90Y标记OSMcAb的研究
作者：纪方 苗积生 史丽梅 沈茜 陈永裕 陈舰
单位：纪方(第二军医大学长海医院骨科，上海 200433)；陈永裕(第二军医大学长海医院骨科，上海 200433)；陈舰(第二军医大学长海医院骨科，上海 200433)；苗积生(上海第一肺科医院免疫室)；史丽梅(解放军第208医院检验科)；沈茜(第二军医大学长海医院实验诊断科)
关键词：抗体；单克隆；钇放射性核素；放射性核素标记；骨肉瘤
第二军医大学学报000220摘 要：目的：研究放射性核素90Y标记抗人成骨肉瘤单克隆抗体(OSMcAb)的条件及方法。方法：采用EDTA淋洗法从90Y发生器上制备游离90Y，并用DTPA环酐法将90Y标记抗人成骨肉瘤单克隆抗体(OSMcAb)。标记后的单抗进行体外靶细胞结合实验以验证标记后单抗蛋白活性保持程度，以荷瘤裸鼠体内生物分布观察抗体蛋白特异性。结果：(1)EDTA淋洗法制备90Y纯度高，其相对含量可达99.997%。(2)单克隆抗体的90Y标记率达90%以上。(3)本实验条件下使抗体蛋白活性保持82.3%。(4)经OSMcAb导向的90Y主要浓聚肿瘤组织。结论：DTPA环酐法对OSMcAb行90Y标记操作简便实用，抗体蛋白活性及特异性保持良好。
, http://www.100md.com
分类号：R 730.55；R 738.105 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)02-0162-04
Study on OSMcAb labeled with Yttrium-90
JI Fang
(Department of Orthopaedics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
CHEN Yong-Yu
(Department of Orthopaedics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, 百拇医药
MIAO Ji-Sheng
(Department of Immuo-Laborotary Shanghai First Lung Hospital)
SHI Li-Mei
(Department of Laborotary，No.208 Hospital of PLA)
SHEN Qian
(Department of Laborotary Diagnosis, Changhai Hospital,Second Military Medical University)
CHEN Jian
(Department of Laborotary Diagnosis, Changhai Hospital,Second Military Medical University)
, 百拇医药
ABSTRACT：Objective: To study DTPA-coupled OSMcAb labeled with 90Y. Methods: Carrier-free 90Y was obtained from its 90Y/90Sr generator and DTPA-coupled OSMcAb was labeled with carrier-free 90Y. The protein activity of 90Y-DSMcAb was researched through the test of tumor cell-OSMcAb in vitro. The specific of 90Y-DSMcAb was investigated with biodistribution in vivo. Results: (1) The 90Y activity was higher while the contumination of 90Sr was less than 0.003 1%; (2) The efficiency of 90Y-labeled antibodies was more than 90%; (3) The activity of labeled antibody maintained 82.3%. (4) 90Y radioisotopes concentrated in tumor targeted by OsMcAb. Conclusion: OsMcAb can be successfully labeled with 90Y by singgcyclic DTPA-chelation.
, 百拇医药
KEY WORDS：antibody, monoclonal; yttrium radioisotopes; radioisotopes labeling; osteosarcoma▲
自单克隆抗体问世以来，肿瘤的放射免疫治疗就成为攻克肿瘤的重要研究课题。众多放射性核素中，90Y以其独特的优点，倍受瞩目。此核素只发射β射线，能量2.27 meV，半衰期为64 h，对肿瘤病灶杀伤作用强，对机体其他部位损害小，且衰变后变成稳定的子核90Zr，无γ射线对周围环境的污染。本研究探讨90Y标记抗人成骨肉瘤单克隆抗体(OSMcAb)的方法，为临床实验提供依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物及肿瘤细胞 BALB/c裸鼠(3只)及小鼠(12只)(购自上海肿瘤研究所)，10～12 g，4周龄，雌雄不限。成骨肉瘤细胞为建系传代培养的人成骨肉瘤细胞HOS-8603，本课题组自建。
