑制现象，不能保证两个基因同时表达 ；嵌合蛋白的效率很高，但抗体工程的工作繁琐而复杂；目前最成功的手段是应用内部核糖 体进入位点(IRES)序列。转录时，在上游启动子的控制下，两个基因及IRES序列同时转录 成一条单链mRNA。但是，两个基因的翻译是独立的。目的基因多为帽依赖型，而标记基因则 由IRES控制，其可行性和高效性在双基因逆转录病毒载体中的应用已获验证。IRES的应用， 使单个载体的参与避免了启动子抑制现象，可同时保证多种蛋白质的合成。
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标记基因的研究迄今为止经历了两个阶段。初期是以药物抗性基因的研究为主，第二阶段， 也是目前的研究热点，则以表面标记基因作为筛选手段。两者之间没有绝对显著的优劣之分 ，而且，它们的发展趋势也是共同的：安全，准确，简单，快速。
2 标记基因的初期研究：药物抗性基因的应用
人们发现：某些基因导入细胞后的表达达到一定水平，可使细胞获得对特异性物质的抗性。 在药物筛选的压力下，它们仍能存活。如果使此类基因与目的基因在同一细胞同时表达，可 将表达目的基因的细胞筛选出来。这就是标记基因研究初期的筛选思想。如：neo基因，DHF R基因，MDR1基因等药物抗性基因，它们的应用在一段时间内收效显著，然而随着实践经验 的积累，也逐渐暴露出来一些缺点：筛选用的药物具有的非特异性细胞毒作用，可能损伤正 常组织细胞；持续的药物筛选容易引起基因重排，影响目的基因的表达[1]；药物 筛选周期长，并且不能定量目的基因的表达水平等。那么，药物抗性基因的前景怎样，它能 持续发展吗?答案是肯定的。首先，基因不同，其产物作用的底物也不同。底物是体内和体 外筛选时选择合适基因的基本原则。如neo基因，作为新霉素的抗性基因，只适用于体外组 织培养液中的筛选；而P蛋白，二氢叶酸还原酶及谷胱甘肽-S-转移酶，基于底物药理学和 药代动力学的特点，可用于体内筛选[2]。其次，不同的药物抗性基因，其毒副作 用程度有较大差异。其中，neo基因的毒副作用更为突出。而更为重要的是，耐受多种化疗 药物的耐药基因产物，同时具有筛选效应和对靶细胞的耐药保护效应，尤其是在造血干细 胞的导入，临床上使肿瘤患者和骨髓移植病人能耐受大剂量化疗，从而提高治疗质量。
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二氢叶酸还原酶(DHFR)，在大部分哺乳类动物细胞中活力低。若将外源性DHFR基因导入哺 乳类动物细胞，阳性克隆在无胸腺嘧啶核苷，无核苷氨酸和嘌呤碱基的培养液中生存，而DH FR缺乏的细胞由于氨基酸和核苷酸代谢障碍，蛋白质和核酸的生物合成受阻，不能存活。此 选择系统的一个突出的特点是：用抗叶酸药物氨甲喋呤(MTX)筛选，DHFR和目的基因的表 达产生放大效应。由于哺乳类动物细胞中存在DHFR酶活性，选择突变型DHFR的cDNA更为合理 。人二氢叶酸还原酶(DHFR)突变型cDNA在小鼠体内和体外的实验显示了耐药基因长期、稳 定的表达，临床研究正在进行中。
多药耐药基因(MDR1，multidrug resistance gene)的研究，是漫长而艰辛的。MDR1基因 编码的胞膜上分子量为本170×103u的P蛋白，是ATP依赖思想的外向泵，作用于多种结构 上并不 相关的细胞毒性药物。P蛋白可在正常组织细胞和肿瘤细胞表面表达，但我们更为关注的是 它们在造血系统的分布。它的分布是有规律可循的，在骨髓和外周血，在髓系和淋系以及在 同一细胞系的不同分化阶段又各有特点。它在造血系统的分布有一定生理学意义。MDR1基因 赋予靶细胞足够的药物耐受性的同时，也使它成为药物筛选的主要角色。小鼠的体内和体外 实验证明，导入MDR1基因的靶细胞对特异的毒性药物有强大的耐受性；MDR1基因的转导是干 细胞水平的[3]；P蛋白毒副作用小[4]，转基因小鼠的实验证明骨髓功能 无任何异常；同其 他基因相比，P蛋白有更广谱的作用底物，MDR1则使靶细胞获得不同程度的耐药性[1] 。但是 ，在MDR1基因转导的细胞中可能产生截短的mRNA，导致P蛋白的不完整表达，靶细胞的药物 耐受性降低[3]；此外，DNA重排时有发生，影响基因的稳定表达[1]。
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除药物筛选基因的应用之外，β-半乳糖苷酶基因(lac Z)也曾用于筛选导入基因的细胞， 但由于哺乳动物内源性β的存在以及体内高水平表达外源性β-半乳糖苷酶的难度，限制了 它的应用。
3 标记基因研究的第二阶段：细胞表面标志的应用
