HPV16L1 ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达
http://www.100md.com
山东医科大学学报 2000年第2期第38卷 论著
作者：齐眉 于修平 卞继峰 赵蔚明 董杰德 贾继辉
单位：山东医科大学微生物学与免疫学教研室
关键词：乳头瘤病毒；人；大肠杆菌；克隆；分子；基因表达
山东医科大学学报000202
摘 要：目的：获得足够量的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1融合蛋白及含HPV16L1ORF序列的基因重组体。方法：通过PCR扩增获得HPV16L1基因片段，将此片段插入原核细胞表达载体pGEMEX-1，构建相应的重组表达质粒pGEMEX-L1，将此质粒转化大肠杆菌JMl09(DE3)，得到的转化子经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Western blotting免疫印迹分析。结果：HPV16L1基因重组体构建成功，克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Western blotting检测中具有和抗HPV16L1阳性血清反应的抗原性。结论：HPV16L1基因片段可在大肠杆菌中得到有效表达，表达产物可与相应的抗血清发生阳性反应。
, 百拇医药
分类号：R373.1；R378.2+1；Q785 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0117-03
CLONING AND EXPRESSION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 L1 ORF IN E.COLI
QI Mei
Abstract：Objective:To obtain enough HPV16 L1 fused protein and recombinant plasmid containing HPV16 L1 gene. Methods:HPV16 L1 gene was amplified with PCR. The HPV16 L1 gene was first inserted into the pGEM-T easy vector and then was inserted into the expressing vector pGEMEX-1, to construct a recombiant expressing plasmid,which was transformed into the E.coli Jm109(DE3) and the IPTG induced transformant was analyzed with Western blotting. Results: The induced expressing product was shown to have antigenic reactivity to HPV16 L1 antibody positive sera. Conclusion: The HPV16 L1 gene was expressed effectively in E.coli.
, 百拇医药
Keywords：Papillomavirus,human;Escherichia coli;Clone,Molecule;Gene expressing 人乳头瘤病毒(HPV)中的高危型HPV16是宫颈癌的重要诱因[1]。HPV16L1ORF是HPV16的主要晚期开放读码框，编码其主要衣壳蛋白。由于缺乏合适的组织细胞培养系统，从而限制了有关HPV各方面的研究。本课题利用PCR克隆技术获得了HPV16L1ORF的基因重组体及其表达产物，为进一步研究HPV感染的诊断试剂及防治疫苗打下基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株、质粒及试剂盒大肠杆菌JM109及JM109(DE3)为华美生物工程公司产品，含HPV16L1全长序列的重组质粒p16L1BN由于修平教授构建，pGEM-Teasy载体系统试剂盒为Promega公司产品。
, 百拇医药
1.1.2酶及其他试剂限制性内切酶、连接酶、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为华美工程公司产品，抗HPV16L1阳性血清由美国Galloway教授惠赠，PCR扩增所用试剂为Promega公司产品。
1.1.3PCR引物的设计与合成根据HPV16L1基因序列及计算机检索结果设计并合成一对PCR引物。引物序列分别为：上游(P1)：5′CGCGAAGCTTATGTCTCTTTGGCTGCCTAG3′下游(P2)：5′CGCGATCGATTTACAGCTTACGTTTTTTGC3′
引物的合成由北京赛百盛公司协助完成：两引物均由30个碱基构成，扩增片段长1537bp，起始密码子ATG之前增设HindⅢ酶切位点，终止密码子TAA之后增设ClaⅠ酶切位点。
1.2方法
