2型糖尿病并发脑梗塞患者血小板活化状态分析
作者：刘艺鸣
单位：山东医科大学附属医院 山东济南 250012
关键词：脑梗塞 2型糖尿病 血小板活化 流式细胞术
山东医药002401 摘要 采用流式细胞技术测定59例脑梗塞(有糖尿病32例，无糖尿病27例)及30例健康对照者血小板膜糖蛋白的表达。结果发现糖尿病组血小板活化明显增强且与糖尿病病程有一定关系。认为Ⅱ型糖尿病可导致血小板活化增强，血小板活化增强是糖尿病患者发生梗塞的重要因素。
中图分类号：R743.33，R587.1 文献标识码：A
Abstract To study the relationship between cerebral infarction and type 2 diabetes，we performed the analysis of platelet activation-dependent granular CD62p，CD63 and TSP on platelt membrane by flow cytometry in 59 patients(among 59 patients，32 with type 2 diabetes)with cerebral infarction and compared with 30 controls.Results showed that CD62p，CD63 and TSP were increased in the patients with acute ischemic stroke compared with controls.The expression of CD62p，CD63 and TSP have significant incresed in patients with type 2 diabetes and different during different period.This suggests that the platelet activation must be viewed as a central element in the pathogenesis of thrombotic stroke.
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Key words Cerebral infarction Type 2 diabetes Platelet activation FLowcytometry
糖尿病是脑梗塞发病的高危因素。研究证明，糖尿病患者血管内皮细胞的损害、血小板的激活及血液流变学的改变与脑血栓形成有一定的关系。血小板的激活是脑血栓形成的重要因素。但血小板活化后TSP(凝血酶敏感蛋白)表达尚无报道，亦尚少有关糖尿病并发脑梗塞患者血小板活化状态的研究。为此，我们采用流式细胞技术，测定糖尿病并发脑梗塞患者血小板膜表面CD62p、CD63、TSP含量，并与非糖尿病组作比较，从分子生物学方面探讨糖尿病导致脑梗塞形成的机制。
1 资料与方法
1.1 研究对象 59例脑梗塞患者选自山东医科大学附属医院1997年8月～1999年1月住院及急诊患者。按各类脑血管病诊断标准诊断[1]，均由颅脑CT或MRI证实。随机分为以下两组： ①糖尿病并脑梗塞组：32例，均符合1985年WHO糖尿病诊断标准。糖尿病史1～20年，均为第1次发病。其中男13例，女19例，年龄48～85岁，平均54.3±6.8岁，6例伴高血压病。②原发脑梗塞组：27例，排除糖尿病。其中男16例，女11例；年龄38～82岁，平均53.1±63岁；18例伴高血压病。另取健康查体者30例作为对照组，其中男21例，女9例；年龄45～68岁，平均59.2±3.4岁。
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1.2 检测方法 ①免疫荧光抗体CD63-PE，CD62p-FITC，TSP-PE，均为法国国际免疫有限公司(IMMUNOTECH)产品。FACSVantage流式细胞仪由美国Becton-Dickinson公司提供。②观察指标为CD62p、CD63、TSP，单位(%)。③对照组均于清晨采静脉血，脑梗塞患者分别于接诊时(发病3天以内)及恢复期(发病20天以后)采取从肘前静脉抽血1.5ml，并缓慢注入有0.5ml1%的Na2EDTA试管中，倒置，轻轻混匀，即送实验室。抽血过程中避免接触玻璃器皿。④血小板悬液的制备。1%的Na2EDTA抗凝血2.0ml置塑料试管中，离心(800r/min)5min，取上层富血小板血浆(PRP)。离心(3500r/min)15min，弃上清加入PBS2.0ml，离心(3000r/min)10min，洗涤2次，加1%多聚甲醛1.5ml室温固定30min。⑤血小板膜受体的标记。将固定后的血小板悬液离心(2500r/min)10min，弃上清，加入相应荧光标记抗体，置室温30min，加入PBS2.0ml，离心(2500r/min)10min，弃上清，加入1.0mlPBS将血小板悬浮，上机检测。结果以x±s表示，应用t检验。
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2 结果
2.1 脑梗塞患者CD62p、CD63、TSP表达较正常对照组明显升高，有极显著性差异(P<0.001)，见表1。
表1 脑梗塞组与对照组比较(
±s)
n
CD62p
CD63
TSP
梗塞组
, 百拇医药
对照组
t(P)
59
30
5.20±5.19
1.442±0.48
3.948(P<0.001)
5.70±6.07
1.15±0.632
4.0807(P<0.001)
5.48±4.13
1.47±0.714
, 百拇医药
5.272(P<0.001)
2.2 糖尿病并发脑梗塞组血小板活化明显高于非糖尿病组(P<0.001)见表2。 表2 血小板活化指标与糖尿病的关系(±s)
n
CD62p
CD63
TSP
非糖尿病组
糖尿病组
, http://www.100md.com t(P)
27
32
2.75±1.82
5.46±6.02
1.7071(0.0939)
2.00±1.52
6.74±6.97
2.5961(0.0123)
2.75±1.35
6.10±4.52
2.7986(0.0072)
, 百拇医药
2.3在糖尿病病程不同时期，血小板活化程度不同，以病程6～10年活化最强。见表3。
表3 糖尿病不同时期血小板活化(x±s) 病程(年)
n
CD62p
CD63
TSP
1～?