1988年，Strair RK[5]第一次提出应用细胞表面抗原筛选导入基因的细胞。他首先 应用转铁 蛋白受体基因作为标记基因，与Tn5 neo基因克隆于同一逆转录病毒载体，细胞表面人转铁 蛋白受体的表达水平，应用与荧光素结合的鼠抗转铁蛋白受体的单克隆抗体来定量。结果是 ，转染的包装细胞系产生的多个克隆，其转铁蛋白受体的表达水平不同。随后有研究了靶细 胞NIH3T3和BRK(Baby rat kidney)细胞的转染效率，并通过G418的药物筛选来验证细胞表 面标志筛选的可行性。研究表明：细胞表面标志的表达水平与包装细胞的产病毒能力有显著 的量的联系；而且，在没有药物选择压力下，细胞稳定地表达外源性基因和生成病毒颗粒可 持续6个月。而后，他们有应用淋巴细胞抗原Leu-1作为标志，所得结论与前者相吻合。最 后，他总结了这种筛选方法的优势：通过细胞表面的免疫荧光反应可快速检测产生大量病毒 颗粒的包装细胞；快速、定量筛选阳性细胞，并根据基因表达的水平不同将细胞分亚群；其 筛选的周期短，一些体外培养困难，生长受限的原始细胞中导入的外源基因也能顺利表达； 而且，如果选择的表面抗原带动物体内不具免疫原性，它在体细胞基因治疗的邻域将有广阔 的应用前景；理论上而言，免疫荧光反应的应用消除了选择压力，避免了因基因重排和其他 遗传变化引起的克隆选择和克隆放大效应。
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如果说表面标志基因的应用是标记基因的一个崭新阶段的话，那么，MDR1基因则跨越 了标记基因的两个阶段。因为，P蛋白也曾作为细胞表面的筛选标志[1]，同随后研 究的白介素-2受体、低亲和力神经生长因子受体一样，都因为分子量大，病毒滴度低，使 目的基因表达受限，因而，并非理想的选择。
那么，作为理想的表面标志基因，它的选择原则怎样呢？首先，靶细胞本身并不表达 相同的基因产物；其次，标志基因要足够小，否则会降低病毒的滴度，影响目的基因的表达 ；表达水平要低，以利于保持较弱的本底；而且，表面标志无免疫原性；有已知的特异性单 克隆抗体，检测方便、快速。
鼠的热稳定抗原(HSA,heat stable antigen)，与人CD24分子同源，为聚糖磷脂酰肌醇(GP I)连接的仅含30个氨基酸的细胞表面糖蛋白。成熟的CD24分子与HSA的氨基酸序列的同源性 较低，仅为57%，但信号肽的同源性较大。他们在多种造血细胞表面正常表达，各自的单克 隆抗体也无交叉反应活性。实际上，含有CD24抗原基因的双基因逆转录病毒载体在此前已成 功地分离了导入基因的原始造血细胞，包括有长期造血重建能力的细胞群落。Jeffrey A.Me din等[6]应用的双基因逆转录病毒载体克隆可葡糖脑苷脂酶(GC)基因和HSA基因 ，在转导 人造血干/祖细胞后根据细胞表面表达的HSA进行筛选，阳性克隆全部含有GC的cDNA，显示了 此选择系统的效率。但是，HSA作为理想的表面标志，有待时间的考验。我们不应忽视HSA在 人体可能激发的免疫反应，因为它分离自造血系统，表达于早期造血发育细胞和一些有核细 胞表面。它究竟在免疫反应中扮演怎样的角色呢？是作为抗原提呈细胞的共刺激分子，是细 胞间粘附的调节因子，还是T、B细胞发育的相关抗原[7]？目前仍不十分清楚。同 样，HSA在 体内造血系细胞的过度表达是否会产生副作用呢？在转基因鼠的动物模型中，HSA的大量表 达并不减少胸腺细胞的总数目。而且，体外实验表明：HSA在人造血细胞的表达也并不改变 其数目和类型[8]。可喜的是，由于可诱导和可调节的启动子的应用，将使HSA的可 控性表达成为现实。
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绿色荧光蛋白的应用为表面标记基因的深入及广泛开辟了新的思路，随着它在多组织、多器 官的表达研究，已经逐渐形成了一套较为完整、成熟的检测体系。由238个氨基酸组成的绿 色荧光蛋白，其基因于1992年首先从水母Aequorea victoria 克隆。多肽内部包括一个天然 形成的染色团，后者包括的咪唑环由65位丝氨酸，66位酪氨酸和67位甘氨酸残基自动环化形 成。绿色荧光蛋白的突变体较野生型自发荧光更强，因而检测更为灵敏。