1.2.1PCR扩增反应体系50μl，含10×PCR缓冲液5μl，dNTPs0.2mmol/L，MgCl25mmol/L，引物P1及P2各0.2μg，模板质粒p16L1BN10ng，Taq酶1U，石蜡油50μl。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min；72℃延伸3min，55℃退火3min，循环35次后72℃延伸10min，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳梭测扩增效果。
, 百拇医药
1.2.2基因重组体pGEM-L1的构建和鉴定利用T-A克隆法将PCR扩增产物插入载体pGEM-T，构建重组质粒pGEM-L1。有关方法参照试剂盒说明书及分子克隆一书。以SacⅠ、HindⅢ双酶切重组质粒鉴定PCR产物插入方向。
1.2.3表达质粒pGEMEX-L1的构建和鉴定选择正向克隆的pGEM-L1重组质粒，以NotⅠ酶解，电泳分离出HPV16DNA片段，然后利用连接酶将其插入到表达载体pGEMEX-1的NotⅠ酶切位点中，构建重组质料pGEMEX-L1，以HindⅢ酶解重组质粒鉴定目的基因的插入方向。
1.2.4表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达选择正向克隆的pGEMEX-L1重组质粒转化大肠杆菌JM109(DE3)，加入IPTG进行诱导表达。然后在SDS-PAGE条件下，以抗HPV16L1阳性血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgC为二抗.进行Westernblot检测。上样、蛋白转印、免疫显色等均参照分子克隆一书进行。
, 百拇医药
2结果
2.1PCR扩增利用自行设计的特异性引物，经PCR可扩增HPV16L1DNA第5638-7155碱基序列以及两端增设的HindⅢ、ClaⅠ酶切位点，扩增产物长1537bp。电泳检测结果见图1，由图1可见一条清晰的扩增条带，片段大小与预计相符。
图1HPV16L1PCR扩增产物的电泳结果
1：DNAmarker2～6：HPV16L1PCR产物7：阴性对照
Fig.1PCRproductswithprimersfromHPV16L1vector
1:pBR322/BstN12～6:PCRproductsfromHPV16L1vector7:Negativecontrol
, 百拇医药 2.2重组质粒pGEM-L1的鉴定载体pGEM-T有1个SacⅠ酶切位点，无HindⅢ酶切位点；HPV16L1DNA的起始端含增设的HindⅢ酶切位点，无SacⅠ酶切位点。二者连接形成的重组质粒pGEM-L1经SacⅠ、HindⅢ双酶切后，正向克隆预计得到2973bp和1582bp的酶切片段，而反向克隆预计得到4500bp和55bp片段。电泳检测结果见图2。C为反向克隆，D为正向克隆。
图2重组质粒pGEM-L1的酶切分析
1：DNAmarker2：SacⅠ酶切后的pGEM-L13，4：SacⅠ和HindⅢ双酶切后的pGEM-L1
Fig.2RestricationenzymeanalysisofrecombinantplasmidpGEM-L1
1:pBR322/BstN12:pGEM-L1/SacⅠ3,4:pGEM-L1/sacⅠ+HindⅢ
, http://www.100md.com
2.3表达质粒pGEMEX-L1的鉴定表达载体pGEMEX-L1和目的基因HPV16L1DNA各含一个HindⅢ酶切位点。二者连接形成的重组质粒经HindⅢ酶切后，正向克隆预计得到4005bp和1563bp片段，反向克隆预计得到5568bp一条片段。正向克隆的酶切电泳检测结果见图3。
图3重组质粒pGEMEX-L1的酶切分析
1：DNAmarker2：HindⅢ酶切后的pGEMEX-L1
Fig.31:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ2:pGEMEX-L1/HindⅢ
2.4诱导表达产物的Westernblottmg分析免疫显色结果见图4，由图4可见一条清晰的特异性反应条带出现，表明表达产物具有与相应抗血清发生反应的抗原性。
图4大肠杆菌中表达的pGEMEX-L1融合蛋白的Westernblot免疫检测结果
, http://www.100md.com
Fig.4Immunoblotanalysisofreactitityofanti-HPV16L1antibodiestopGEMEX-L1fusionproteininWesternblot
3讨论
L1蛋白是HPV的主要衣壳蛋白，具有在原核细胞及真核细胞中自我组装成病毒样颗粒的特性(VLP)。大量实验表明，HPVL1蛋白具有较强的免疫原性，能刺激机体产生中和抗体，在动物实验中可保护动物免受相应病毒的攻击[2～4]。另外，L1蛋白还具有增强机体细胞免疫应答的功能[5]，因此可作为研制HPV预防及治疗疫苗的理想靶抗原。
由于酶切位点的限制，国外构建的HPVL1基因重组体多是仅含L1墓因的部分序列，而且克隆的L1DNA片段不易于酶切释放。本研究利用PCR技术和T-A克隆法制备的HPV16L1基因重组体含有HPV16L1全长基因序列的95%，并可根据需要选择不同的酶切位点释放目的基因，因此对于相关实验研究具有较大应用价值。
, 百拇医药
原核细胞表达系统具有操作简便、快速、高效表达及表达产物易于纯化等特点。实验表明，本研究克隆的HPV16L1DNA在大肠杆菌中得到了有效表达，表达产物可与相应抗血清发生阳性反应。这一实验结果为制备HPV感染的诊断试剂盒及进行肿瘤疫苗研制打下了基础。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39670038) 山东省自然科学基金资助课题