6～
11～20??
9
12
, http://www.100md.com
11
4.65±3.03
6.74±5.97
4.21±3.43
5.28±4.01
6.35±9.24
4.85±3.86
5.34±2.67
6.71±4.97
4.09±3.03
注：? 病程1～组与6～组比较，P<0.005；??病程11～20年组与6～组相比较，P<0.0013 讨论
, 百拇医药
血小板具有丰富的胞内颗粒，其表面富含糖蛋白和一些酶。血小板膜糖蛋白在血小板粘附，聚集形成血栓过程中起关键作用[2]。这些糖蛋白主要包括CD62p(也称P-选择素，GMP-140)、CD63(也称溶酶体颗粒糖蛋白53，GP53)、TSP(即凝血酶敏感蛋白)。血小板在正常情况下与内皮细胞不发生粘附和聚集，但是在以下因素如高血压、高血糖、高粘血症、机械、化学及免疫等作用下血管内皮细胞受损，血管内皮下胶原暴露，流经此处的血小板被激活。这时，血小板胞浆内α-颗粒上的糖蛋白CD62p、TSP及溶酶体颗粒上的CD63，随着活化血小板“脱颗粒”发生移位而与血小板质膜融合，在血小板膜上表达，作为血小板活化的分子标记物，CD62p、CD63、TSP阳性表达率反应了血小板活化程度及功能状态[3]。研究表明，CD62p介导血小板与粒细胞及内皮细胞的粘附与连接，直接参与动脉血栓形成[4]。本组显示脑梗塞患者急性期血小板高度活化，CD62p、CD63、TSP各值均明显高于正常对照组，证实血小板活化是脑梗塞发生的决定因素。
, 百拇医药
流行病学研究证实，糖尿病是中风的主要危险因素[5]。本实验发现糖尿病患者血小板活化明显增强，糖尿病组CD63、TSP明显高于无糖尿病组(P<0.05)，CD62P也明显升高，无统计学意义(P<0.05)。这与国外报道[6]基本一致(国内尚未见报道)。造成糖尿病中血小板活化增强的机制尚未完全明确，复习国内外文献，笔者认为：慢性高血糖使血浆脂蛋白糖基化，血小板摄取大大增加(正常的低密度脂蛋白极少为血小板所摄取)，导致血小板膜磷脂成分的改变，影响血小板的正常功能；糖尿病患者体内自由基产生过多，损害了血小板膜，又促进脂质过氧化，通过血小板内花生四烯酸代谢，产生过多的血小板聚集剂。这些均可导致血小板活化增强，加重血管损害[7]。
本组实验还显示：糖尿病血小板活化在病程6～10年最高，似乎与糖尿病病程有关。但由于例数较少，病程6～10年的2型糖尿病是否是并发脑梗塞的高发时期还需扩大样本进一步证实。但UKPDS(英国前瞻性糖尿病研究)研究也表明，病程6～10年恰恰是糖尿病血管并发症等大多数终点事件出现的时间。
, http://www.100md.com
参考文献
1，中华医学会.各类脑血管病诊断要点.中华神经科杂志，1996，29(6)：379～380.
2，Okada Y，Copeland BR，MoriE，et al.P-Selectin and intercellular adhesion molecules-1 expression after focal brain ischemia and reperfusion.Stroke，1994，25：202～211.
3，Suzuki H，Abe K.Expression of p-selectin and HSP72-like immunoreactivities in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion.Brain Res，1997，759：321～329.
, http://www.100md.com
4，Mcever RP，Mavtin MN.Amonoclonal antibody to a membrane glycoprotein binds only to activited platelets.Biolchem，1984，259：97～99.
5，《中国卫生年鉴》编辑委员会.人口自然变动及死亡原因，中国卫生年鉴.北京：人民卫生出版社，1993，420.
6，Tschoepe D.Driesch E，Schwippert B.Nieuwenhuis HK.Gries FA Increased exposure of adhesion molecules on activated platedets is not normalized by near normoglycemic control.Diabetes，1995，44：890～894.
7，李家增，贺石林，王鸿利，主编.血栓病学.北京：科学出版社，1998，8.