Ana Lim 利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因研究了逆转录病毒载体转移多种细胞系的情 况，如：K562，HeLa，J774A.1(小鼠巨噬细胞系)，TF-1(人骨髓CD34+髓系多能干祖细 胞系)。其构建的逆转录病毒载体中并不包含常规的neo基因。因为绿色荧光蛋白的存在， 借助流式细胞仪和自动克隆系统，免却了G418较长周期的筛选，使病毒的包装更为简单和迅 速。作者的研究发现：PA317细胞表达的绿色荧光强度与其分泌上清的滴度水平并非具有正 相关性，即：中度荧光的PA317克隆的上清滴度最高，并可稳定保持数月；此外，绿色荧光 蛋白的高表达细胞能被FACS和荧光显微镜发现，FACS和PCR的结果基本一致。转基因小鼠的 实验证实无明显的毒性；表达绿色荧光蛋白的CD34+细胞的集落形成能力与正常无异。CFU -E，CFU-MIX，CFU-GM均产生绿色荧光。
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Frey BM 等在腺病毒载体转染体外扩增的人早期造血细胞的实验中研究了绿色荧光蛋白。 通过分析导入GFP基因的CD34+细胞的集落形成和增殖能力，造血发育正常；当感染复数( MOI，multiplicity of infection)为1到100，CD34+细胞的集落形成几无影响，但当超 过100时，CFU-G，CFU-GM的集落形成受到明显抑制。经过3周的一系列稀释扩增(DELTA ASSAY)，尽管MOI为1到1000，CD34+细胞在细胞因子的作用下其增殖潜能如常。同时，GF P+群落在MOI为500～1000时增加10～15倍，说明腺病毒载体转移标记基因的可行性和无损 伤性。Derek A.Persons等构建可双基因的逆转录病毒载体，以绿色荧光蛋白作为体外筛选 标志，使导入目的基因，人二氢叶酸还原酶基因的小鼠造血细胞在体外富集。在基因转移完 成后的24 h，40%～70%的骨髓细胞产生强荧光；GFP转导的骨髓形成的粒系和髓系造血集落 在荧光 显微镜下极易捕捉；借助FACS筛选的绿色荧光蛋白高表达细胞其药物抗性很强；用导入GFP 的骨髓移植小鼠，动物的脾造血集落和外周血细胞亦有强荧光。
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在基因治疗中，靶细胞的筛选时机是根据需要而变化的。例如，用逆转录病毒载体介导 脑肿 瘤的治疗，植入肿瘤病灶内的为稳定转导的包装细胞；而来源于骨髓的正常细胞或肿瘤细胞 ，则只需短暂的逆转录病毒转导即迅速植回患者体内。Mary.Salehde[10]构建了一 个新颖的 逆转录病毒载体PZIG(hG-CSFR)，5’端克隆hG-CSFR的突变型cDNA作为一类标志基因，其 表达产物为缺失胞浆功能区的hG-CSFR，3’端为新霉素抗性基因和β-半乳糖苷酶基因的 融 合基因β-geo基因，两者可分别作为短暂转导和长期稳定转导的筛选标志。根据转导的需 要，即用于体内、体外或ex vivo，将目的基因与适当的标记基因共表达，达到筛选目的。I RES序列的参与加强了两种基因共表达的力度。实验表明：在快速筛选和长期筛选的两次实 验中，即两类基因交替作为目的基因，基因的共表达效率较高。因此，Mary Salehde认为， 进行短暂或长期的筛选，只需将目的基因与hG-CSFR的cDNA或β-geo的cDNA克隆于同一载 体。值得注意的是，这两个实验中，载体构建的模式是固定的。因此，我认为：此实验与其 说是创造了一种多用途的筛选载体，不如说是证实了IRES的高效率。因为，不同的目的基因 与同一标记基因在载体中的共存关系是多样的，此外，目的基因与IRES及标志基因的位置变 化，会影响目的基因的表达水平，都将使它失却实用价值。
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总之，用表面标志 筛选已导入基因的细胞，既可用流式细胞记数仪快速、定量地检测目的 基因在靶细胞的表达，也可用免疫学方法分选表达目的基因的细胞，速度快、效率高、毒性 低，并且可在体外追踪导入基因的细胞及子代细胞的分布。上述某些优势是药物筛选无法比 拟的。
作为新生事物的表面标志基因，它的研究并不深入，也不完善。目的基因的表达效率有待提 高，表面标志的抗原性诱发的免疫反应需警惕，成功尚需时日。
近期的研究表明：外源基因的参与并非筛选导入基因细胞的唯一捷径。鞘磷脂病，由于组织 中显著缺少鞘磷脂酶，致使单核-巨噬系统和其他组织的细胞中鞘磷脂堆积。Partricia Le vy Yeyati 等利用目的基因的产物能分解荧光标记底物的特点，通过FACS直接筛选导入基因 的靶细胞。此法操作简单，省时；底物无细胞毒性；少量的基因工程细胞可通过“旁路纠正 效应”即可提供充足的酶纠正其他内源性异常细胞的酶缺陷[11]。基于相似的原理 ，Matthew等成功地分离了葡糖脑苷脂酶纠正的CD34+细胞[12]。