参考文献： [1]Lonincz ATR, et al. Human papillomavirus infection of the cevix:relative risk association of 15 common angenital types [J]. Obstet Gynecol,1992,79:328
[2]Jarrett WF, et al. Studies on vaccination aganist papillomavirus: prophylactic and therapeutic vaccination with recombinant structural proteins[J]. J Virol,1994,184:33
, http://www.100md.com
[3]Chistensen ND, et al. Assembled baculovirus-expressed human papillomavirus type 11 L1 capsid protein virus-like particles are recognized by neutralizing monoclonal antibodies and induce high titers of neutralizing antibodies[J]. J Gen Virol, 1994,75:2271
[4]Hagensce ME, et al. Immunization of mice with HPV vaccina virus recombinants generates serum IgG, IgM and muco sal IgA antibodies[J].J Virol,1995,206:174
[5]Dupuy C, et al. Cell mediated immunity induced in mice by human papillomavirus 16 L1 virus-like particles[J]. Microb Pathol,1997,22:219
收稿日期：1999-05-20, 百拇医药
单位：山东医科大学微生物学与免疫学教研室
关键词：乳头瘤病毒；人；大肠杆菌；克隆；分子；基因表达
山东医科大学学报000202
摘 要：目的：获得足够量的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1融合蛋白及含HPV16L1ORF序列的基因重组体。方法：通过PCR扩增获得HPV16L1基因片段，将此片段插入原核细胞表达载体pGEMEX-1，构建相应的重组表达质粒pGEMEX-L1，将此质粒转化大肠杆菌JMl09(DE3)，得到的转化子经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Western blotting免疫印迹分析。结果：HPV16L1基因重组体构建成功，克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Western blotting检测中具有和抗HPV16L1阳性血清反应的抗原性。结论：HPV16L1基因片段可在大肠杆菌中得到有效表达，表达产物可与相应的抗血清发生阳性反应。
, 百拇医药
分类号：R373.1；R378.2+1；Q785 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0117-03
CLONING AND EXPRESSION OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 L1 ORF IN E.COLI
QI Mei
Abstract：Objective:To obtain enough HPV16 L1 fused protein and recombinant plasmid containing HPV16 L1 gene. Methods:HPV16 L1 gene was amplified with PCR. The HPV16 L1 gene was first inserted into the pGEM-T easy vector and then was inserted into the expressing vector pGEMEX-1, to construct a recombiant expressing plasmid,which was transformed into the E.coli Jm109(DE3) and the IPTG induced transformant was analyzed with Western blotting. Results: The induced expressing product was shown to have antigenic reactivity to HPV16 L1 antibody positive sera. Conclusion: The HPV16 L1 gene was expressed effectively in E.coli.