, 百拇医药
1.2 仪器和试剂 90Y发生器(由中国原子能科学研究院制)，DTPA环二酐(CDTPAA)(由上海第一肺科医院免疫室惠赠)，四氮四乙酸环十二烷(DOTA，由北京大学物理系惠赠)。
1.3 90Y的制备 EDTA淋洗法淋洗90Y/90Sr发生器制备的游离90Y。按核素衰变规律测定90Y与90Sr的相对含量。90Y相对含量99.996 9%；90Sr相对含量0.003 1%。采用碳化气化法破坏淋洗液中的EDTA，以除去其对OSMcAb标记的影响。
1.4 90Y标记DTPA及90Y标记DOTA (1)取0.6 mg/ml DMSO溶液10 μl(含DTPA)加入0.65 mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0) 0.1 ml，加入适量90YCl3结合反应一定时间，纸层析分析标记率，0.9%生理盐水展开，游离90Y的 Rf=0，90Y-DTDA的Rf=0.9。(2)取1.0 mg/ml DOTA溶液10 μl，同法加入缓冲液及90YCl3溶液，观察不同反应时间及不同反应温度下的标记率。游离90Y的Rf=0，90Y-DOTA的Rf=0.9。
, 百拇医药
1.5 OSMcAb制备与纯化 OSMcAb-B4由本课题组制备[1]，将分泌OSMcAb的杂交瘤细胞注射于BALB/c鼠腹腔，制备含OSMcAb的腹水，此腹水用50%饱和硫酸铵沉淀法沉淀、透析及过DEAE-Sephadex A50离子交换层析柱。
1.6 90Y标记OSMcAb 取OSMcAb按cDPTAA与OSMcAb分子比50∶1加入含Na2CO3 (pH 8.2)溶液中，室温下搅拌30 min，保持反应液pH 8.2，反应液过Sephadex G-25层析收集蛋白液。调整此含OSMcAb反应液pH为5.0。按1 mg McAb与74 MBq 90Y的比例标记制成含90Y-OSMcAb混合液，4℃下反应3 h，反应液过G-25层析柱，收集蛋白液部分，测定标记率。
1.7 90Y-OSMcAb靶细胞结合试验 取对数生长的人成骨肉瘤细胞1×107个，分装10支试验管。首管加细胞×106，余等倍稀释加入第2～8管(2×106，1×106，-3.125×104个)，第9管不加细胞，只加标记单抗为空白对照，第10管加细胞200万，先加未标记单抗50 μg为封闭对照。取1 388.89 Bq标记单抗分别加入1～10试验管，补充各试验管反应液体积同为0.5 ml。室温下旋转反应2 h，测定各试验管总放射性(T)，将各管细胞洗涤两次以去除未与细胞结合的游离标记单抗，再测各管结合后放射性(B)，根据T/B值对各管总细胞数(C)的倒数作图，获得一回归直线，求出抗体免疫活性分数。
, 百拇医药
1.8 不同90Y标记物生物分布比较 12只正常小鼠，分为90YCl3组、90Y-DTPA组、90Y-DOTA组及90Y-OSMcAb组(n=3)。各组经尾静脉注射相同放射量的不同90Y标记物，24 h后处死实验动物，取组织器官吸干水分后测量放射性，测定每克样品组织放射性(Bq)占实验动物平均每克组织注射放射性(Bq)的百分比。
1.9 90Y-OSMcAb在荷瘤裸鼠体内的分布 应用人成骨肉瘤细胞HOS-8603接种BALB/c鼠建立荷瘤裸鼠的动物模型[2]。3只荷瘤裸鼠，取相同放射量90Y-OSMcAb经腹腔注射。36 h处死实验动物，取组织器官吸干水分后测量放射性，测定每克样品组织Bq占实验动物平均每克组织注射Bq的百分比。
2 结 果
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2.1 标记条件对90Y标记DTPA及DOTA的影响 在常温条件下，90Y与DTPA反应30 min才能完成，并随时间的延长而增加；90Y与DOTA的结合反应在常温下难以达到平衡，而在煮沸条件下标记率明显提高(表1，2)。
表1 标记时间对90Y-DTPA及90Y-DOTA标记率的影响
Tab 1 Effect of 90Y labeled DTPA and
90Y labeled DOTA with different time
(n=3,%) Group
Labeling time(t/min)
, 百拇医药
10
30
60
90
120
90Y-DTPA
45
80
85
90
98
90Y-DOTA
20
, http://www.100md.com
30
40
41
42
表2 反应温度对90Y-DTPA及90Y-DOTA标记率的影响
Tab 2 Effect of 90Y-DTPA and 90Y-DOTA
with different temperature
(n=3,%) Group
Labeling temperature(t/℃)
, 百拇医药
10
30
60
90
120
90Y-DTPA
90
91
92
93
93
90Y-DOTA