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我们相信：标记基因在筛选阳性转导细胞的发展中，会逐步迈向更简捷、更安全、更高效的 方向。
作者简介:赵志钢，男，26岁，住院医师
参考文献
1 Sugimoto Y,Aksentijevich I,Murray G J, et al. Retroviral co -expression of a multidrug resistance gene(MDR1) and human agalactosidase A for the gene therapy of Fabry's disease.Hum Gene Ther，1995，6(4):905
2 Licht T, Herrmann F, Gottesman M, et al. In vivo drug-selectab le genes:a new concept in gene therapy.Stem Cells,1997，15(6)：104
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3 Sorretino B P, McDonagh K T, Woods D, et al. Expression of retrovir al vectors containing the human multidrug resistance 1 cDNA in hematopoietic cel ls.Blood ,1995，86(2):491
4 Audard M, Pastan I, Gottesman M M. Transfer of the MDR1 gene into haema topoietic cells. Euro J Cancer，1996，6(8)：1 019
5 Trair R K, Towle M, Smith B R. Recombinant retroviruses encoded cell su rface antigens as selectable markers.J.Virol，1988，62(3):4 756
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6 Medin J A, Migita M, Pawliuk R， et al. A bicistronic therapeutic r etroviral vector enables sorting of transduced CD34+ cells and corrects the enzy me deficiency in cells from Gaucher patients.Blood,1996,87(5):1 754
7 Nielsen P J, Lorenz B, Muller A M, et al. Altered erythrocytes and a leaky block in B-cell development in CD24/HAS-deficient mice.1997,89(5):1058
8 Conneally E, Bardy P, Chappel S. Identification and selection of transd uced human hematopoietic cells using murine heat stable antigen(HAS) as a marker of retroviral infection. Jematother,1995,4(1):3
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9 Bierhuizen M F, Westerman Y, Visser T P,et al. Green Fluorescent protein variants as markers of retroviral-mediated gene transfer in primary hematopoietic cells and cell lines.Biochemical and Bioph-ysical Resear ch Communications，1997，234(4)：371
10 Saleh M. A retroviral vector that allows efficient co-expr ession of two genes and the versatility of alternate selection markers. Hum Gene Ther，1997,8(3):979