, 百拇医药
Keywords：Papillomavirus,human;Escherichia coli;Clone,Molecule;Gene expressing 人乳头瘤病毒(HPV)中的高危型HPV16是宫颈癌的重要诱因[1]。HPV16L1ORF是HPV16的主要晚期开放读码框，编码其主要衣壳蛋白。由于缺乏合适的组织细胞培养系统，从而限制了有关HPV各方面的研究。本课题利用PCR克隆技术获得了HPV16L1ORF的基因重组体及其表达产物，为进一步研究HPV感染的诊断试剂及防治疫苗打下基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株、质粒及试剂盒大肠杆菌JM109及JM109(DE3)为华美生物工程公司产品，含HPV16L1全长序列的重组质粒p16L1BN由于修平教授构建，pGEM-Teasy载体系统试剂盒为Promega公司产品。
, 百拇医药
1.1.2酶及其他试剂限制性内切酶、连接酶、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为华美工程公司产品，抗HPV16L1阳性血清由美国Galloway教授惠赠，PCR扩增所用试剂为Promega公司产品。
1.1.3PCR引物的设计与合成根据HPV16L1基因序列及计算机检索结果设计并合成一对PCR引物。引物序列分别为：上游(P1)：5′CGCGAAGCTTATGTCTCTTTGGCTGCCTAG3′下游(P2)：5′CGCGATCGATTTACAGCTTACGTTTTTTGC3′
引物的合成由北京赛百盛公司协助完成：两引物均由30个碱基构成，扩增片段长1537bp，起始密码子ATG之前增设HindⅢ酶切位点，终止密码子TAA之后增设ClaⅠ酶切位点。
1.2方法
1.2.1PCR扩增反应体系50μl，含10×PCR缓冲液5μl，dNTPs0.2mmol/L，MgCl25mmol/L，引物P1及P2各0.2μg，模板质粒p16L1BN10ng，Taq酶1U，石蜡油50μl。PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min；72℃延伸3min，55℃退火3min，循环35次后72℃延伸10min，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳梭测扩增效果。
, 百拇医药
1.2.2基因重组体pGEM-L1的构建和鉴定利用T-A克隆法将PCR扩增产物插入载体pGEM-T，构建重组质粒pGEM-L1。有关方法参照试剂盒说明书及分子克隆一书。以SacⅠ、HindⅢ双酶切重组质粒鉴定PCR产物插入方向。
1.2.3表达质粒pGEMEX-L1的构建和鉴定选择正向克隆的pGEM-L1重组质粒，以NotⅠ酶解，电泳分离出HPV16DNA片段，然后利用连接酶将其插入到表达载体pGEMEX-1的NotⅠ酶切位点中，构建重组质料pGEMEX-L1，以HindⅢ酶解重组质粒鉴定目的基因的插入方向。
1.2.4表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达选择正向克隆的pGEMEX-L1重组质粒转化大肠杆菌JM109(DE3)，加入IPTG进行诱导表达。然后在SDS-PAGE条件下，以抗HPV16L1阳性血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgC为二抗.进行Westernblot检测。上样、蛋白转印、免疫显色等均参照分子克隆一书进行。
, 百拇医药
2结果
2.1PCR扩增利用自行设计的特异性引物，经PCR可扩增HPV16L1DNA第5638-7155碱基序列以及两端增设的HindⅢ、ClaⅠ酶切位点，扩增产物长1537bp。电泳检测结果见图1，由图1可见一条清晰的扩增条带，片段大小与预计相符。
图1HPV16L1PCR扩增产物的电泳结果
1：DNAmarker2～6：HPV16L1PCR产物7：阴性对照
Fig.1PCRproductswithprimersfromHPV16L1vector
1:pBR322/BstN12～6:PCRproductsfromHPV16L1vector7:Negativecontrol