25
, 百拇医药
30
40
60
85
2.2 90Y-OSMcAb标记率 本实验室温下反应30 min，DTPA环酸酐法90Y标记OSMcAb的标记率为90%。
2.3 靶细胞结合实验 以细胞数的倒数对总抗体Bq(T)/结合抗体Bq(B)作图(图1)，获得一回归直线，此直线截距的倒数即为抗体蛋白活性保持度。本实验条件下蛋白活性保持82.3%。
图1 标记后单抗与靶细胞结合回归直线图
, 百拇医药 Fig 1 Linear regression of Hos cell-McAb
Y=0.553 2 X+1.352, r=0.999 6
2.4 90Y不同络合物对动物体内生物分布比较 结果见表3。游离90Y主要浓聚于骨，而90Y-DTPA，90Y-OSMcAb在骨内亦有一定浓聚。
2.5 90Y-OSMcAb在靶组织的浓集的放射性比较 90Y-OSMcAb引入荷瘤裸鼠体内后，其肿瘤组织的放射性比度明显高于骨、肝等组织(图2)，说明90Y-OSMcAb可很好地浓集于肿瘤组织。
, 百拇医药 图2 注射90Y-OSMcAb后肿瘤与器官放射性逍集比较
Fig 2 Comparison of organ and tumor
in injected 90Y-OSMcAb
表3 90Y不同标记物小鼠体内24 h生物分布
Tab 3 Distribution of rat injected 90Y labeling after 24 h
(n=3,
±s, %) Organ
90Y-Cl3
, 百拇医药
90Y-DTPA
90Y-DOTA
90Y-OSMcAb
Blood
NS
NS
NS
0.6±0.1
Liver
3.20±0.1
0.72±0.08
0.12±0.02
, 百拇医药
2.86±0.10
Spleen
0.67±0.06
0.36±0.03
NS
0.56±0.02
Kidney
3.12±0.08
1.52±0.06
0.68±0.04
2.13±0.04
Intestine
, 百拇医药
0.98±0.06
0.28±0.01
0.46±0.02
0.20±0.01
Thyroid
0.12±0.01
0.86±0.01
NS
0.22±0.01
Bone
112.46±8.20
32.68±2.62
, 百拇医药
3.58±0.1
42.08±0.82
3 讨 论
目前实验室常用90Y的制备方法是以EDTA-淋洗90Y发生器制备90Y，简便实用。但因EDTA影响90Y与McAbs的螯合，故需将90Y淋洗液中EDTA破坏或去除。本实验采用碳化气化法破坏EDTA，操作简便，设备要求低，EDTA破坏完全，常温下DTPA环酸酐法90Y标记OSMcAb的标记率达90%。
90Y一般通过双功能联接剂标记抗体，DTPA及其衍生物是目前常用的联接剂，其标记条件要求不高，室温下反应30 min就能大部分结合，而DOTA的标记条件较为剧烈，然而单克隆抗体作为一种蛋白质，并不适合剧烈条件标记。本研究采用DTPA环酸酐法螯合90Y与McAb，结果表明螯合率较高。Vaughan[3]和Kalevi[4]分别以CEA和抗卵巢癌肿瘤基质纤维的McAbs应用DTPA环酸酐法螯合，通过过量的DTPA酐和长时间(1～12 h)标记，获得100%标记率。每毫克McAb标记>370 MBq 90Y。本实验采用定量、定时标记，每毫克McAb可标记90Y 74 MBq，省时方便，对抗体蛋白活性影响不大。在核素标记单抗的过程中，诸多因素均可影响蛋白抗体的活性，而影响其应用效果。因此对McAb标记核素后的蛋白活性测定是必要的。因体内进行放免治疗的抗原是活细胞抗原，故评价McAb蛋白活性的方法应该经过活细胞结合试验来解决。
, 百拇医药
苗积生等[5]对核素标记的McAb进行活性测定，取得良好效果。本实验参照此法进行90Y标记抗人成骨肉瘤单克隆抗体的蛋白活性测定表明。抗体蛋白活性保持良好。短时的体内生物分布表明，游离90Y在生物体内主要浓聚于骨，这符合90Y的生物分布特性。90Y-DTPA及90Y-OSMcAb在体内都有骨的浓聚，肝、肾亦有不同程度的放射性积累，这说明DTPA配体标记的90Y在抗体内不稳定，导致体内出现游离90Y。我们的结果与文献报道相一致[6]。90Y-DOTA的体内分布显示其进入体内后90Y骨浓聚有很大的改善，表现出较为稳定的规律。说明相对DTPA及其环酐酸CDTPAA来讲，DOTA是90Y较好的配体，但因其络合条件剧烈，本研究没有进行其作为配体螯合90Y与OSMcAb的观察。
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文献报道[7]联接剂的性质对90Y标记抗体的体内分布影响很大，目前的联接剂还远没有达到上述理想联接剂的要求。尽管体内分布表明DTPA不应是理想的联接剂，但荷瘤裸鼠体内短时分布显示90Y在体内肿瘤组织有较为显著的浓聚。这说明90Y标记McAb这一放免治疗途径的确是一种有发展前途的治疗途径。随着新的理想联接剂的出现，必将使这一方法日趋完善。
作者简介：纪方(1965～)，男(汉族)，硕士，主治医师
参考文献：
[1]宝建中，陈永裕，吴存忠,等. 分泌抗骨肉瘤抗体杂交瘤细胞建株研究[J]. 上海免疫学杂志,1991,11(1)：6-8.