11 Yeyati P L, Agmon V, Fillat C. Fluorescence-based selection of retro virally transduced cells in the absence of a marker gene:di rect selection of transduced type B Niemann-Pick Kisease cells and evidence for bystander correction. Human Gene Therapy,1995，6(6):975
12 Lorincz M, Herzenberg L A, Diwu Z， et al. Detection and isolation of gene-corrected cells in Gaucher disease via a fluorescence-activated cell sorter assay for lysosomal glucocerebrosidase activity. Blood,1997，89(3):3 412
(收稿：1998-12-28；修回：1999-05-26), http://www.100md.com
单位：第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所血液内科) 重庆，400042
关键词：造血干细胞；逆转录病毒载体；标记基因
第三军医大学学报990812 赵志钢 综述 张书模 审校
中图法分类号 R394.2
Marker genes in gene transduction of primary hematopoie tic cells
造血干细胞的研究和应用，为一些血液系统疾病，恶性肿瘤和遗传病的治疗带来了希望 。造血干细胞能自我更新，能多向分化，是永不枯竭的造血源泉，是基因转移最理想的靶细 胞，然而，显微镜无法分辨造血干细胞，而只能借助单克隆抗体等免疫学方法。逆转录病毒 载体是基因治疗的经典工具，但在造血干细胞的研究中，如何达到更理想的境界尚需全面和 深入的长期探索。小动物实验非常成功，而大动物实验和人体试验却不尽如人意。造血干细 胞作为基因治疗的靶细胞 ，固然有其理想的一面，但它固有的特性，又决定了其基因转导 的效率很低，它阻碍了造血干细胞基础和临床的深入研究。影响转导效率的因素是多方面的 ，人们正致力于各个关键环节的探索，如：多种转导方式的尝试，体外培养体系的完善，造 血生长因子调控和细胞周期及细胞表面受体水平调节的探索等。本文着重讨论，在逆转录病 毒载体介导的基因转移造血干细胞过程中，标记基因的研究策略。文中论述的某些方法，目前可能并未有造血干细胞的实例报道，但对于今后的研究无疑是有益的启示。
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1 标记基因的产生背景和双基因载体的表达策略
逆转录病毒载体转染造血干细胞的效率是由两者，即转染工具和靶细胞的特性决定的。首 先，逆转录病毒是一类单链RNA病毒，其特点是：只感染分裂期细胞，在宿主基因组内可随 机整合；病毒载体携带的外源基因表达持久；逆转录病毒的受体在人造血干细胞表面表达水 平很低。其次，研究表明：CD34+细胞中少量造血干细胞，且99.5%的干细胞处于G0期， 因此逆转录病毒载体转导人造血干细胞的效率是极低的。从多个环节力求提高基因转导效率 的同时，将已导入基因的细胞富集起来，使细胞群落中表达目的基因细胞的比例增加，在基 因治疗中将会有广阔的应用前景。标记基因，正是在这样的构想中建立起来的。
其基本思想是构建同时携带目的基因和标记基因的载体。标记基因真正发挥作用的前提是实 现双基因的共同表达。共表达策略主要有三：①应用两个独立的启动子；②用目的基因和 标记基因产物构建一个嵌合的双功能蛋白质；③应用内部核糖体进入位点(IRES)序列。 在实践中，研究者们发现：应用双启动子存在启动子抑制现象，不能保证两个基因同时表达 ；嵌合蛋白的效率很高，但抗体工程的工作繁琐而复杂；目前最成功的手段是应用内部核糖 体进入位点(IRES)序列。转录时，在上游启动子的控制下，两个基因及IRES序列同时转录 成一条单链mRNA。但是，两个基因的翻译是独立的。目的基因多为帽依赖型，而标记基因则 由IRES控制，其可行性和高效性在双基因逆转录病毒载体中的应用已获验证。IRES的应用， 使单个载体的参与避免了启动子抑制现象，可同时保证多种蛋白质的合成。