(收稿日期：2000-07-29), http://www.100md.com
单位：山东医科大学附属医院 山东济南 250012
关键词：脑梗塞 2型糖尿病 血小板活化 流式细胞术
山东医药002401 摘要 采用流式细胞技术测定59例脑梗塞(有糖尿病32例，无糖尿病27例)及30例健康对照者血小板膜糖蛋白的表达。结果发现糖尿病组血小板活化明显增强且与糖尿病病程有一定关系。认为Ⅱ型糖尿病可导致血小板活化增强，血小板活化增强是糖尿病患者发生梗塞的重要因素。
中图分类号：R743.33，R587.1 文献标识码：A
Abstract To study the relationship between cerebral infarction and type 2 diabetes，we performed the analysis of platelet activation-dependent granular CD62p，CD63 and TSP on platelt membrane by flow cytometry in 59 patients(among 59 patients，32 with type 2 diabetes)with cerebral infarction and compared with 30 controls.Results showed that CD62p，CD63 and TSP were increased in the patients with acute ischemic stroke compared with controls.The expression of CD62p，CD63 and TSP have significant incresed in patients with type 2 diabetes and different during different period.This suggests that the platelet activation must be viewed as a central element in the pathogenesis of thrombotic stroke.
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Key words Cerebral infarction Type 2 diabetes Platelet activation FLowcytometry
糖尿病是脑梗塞发病的高危因素。研究证明，糖尿病患者血管内皮细胞的损害、血小板的激活及血液流变学的改变与脑血栓形成有一定的关系。血小板的激活是脑血栓形成的重要因素。但血小板活化后TSP(凝血酶敏感蛋白)表达尚无报道，亦尚少有关糖尿病并发脑梗塞患者血小板活化状态的研究。为此，我们采用流式细胞技术，测定糖尿病并发脑梗塞患者血小板膜表面CD62p、CD63、TSP含量，并与非糖尿病组作比较，从分子生物学方面探讨糖尿病导致脑梗塞形成的机制。
1 资料与方法
1.1 研究对象 59例脑梗塞患者选自山东医科大学附属医院1997年8月～1999年1月住院及急诊患者。按各类脑血管病诊断标准诊断[1]，均由颅脑CT或MRI证实。随机分为以下两组： ①糖尿病并脑梗塞组：32例，均符合1985年WHO糖尿病诊断标准。糖尿病史1～20年，均为第1次发病。其中男13例，女19例，年龄48～85岁，平均54.3±6.8岁，6例伴高血压病。②原发脑梗塞组：27例，排除糖尿病。其中男16例，女11例；年龄38～82岁，平均53.1±63岁；18例伴高血压病。另取健康查体者30例作为对照组，其中男21例，女9例；年龄45～68岁，平均59.2±3.4岁。
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1.2 检测方法 ①免疫荧光抗体CD63-PE，CD62p-FITC，TSP-PE，均为法国国际免疫有限公司(IMMUNOTECH)产品。FACSVantage流式细胞仪由美国Becton-Dickinson公司提供。②观察指标为CD62p、CD63、TSP，单位(%)。③对照组均于清晨采静脉血，脑梗塞患者分别于接诊时(发病3天以内)及恢复期(发病20天以后)采取从肘前静脉抽血1.5ml，并缓慢注入有0.5ml1%的Na2EDTA试管中，倒置，轻轻混匀，即送实验室。抽血过程中避免接触玻璃器皿。④血小板悬液的制备。1%的Na2EDTA抗凝血2.0ml置塑料试管中，离心(800r/min)5min，取上层富血小板血浆(PRP)。离心(3500r/min)15min，弃上清加入PBS2.0ml，离心(3000r/min)10min，洗涤2次，加1%多聚甲醛1.5ml室温固定30min。⑤血小板膜受体的标记。将固定后的血小板悬液离心(2500r/min)10min，弃上清，加入相应荧光标记抗体，置室温30min，加入PBS2.0ml，离心(2500r/min)10min，弃上清，加入1.0mlPBS将血小板悬浮，上机检测。结果以x±s表示，应用t检验。
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2 结果
2.1 脑梗塞患者CD62p、CD63、TSP表达较正常对照组明显升高，有极显著性差异(P<0.001)，见表1。
表1 脑梗塞组与对照组比较(
±s)n
CD62p
CD63
TSP
梗塞组
, 百拇医药
对照组
t(P)
59
30
5.20±5.19
1.442±0.48
3.948(P<0.001)
5.70±6.07
1.15±0.632
4.0807(P<0.001)
5.48±4.13
1.47±0.714
, 百拇医药
5.272(P<0.001)
2.2 糖尿病并发脑梗塞组血小板活化明显高于非糖尿病组(P<0.001)见表2。 表2 血小板活化指标与糖尿病的关系(
±s)n
CD62p
CD63
TSP
非糖尿病组
糖尿病组
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27
32
2.75±1.82
5.46±6.02
1.7071(0.0939)
2.00±1.52
6.74±6.97
2.5961(0.0123)
2.75±1.35
6.10±4.52
2.7986(0.0072)
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2.3在糖尿病病程不同时期，血小板活化程度不同，以病程6～10年活化最强。见表3。
表3 糖尿病不同时期血小板活化(x±s) 病程(年)
n
CD62p
CD63
TSP
1～?