[2]陈永裕，刘振华，徐登仁,等. 裸鼠人成骨肉瘤骨模型的建立[J].第二军医大学学报,1990,11(6)：495-496.
, 百拇医药
[3]Vanghnn ATM. The production and biological distribution of 90Y labeled antibodies[J]. Int J Appl Radio, Isot, 1995，36(10): 803-807.
[4]Kalevi K, Kaj L, Sven ES, et al. Radioimmunotherapy with 90Y-labeled McAbs in a nude mouse ovarian cancer model[J]. Acta Oncologica, 1993,32(8): 801-809.
[5]苗积生. 放射核素标记McAbs免疫活性测定[J]. 中国实验免疫学杂志, 1991，3(1): 32-33.
[6]Sharkey RM, Motta HC, Pawlyk D, et al. Biodistribution and radiation dose estimates for yttrium and iodine labeled monoclonal antibody IgG and fragments in nude mice bearing human colonic tumor xenografts[J]. Cancer Res, 1990, 50(15): 2330-2334.
[7]吴永慧，刘 斌，左育红，等.90Y标记单克隆抗体用于放免治疗的研究[J]. 同位素，1994, 7(2): 98-101.
收稿日期：1999-08-10
修稿日期：1999-12-20, 百拇医药
单位：纪方(第二军医大学长海医院骨科，上海 200433)；陈永裕(第二军医大学长海医院骨科，上海 200433)；陈舰(第二军医大学长海医院骨科，上海 200433)；苗积生(上海第一肺科医院免疫室)；史丽梅(解放军第208医院检验科)；沈茜(第二军医大学长海医院实验诊断科)
关键词：抗体；单克隆；钇放射性核素；放射性核素标记；骨肉瘤
第二军医大学学报000220摘 要：目的：研究放射性核素90Y标记抗人成骨肉瘤单克隆抗体(OSMcAb)的条件及方法。方法：采用EDTA淋洗法从90Y发生器上制备游离90Y，并用DTPA环酐法将90Y标记抗人成骨肉瘤单克隆抗体(OSMcAb)。标记后的单抗进行体外靶细胞结合实验以验证标记后单抗蛋白活性保持程度，以荷瘤裸鼠体内生物分布观察抗体蛋白特异性。结果：(1)EDTA淋洗法制备90Y纯度高，其相对含量可达99.997%。(2)单克隆抗体的90Y标记率达90%以上。(3)本实验条件下使抗体蛋白活性保持82.3%。(4)经OSMcAb导向的90Y主要浓聚肿瘤组织。结论：DTPA环酐法对OSMcAb行90Y标记操作简便实用，抗体蛋白活性及特异性保持良好。
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分类号：R 730.55；R 738.105 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)02-0162-04
Study on OSMcAb labeled with Yttrium-90
JI Fang
(Department of Orthopaedics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
CHEN Yong-Yu
(Department of Orthopaedics, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, 百拇医药
MIAO Ji-Sheng
(Department of Immuo-Laborotary Shanghai First Lung Hospital)
SHI Li-Mei
(Department of Laborotary，No.208 Hospital of PLA)
SHEN Qian
(Department of Laborotary Diagnosis, Changhai Hospital,Second Military Medical University)
CHEN Jian
(Department of Laborotary Diagnosis, Changhai Hospital,Second Military Medical University)
, 百拇医药
ABSTRACT：Objective: To study DTPA-coupled OSMcAb labeled with 90Y. Methods: Carrier-free 90Y was obtained from its 90Y/90Sr generator and DTPA-coupled OSMcAb was labeled with carrier-free 90Y. The protein activity of 90Y-DSMcAb was researched through the test of tumor cell-OSMcAb in vitro. The specific of 90Y-DSMcAb was investigated with biodistribution in vivo. Results: (1) The 90Y activity was higher while the contumination of 90Sr was less than 0.003 1%; (2) The efficiency of 90Y-labeled antibodies was more than 90%; (3) The activity of labeled antibody maintained 82.3%. (4) 90Y radioisotopes concentrated in tumor targeted by OsMcAb. Conclusion: OsMcAb can be successfully labeled with 90Y by singgcyclic DTPA-chelation.