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标记基因的研究迄今为止经历了两个阶段。初期是以药物抗性基因的研究为主，第二阶段， 也是目前的研究热点，则以表面标记基因作为筛选手段。两者之间没有绝对显著的优劣之分 ，而且，它们的发展趋势也是共同的：安全，准确，简单，快速。
2 标记基因的初期研究：药物抗性基因的应用
人们发现：某些基因导入细胞后的表达达到一定水平，可使细胞获得对特异性物质的抗性。 在药物筛选的压力下，它们仍能存活。如果使此类基因与目的基因在同一细胞同时表达，可 将表达目的基因的细胞筛选出来。这就是标记基因研究初期的筛选思想。如：neo基因，DHF R基因，MDR1基因等药物抗性基因，它们的应用在一段时间内收效显著，然而随着实践经验 的积累，也逐渐暴露出来一些缺点：筛选用的药物具有的非特异性细胞毒作用，可能损伤正 常组织细胞；持续的药物筛选容易引起基因重排，影响目的基因的表达[1]；药物 筛选周期长，并且不能定量目的基因的表达水平等。那么，药物抗性基因的前景怎样，它能 持续发展吗?答案是肯定的。首先，基因不同，其产物作用的底物也不同。底物是体内和体 外筛选时选择合适基因的基本原则。如neo基因，作为新霉素的抗性基因，只适用于体外组 织培养液中的筛选；而P蛋白，二氢叶酸还原酶及谷胱甘肽-S-转移酶，基于底物药理学和 药代动力学的特点，可用于体内筛选[2]。其次，不同的药物抗性基因，其毒副作 用程度有较大差异。其中，neo基因的毒副作用更为突出。而更为重要的是，耐受多种化疗 药物的耐药基因产物，同时具有筛选效应和对靶细胞的耐药保护效应，尤其是在造血干细 胞的导入，临床上使肿瘤患者和骨髓移植病人能耐受大剂量化疗，从而提高治疗质量。
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二氢叶酸还原酶(DHFR)，在大部分哺乳类动物细胞中活力低。若将外源性DHFR基因导入哺 乳类动物细胞，阳性克隆在无胸腺嘧啶核苷，无核苷氨酸和嘌呤碱基的培养液中生存，而DH FR缺乏的细胞由于氨基酸和核苷酸代谢障碍，蛋白质和核酸的生物合成受阻，不能存活。此 选择系统的一个突出的特点是：用抗叶酸药物氨甲喋呤(MTX)筛选，DHFR和目的基因的表 达产生放大效应。由于哺乳类动物细胞中存在DHFR酶活性，选择突变型DHFR的cDNA更为合理 。人二氢叶酸还原酶(DHFR)突变型cDNA在小鼠体内和体外的实验显示了耐药基因长期、稳 定的表达，临床研究正在进行中。
多药耐药基因(MDR1，multidrug resistance gene)的研究，是漫长而艰辛的。MDR1基因 编码的胞膜上分子量为本170×103u的P蛋白，是ATP依赖思想的外向泵，作用于多种结构 上并不 相关的细胞毒性药物。P蛋白可在正常组织细胞和肿瘤细胞表面表达，但我们更为关注的是 它们在造血系统的分布。它的分布是有规律可循的，在骨髓和外周血，在髓系和淋系以及在 同一细胞系的不同分化阶段又各有特点。它在造血系统的分布有一定生理学意义。MDR1基因 赋予靶细胞足够的药物耐受性的同时，也使它成为药物筛选的主要角色。小鼠的体内和体外 实验证明，导入MDR1基因的靶细胞对特异的毒性药物有强大的耐受性；MDR1基因的转导是干 细胞水平的[3]；P蛋白毒副作用小[4]，转基因小鼠的实验证明骨髓功能 无任何异常；同其 他基因相比，P蛋白有更广谱的作用底物，MDR1则使靶细胞获得不同程度的耐药性[1] 。但是 ，在MDR1基因转导的细胞中可能产生截短的mRNA，导致P蛋白的不完整表达，靶细胞的药物 耐受性降低[3]；此外，DNA重排时有发生，影响基因的稳定表达[1]。
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除药物筛选基因的应用之外，β-半乳糖苷酶基因(lac Z)也曾用于筛选导入基因的细胞， 但由于哺乳动物内源性β的存在以及体内高水平表达外源性β-半乳糖苷酶的难度，限制了 它的应用。
3 标记基因研究的第二阶段：细胞表面标志的应用