6～
11～20??
9
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11
4.65±3.03
6.74±5.97
4.21±3.43
5.28±4.01
6.35±9.24
4.85±3.86
5.34±2.67
6.71±4.97
4.09±3.03
注：? 病程1～组与6～组比较，P<0.005；??病程11～20年组与6～组相比较，P<0.0013 讨论
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血小板具有丰富的胞内颗粒，其表面富含糖蛋白和一些酶。血小板膜糖蛋白在血小板粘附，聚集形成血栓过程中起关键作用[2]。这些糖蛋白主要包括CD62p(也称P-选择素，GMP-140)、CD63(也称溶酶体颗粒糖蛋白53，GP53)、TSP(即凝血酶敏感蛋白)。血小板在正常情况下与内皮细胞不发生粘附和聚集，但是在以下因素如高血压、高血糖、高粘血症、机械、化学及免疫等作用下血管内皮细胞受损，血管内皮下胶原暴露，流经此处的血小板被激活。这时，血小板胞浆内α-颗粒上的糖蛋白CD62p、TSP及溶酶体颗粒上的CD63，随着活化血小板“脱颗粒”发生移位而与血小板质膜融合，在血小板膜上表达，作为血小板活化的分子标记物，CD62p、CD63、TSP阳性表达率反应了血小板活化程度及功能状态[3]。研究表明，CD62p介导血小板与粒细胞及内皮细胞的粘附与连接，直接参与动脉血栓形成[4]。本组显示脑梗塞患者急性期血小板高度活化，CD62p、CD63、TSP各值均明显高于正常对照组，证实血小板活化是脑梗塞发生的决定因素。
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流行病学研究证实，糖尿病是中风的主要危险因素[5]。本实验发现糖尿病患者血小板活化明显增强，糖尿病组CD63、TSP明显高于无糖尿病组(P<0.05)，CD62P也明显升高，无统计学意义(P<0.05)。这与国外报道[6]基本一致(国内尚未见报道)。造成糖尿病中血小板活化增强的机制尚未完全明确，复习国内外文献，笔者认为：慢性高血糖使血浆脂蛋白糖基化，血小板摄取大大增加(正常的低密度脂蛋白极少为血小板所摄取)，导致血小板膜磷脂成分的改变，影响血小板的正常功能；糖尿病患者体内自由基产生过多，损害了血小板膜，又促进脂质过氧化，通过血小板内花生四烯酸代谢，产生过多的血小板聚集剂。这些均可导致血小板活化增强，加重血管损害[7]。
本组实验还显示：糖尿病血小板活化在病程6～10年最高，似乎与糖尿病病程有关。但由于例数较少，病程6～10年的2型糖尿病是否是并发脑梗塞的高发时期还需扩大样本进一步证实。但UKPDS(英国前瞻性糖尿病研究)研究也表明，病程6～10年恰恰是糖尿病血管并发症等大多数终点事件出现的时间。
, http://www.100md.com
参考文献
1，中华医学会.各类脑血管病诊断要点.中华神经科杂志，1996，29(6)：379～380.
2，Okada Y，Copeland BR，MoriE，et al.P-Selectin and intercellular adhesion molecules-1 expression after focal brain ischemia and reperfusion.Stroke，1994，25：202～211.
3，Suzuki H，Abe K.Expression of p-selectin and HSP72-like immunoreactivities in rat brain after transient middle cerebral artery occlusion.Brain Res，1997，759：321～329.
, http://www.100md.com
4，Mcever RP，Mavtin MN.Amonoclonal antibody to a membrane glycoprotein binds only to activited platelets.Biolchem，1984，259：97～99.
5，《中国卫生年鉴》编辑委员会.人口自然变动及死亡原因，中国卫生年鉴.北京：人民卫生出版社，1993，420.
6，Tschoepe D.Driesch E，Schwippert B.Nieuwenhuis HK.Gries FA Increased exposure of adhesion molecules on activated platedets is not normalized by near normoglycemic control.Diabetes，1995，44：890～894.
7，李家增，贺石林，王鸿利，主编.血栓病学.北京：科学出版社，1998，8.
(收稿日期：2000-07-29), http://www.100md.com