, 百拇医药
KEY WORDS：antibody, monoclonal; yttrium radioisotopes; radioisotopes labeling; osteosarcoma▲
自单克隆抗体问世以来，肿瘤的放射免疫治疗就成为攻克肿瘤的重要研究课题。众多放射性核素中，90Y以其独特的优点，倍受瞩目。此核素只发射β射线，能量2.27 meV，半衰期为64 h，对肿瘤病灶杀伤作用强，对机体其他部位损害小，且衰变后变成稳定的子核90Zr，无γ射线对周围环境的污染。本研究探讨90Y标记抗人成骨肉瘤单克隆抗体(OSMcAb)的方法，为临床实验提供依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物及肿瘤细胞 BALB/c裸鼠(3只)及小鼠(12只)(购自上海肿瘤研究所)，10～12 g，4周龄，雌雄不限。成骨肉瘤细胞为建系传代培养的人成骨肉瘤细胞HOS-8603，本课题组自建。
, 百拇医药
1.2 仪器和试剂 90Y发生器(由中国原子能科学研究院制)，DTPA环二酐(CDTPAA)(由上海第一肺科医院免疫室惠赠)，四氮四乙酸环十二烷(DOTA，由北京大学物理系惠赠)。
1.3 90Y的制备 EDTA淋洗法淋洗90Y/90Sr发生器制备的游离90Y。按核素衰变规律测定90Y与90Sr的相对含量。90Y相对含量99.996 9%；90Sr相对含量0.003 1%。采用碳化气化法破坏淋洗液中的EDTA，以除去其对OSMcAb标记的影响。
1.4 90Y标记DTPA及90Y标记DOTA (1)取0.6 mg/ml DMSO溶液10 μl(含DTPA)加入0.65 mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0) 0.1 ml，加入适量90YCl3结合反应一定时间，纸层析分析标记率，0.9%生理盐水展开，游离90Y的 Rf=0，90Y-DTDA的Rf=0.9。(2)取1.0 mg/ml DOTA溶液10 μl，同法加入缓冲液及90YCl3溶液，观察不同反应时间及不同反应温度下的标记率。游离90Y的Rf=0，90Y-DOTA的Rf=0.9。
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1.5 OSMcAb制备与纯化 OSMcAb-B4由本课题组制备[1]，将分泌OSMcAb的杂交瘤细胞注射于BALB/c鼠腹腔，制备含OSMcAb的腹水，此腹水用50%饱和硫酸铵沉淀法沉淀、透析及过DEAE-Sephadex A50离子交换层析柱。
1.6 90Y标记OSMcAb 取OSMcAb按cDPTAA与OSMcAb分子比50∶1加入含Na2CO3 (pH 8.2)溶液中，室温下搅拌30 min，保持反应液pH 8.2，反应液过Sephadex G-25层析收集蛋白液。调整此含OSMcAb反应液pH为5.0。按1 mg McAb与74 MBq 90Y的比例标记制成含90Y-OSMcAb混合液，4℃下反应3 h，反应液过G-25层析柱，收集蛋白液部分，测定标记率。
1.7 90Y-OSMcAb靶细胞结合试验 取对数生长的人成骨肉瘤细胞1×107个，分装10支试验管。首管加细胞×106，余等倍稀释加入第2～8管(2×106，1×106，-3.125×104个)，第9管不加细胞，只加标记单抗为空白对照，第10管加细胞200万，先加未标记单抗50 μg为封闭对照。取1 388.89 Bq标记单抗分别加入1～10试验管，补充各试验管反应液体积同为0.5 ml。室温下旋转反应2 h，测定各试验管总放射性(T)，将各管细胞洗涤两次以去除未与细胞结合的游离标记单抗，再测各管结合后放射性(B)，根据T/B值对各管总细胞数(C)的倒数作图，获得一回归直线，求出抗体免疫活性分数。
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1.8 不同90Y标记物生物分布比较 12只正常小鼠，分为90YCl3组、90Y-DTPA组、90Y-DOTA组及90Y-OSMcAb组(n=3)。各组经尾静脉注射相同放射量的不同90Y标记物，24 h后处死实验动物，取组织器官吸干水分后测量放射性，测定每克样品组织放射性(Bq)占实验动物平均每克组织注射放射性(Bq)的百分比。
1.9 90Y-OSMcAb在荷瘤裸鼠体内的分布 应用人成骨肉瘤细胞HOS-8603接种BALB/c鼠建立荷瘤裸鼠的动物模型[2]。3只荷瘤裸鼠，取相同放射量90Y-OSMcAb经腹腔注射。36 h处死实验动物，取组织器官吸干水分后测量放射性，测定每克样品组织Bq占实验动物平均每克组织注射Bq的百分比。