1988年，Strair RK[5]第一次提出应用细胞表面抗原筛选导入基因的细胞。他首先 应用转铁 蛋白受体基因作为标记基因，与Tn5 neo基因克隆于同一逆转录病毒载体，细胞表面人转铁 蛋白受体的表达水平，应用与荧光素结合的鼠抗转铁蛋白受体的单克隆抗体来定量。结果是 ，转染的包装细胞系产生的多个克隆，其转铁蛋白受体的表达水平不同。随后有研究了靶细 胞NIH3T3和BRK(Baby rat kidney)细胞的转染效率，并通过G418的药物筛选来验证细胞表 面标志筛选的可行性。研究表明：细胞表面标志的表达水平与包装细胞的产病毒能力有显著 的量的联系；而且，在没有药物选择压力下，细胞稳定地表达外源性基因和生成病毒颗粒可 持续6个月。而后，他们有应用淋巴细胞抗原Leu-1作为标志，所得结论与前者相吻合。最 后，他总结了这种筛选方法的优势：通过细胞表面的免疫荧光反应可快速检测产生大量病毒 颗粒的包装细胞；快速、定量筛选阳性细胞，并根据基因表达的水平不同将细胞分亚群；其 筛选的周期短，一些体外培养困难，生长受限的原始细胞中导入的外源基因也能顺利表达； 而且，如果选择的表面抗原带动物体内不具免疫原性，它在体细胞基因治疗的邻域将有广阔 的应用前景；理论上而言，免疫荧光反应的应用消除了选择压力，避免了因基因重排和其他 遗传变化引起的克隆选择和克隆放大效应。
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如果说表面标志基因的应用是标记基因的一个崭新阶段的话，那么，MDR1基因则跨越 了标记基因的两个阶段。因为，P蛋白也曾作为细胞表面的筛选标志[1]，同随后研 究的白介素-2受体、低亲和力神经生长因子受体一样，都因为分子量大，病毒滴度低，使 目的基因表达受限，因而，并非理想的选择。
那么，作为理想的表面标志基因，它的选择原则怎样呢？首先，靶细胞本身并不表达 相同的基因产物；其次，标志基因要足够小，否则会降低病毒的滴度，影响目的基因的表达 ；表达水平要低，以利于保持较弱的本底；而且，表面标志无免疫原性；有已知的特异性单 克隆抗体，检测方便、快速。
鼠的热稳定抗原(HSA,heat stable antigen)，与人CD24分子同源，为聚糖磷脂酰肌醇(GP I)连接的仅含30个氨基酸的细胞表面糖蛋白。成熟的CD24分子与HSA的氨基酸序列的同源性 较低，仅为57%，但信号肽的同源性较大。他们在多种造血细胞表面正常表达，各自的单克 隆抗体也无交叉反应活性。实际上，含有CD24抗原基因的双基因逆转录病毒载体在此前已成 功地分离了导入基因的原始造血细胞，包括有长期造血重建能力的细胞群落。Jeffrey A.Me din等[6]应用的双基因逆转录病毒载体克隆可葡糖脑苷脂酶(GC)基因和HSA基因 ，在转导 人造血干/祖细胞后根据细胞表面表达的HSA进行筛选，阳性克隆全部含有GC的cDNA，显示了 此选择系统的效率。但是，HSA作为理想的表面标志，有待时间的考验。我们不应忽视HSA在 人体可能激发的免疫反应，因为它分离自造血系统，表达于早期造血发育细胞和一些有核细 胞表面。它究竟在免疫反应中扮演怎样的角色呢？是作为抗原提呈细胞的共刺激分子，是细 胞间粘附的调节因子，还是T、B细胞发育的相关抗原[7]？目前仍不十分清楚。同 样，HSA在 体内造血系细胞的过度表达是否会产生副作用呢？在转基因鼠的动物模型中，HSA的大量表 达并不减少胸腺细胞的总数目。而且，体外实验表明：HSA在人造血细胞的表达也并不改变 其数目和类型[8]。可喜的是，由于可诱导和可调节的启动子的应用，将使HSA的可 控性表达成为现实。
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绿色荧光蛋白的应用为表面标记基因的深入及广泛开辟了新的思路，随着它在多组织、多器 官的表达研究，已经逐渐形成了一套较为完整、成熟的检测体系。由238个氨基酸组成的绿 色荧光蛋白，其基因于1992年首先从水母Aequorea victoria 克隆。多肽内部包括一个天然 形成的染色团，后者包括的咪唑环由65位丝氨酸，66位酪氨酸和67位甘氨酸残基自动环化形 成。绿色荧光蛋白的突变体较野生型自发荧光更强，因而检测更为灵敏。
Ana Lim 利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因研究了逆转录病毒载体转移多种细胞系的情 况，如：K562，HeLa，J774A.1(小鼠巨噬细胞系)，TF-1(人骨髓CD34+髓系多能干祖细 胞系)。其构建的逆转录病毒载体中并不包含常规的neo基因。因为绿色荧光蛋白的存在， 借助流式细胞仪和自动克隆系统，免却了G418较长周期的筛选，使病毒的包装更为简单和迅 速。作者的研究发现：PA317细胞表达的绿色荧光强度与其分泌上清的滴度水平并非具有正 相关性，即：中度荧光的PA317克隆的上清滴度最高，并可稳定保持数月；此外，绿色荧光 蛋白的高表达细胞能被FACS和荧光显微镜发现，FACS和PCR的结果基本一致。转基因小鼠的 实验证实无明显的毒性；表达绿色荧光蛋白的CD34+细胞的集落形成能力与正常无异。CFU -E，CFU-MIX，CFU-GM均产生绿色荧光。
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Frey BM 等在腺病毒载体转染体外扩增的人早期造血细胞的实验中研究了绿色荧光蛋白。 通过分析导入GFP基因的CD34+细胞的集落形成和增殖能力，造血发育正常；当感染复数( MOI，multiplicity of infection)为1到100，CD34+细胞的集落形成几无影响，但当超 过100时，CFU-G，CFU-GM的集落形成受到明显抑制。经过3周的一系列稀释扩增(DELTA ASSAY)，尽管MOI为1到1000，CD34+细胞在细胞因子的作用下其增殖潜能如常。同时，GF P+群落在MOI为500～1000时增加10～15倍，说明腺病毒载体转移标记基因的可行性和无损 伤性。Derek A.Persons等构建可双基因的逆转录病毒载体，以绿色荧光蛋白作为体外筛选 标志，使导入目的基因，人二氢叶酸还原酶基因的小鼠造血细胞在体外富集。在基因转移完 成后的24 h，40%～70%的骨髓细胞产生强荧光；GFP转导的骨髓形成的粒系和髓系造血集落 在荧光 显微镜下极易捕捉；借助FACS筛选的绿色荧光蛋白高表达细胞其药物抗性很强；用导入GFP 的骨髓移植小鼠，动物的脾造血集落和外周血细胞亦有强荧光。
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在基因治疗中，靶细胞的筛选时机是根据需要而变化的。例如，用逆转录病毒载体介导 脑肿 瘤的治疗，植入肿瘤病灶内的为稳定转导的包装细胞；而来源于骨髓的正常细胞或肿瘤细胞 ，则只需短暂的逆转录病毒转导即迅速植回患者体内。Mary.Salehde[10]构建了一 个新颖的 逆转录病毒载体PZIG(hG-CSFR)，5’端克隆hG-CSFR的突变型cDNA作为一类标志基因，其 表达产物为缺失胞浆功能区的hG-CSFR，3’端为新霉素抗性基因和β-半乳糖苷酶基因的 融 合基因β-geo基因，两者可分别作为短暂转导和长期稳定转导的筛选标志。根据转导的需 要，即用于体内、体外或ex vivo，将目的基因与适当的标记基因共表达，达到筛选目的。I RES序列的参与加强了两种基因共表达的力度。实验表明：在快速筛选和长期筛选的两次实 验中，即两类基因交替作为目的基因，基因的共表达效率较高。因此，Mary Salehde认为， 进行短暂或长期的筛选，只需将目的基因与hG-CSFR的cDNA或β-geo的cDNA克隆于同一载 体。值得注意的是，这两个实验中，载体构建的模式是固定的。因此，我认为：此实验与其 说是创造了一种多用途的筛选载体，不如说是证实了IRES的高效率。因为，不同的目的基因 与同一标记基因在载体中的共存关系是多样的，此外，目的基因与IRES及标志基因的位置变 化，会影响目的基因的表达水平，都将使它失却实用价值。
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总之，用表面标志 筛选已导入基因的细胞，既可用流式细胞记数仪快速、定量地检测目的 基因在靶细胞的表达，也可用免疫学方法分选表达目的基因的细胞，速度快、效率高、毒性 低，并且可在体外追踪导入基因的细胞及子代细胞的分布。上述某些优势是药物筛选无法比 拟的。
作为新生事物的表面标志基因，它的研究并不深入，也不完善。目的基因的表达效率有待提 高，表面标志的抗原性诱发的免疫反应需警惕，成功尚需时日。
近期的研究表明：外源基因的参与并非筛选导入基因细胞的唯一捷径。鞘磷脂病，由于组织 中显著缺少鞘磷脂酶，致使单核-巨噬系统和其他组织的细胞中鞘磷脂堆积。Partricia Le vy Yeyati 等利用目的基因的产物能分解荧光标记底物的特点，通过FACS直接筛选导入基因 的靶细胞。此法操作简单，省时；底物无细胞毒性；少量的基因工程细胞可通过“旁路纠正 效应”即可提供充足的酶纠正其他内源性异常细胞的酶缺陷[11]。基于相似的原理 ，Matthew等成功地分离了葡糖脑苷脂酶纠正的CD34+细胞[12]。
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我们相信：标记基因在筛选阳性转导细胞的发展中，会逐步迈向更简捷、更安全、更高效的 方向。
作者简介:赵志钢，男，26岁，住院医师
参考文献
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(收稿：1998-12-28；修回：1999-05-26), http://www.100md.com