2 结 果
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2.1 标记条件对90Y标记DTPA及DOTA的影响 在常温条件下，90Y与DTPA反应30 min才能完成，并随时间的延长而增加；90Y与DOTA的结合反应在常温下难以达到平衡，而在煮沸条件下标记率明显提高(表1，2)。
表1 标记时间对90Y-DTPA及90Y-DOTA标记率的影响
Tab 1 Effect of 90Y labeled DTPA and
90Y labeled DOTA with different time
(n=3,%) Group
Labeling time(t/min)
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30
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90Y-DTPA
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90Y-DOTA
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41
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表2 反应温度对90Y-DTPA及90Y-DOTA标记率的影响
Tab 2 Effect of 90Y-DTPA and 90Y-DOTA
with different temperature
(n=3,%) Group
Labeling temperature(t/℃)
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90Y-DTPA
90
91
92
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90Y-DOTA
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60
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2.2 90Y-OSMcAb标记率 本实验室温下反应30 min，DTPA环酸酐法90Y标记OSMcAb的标记率为90%。
2.3 靶细胞结合实验 以细胞数的倒数对总抗体Bq(T)/结合抗体Bq(B)作图(图1)，获得一回归直线，此直线截距的倒数即为抗体蛋白活性保持度。本实验条件下蛋白活性保持82.3%。
图1 标记后单抗与靶细胞结合回归直线图
, 百拇医药 Fig 1 Linear regression of Hos cell-McAb
Y=0.553 2 X+1.352, r=0.999 6
2.4 90Y不同络合物对动物体内生物分布比较 结果见表3。游离90Y主要浓聚于骨，而90Y-DTPA，90Y-OSMcAb在骨内亦有一定浓聚。
2.5 90Y-OSMcAb在靶组织的浓集的放射性比较 90Y-OSMcAb引入荷瘤裸鼠体内后，其肿瘤组织的放射性比度明显高于骨、肝等组织(图2)，说明90Y-OSMcAb可很好地浓集于肿瘤组织。
, 百拇医药 图2 注射90Y-OSMcAb后肿瘤与器官放射性逍集比较
Fig 2 Comparison of organ and tumor
in injected 90Y-OSMcAb
表3 90Y不同标记物小鼠体内24 h生物分布
Tab 3 Distribution of rat injected 90Y labeling after 24 h
(n=3,
±s, %) Organ90Y-Cl3
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90Y-DTPA
90Y-DOTA
90Y-OSMcAb
Blood
NS
NS
NS
0.6±0.1
Liver
3.20±0.1
0.72±0.08
0.12±0.02
, 百拇医药
2.86±0.10
Spleen
0.67±0.06
0.36±0.03
NS
0.56±0.02
Kidney
3.12±0.08
1.52±0.06
0.68±0.04
2.13±0.04
Intestine
, 百拇医药
0.98±0.06
0.28±0.01
0.46±0.02
0.20±0.01
Thyroid
0.12±0.01
0.86±0.01
NS
0.22±0.01
Bone
112.46±8.20
32.68±2.62
, 百拇医药
3.58±0.1
42.08±0.82
3 讨 论
目前实验室常用90Y的制备方法是以EDTA-淋洗90Y发生器制备90Y，简便实用。但因EDTA影响90Y与McAbs的螯合，故需将90Y淋洗液中EDTA破坏或去除。本实验采用碳化气化法破坏EDTA，操作简便，设备要求低，EDTA破坏完全，常温下DTPA环酸酐法90Y标记OSMcAb的标记率达90%。
90Y一般通过双功能联接剂标记抗体，DTPA及其衍生物是目前常用的联接剂，其标记条件要求不高，室温下反应30 min就能大部分结合，而DOTA的标记条件较为剧烈，然而单克隆抗体作为一种蛋白质，并不适合剧烈条件标记。本研究采用DTPA环酸酐法螯合90Y与McAb，结果表明螯合率较高。Vaughan[3]和Kalevi[4]分别以CEA和抗卵巢癌肿瘤基质纤维的McAbs应用DTPA环酸酐法螯合，通过过量的DTPA酐和长时间(1～12 h)标记，获得100%标记率。每毫克McAb标记>370 MBq 90Y。本实验采用定量、定时标记，每毫克McAb可标记90Y 74 MBq，省时方便，对抗体蛋白活性影响不大。在核素标记单抗的过程中，诸多因素均可影响蛋白抗体的活性，而影响其应用效果。因此对McAb标记核素后的蛋白活性测定是必要的。因体内进行放免治疗的抗原是活细胞抗原，故评价McAb蛋白活性的方法应该经过活细胞结合试验来解决。
, 百拇医药
苗积生等[5]对核素标记的McAb进行活性测定，取得良好效果。本实验参照此法进行90Y标记抗人成骨肉瘤单克隆抗体的蛋白活性测定表明。抗体蛋白活性保持良好。短时的体内生物分布表明，游离90Y在生物体内主要浓聚于骨，这符合90Y的生物分布特性。90Y-DTPA及90Y-OSMcAb在体内都有骨的浓聚，肝、肾亦有不同程度的放射性积累，这说明DTPA配体标记的90Y在抗体内不稳定，导致体内出现游离90Y。我们的结果与文献报道相一致[6]。90Y-DOTA的体内分布显示其进入体内后90Y骨浓聚有很大的改善，表现出较为稳定的规律。说明相对DTPA及其环酐酸CDTPAA来讲，DOTA是90Y较好的配体，但因其络合条件剧烈，本研究没有进行其作为配体螯合90Y与OSMcAb的观察。
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文献报道[7]联接剂的性质对90Y标记抗体的体内分布影响很大，目前的联接剂还远没有达到上述理想联接剂的要求。尽管体内分布表明DTPA不应是理想的联接剂，但荷瘤裸鼠体内短时分布显示90Y在体内肿瘤组织有较为显著的浓聚。这说明90Y标记McAb这一放免治疗途径的确是一种有发展前途的治疗途径。随着新的理想联接剂的出现，必将使这一方法日趋完善。
作者简介：纪方(1965～)，男(汉族)，硕士，主治医师
参考文献：
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[2]陈永裕，刘振华，徐登仁,等. 裸鼠人成骨肉瘤骨模型的建立[J].第二军医大学学报,1990,11(6)：495-496.
, 百拇医药
[3]Vanghnn ATM. The production and biological distribution of 90Y labeled antibodies[J]. Int J Appl Radio, Isot, 1995，36(10): 803-807.
[4]Kalevi K, Kaj L, Sven ES, et al. Radioimmunotherapy with 90Y-labeled McAbs in a nude mouse ovarian cancer model[J]. Acta Oncologica, 1993,32(8): 801-809.
[5]苗积生. 放射核素标记McAbs免疫活性测定[J]. 中国实验免疫学杂志, 1991，3(1): 32-33.
[6]Sharkey RM, Motta HC, Pawlyk D, et al. Biodistribution and radiation dose estimates for yttrium and iodine labeled monoclonal antibody IgG and fragments in nude mice bearing human colonic tumor xenografts[J]. Cancer Res, 1990, 50(15): 2330-2334.
[7]吴永慧，刘 斌，左育红，等.90Y标记单克隆抗体用于放免治疗的研究[J]. 同位素，1994, 7(2): 98-101.
收稿日期：1999-08-10
修稿日期：1999-12-20, 百拇医药