, 百拇医药 2.2重组质粒pGEM-L1的鉴定载体pGEM-T有1个SacⅠ酶切位点，无HindⅢ酶切位点；HPV16L1DNA的起始端含增设的HindⅢ酶切位点，无SacⅠ酶切位点。二者连接形成的重组质粒pGEM-L1经SacⅠ、HindⅢ双酶切后，正向克隆预计得到2973bp和1582bp的酶切片段，而反向克隆预计得到4500bp和55bp片段。电泳检测结果见图2。C为反向克隆，D为正向克隆。
图2重组质粒pGEM-L1的酶切分析
1：DNAmarker2：SacⅠ酶切后的pGEM-L13，4：SacⅠ和HindⅢ双酶切后的pGEM-L1
Fig.2RestricationenzymeanalysisofrecombinantplasmidpGEM-L1
1:pBR322/BstN12:pGEM-L1/SacⅠ3,4:pGEM-L1/sacⅠ+HindⅢ
, http://www.100md.com
2.3表达质粒pGEMEX-L1的鉴定表达载体pGEMEX-L1和目的基因HPV16L1DNA各含一个HindⅢ酶切位点。二者连接形成的重组质粒经HindⅢ酶切后，正向克隆预计得到4005bp和1563bp片段，反向克隆预计得到5568bp一条片段。正向克隆的酶切电泳检测结果见图3。
图3重组质粒pGEMEX-L1的酶切分析
1：DNAmarker2：HindⅢ酶切后的pGEMEX-L1
Fig.31:λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ2:pGEMEX-L1/HindⅢ
2.4诱导表达产物的Westernblottmg分析免疫显色结果见图4，由图4可见一条清晰的特异性反应条带出现，表明表达产物具有与相应抗血清发生反应的抗原性。
图4大肠杆菌中表达的pGEMEX-L1融合蛋白的Westernblot免疫检测结果
, http://www.100md.com
Fig.4Immunoblotanalysisofreactitityofanti-HPV16L1antibodiestopGEMEX-L1fusionproteininWesternblot
3讨论
L1蛋白是HPV的主要衣壳蛋白，具有在原核细胞及真核细胞中自我组装成病毒样颗粒的特性(VLP)。大量实验表明，HPVL1蛋白具有较强的免疫原性，能刺激机体产生中和抗体，在动物实验中可保护动物免受相应病毒的攻击[2～4]。另外，L1蛋白还具有增强机体细胞免疫应答的功能[5]，因此可作为研制HPV预防及治疗疫苗的理想靶抗原。
由于酶切位点的限制，国外构建的HPVL1基因重组体多是仅含L1墓因的部分序列，而且克隆的L1DNA片段不易于酶切释放。本研究利用PCR技术和T-A克隆法制备的HPV16L1基因重组体含有HPV16L1全长基因序列的95%，并可根据需要选择不同的酶切位点释放目的基因，因此对于相关实验研究具有较大应用价值。
, 百拇医药
原核细胞表达系统具有操作简便、快速、高效表达及表达产物易于纯化等特点。实验表明，本研究克隆的HPV16L1DNA在大肠杆菌中得到了有效表达，表达产物可与相应抗血清发生阳性反应。这一实验结果为制备HPV感染的诊断试剂盒及进行肿瘤疫苗研制打下了基础。
基金项目：国家自然科学基金资助课题(39670038) 山东省自然科学基金资助课题
参考文献： [1]Lonincz ATR, et al. Human papillomavirus infection of the cevix:relative risk association of 15 common angenital types [J]. Obstet Gynecol,1992,79:328
[2]Jarrett WF, et al. Studies on vaccination aganist papillomavirus: prophylactic and therapeutic vaccination with recombinant structural proteins[J]. J Virol,1994,184:33
, http://www.100md.com
[3]Chistensen ND, et al. Assembled baculovirus-expressed human papillomavirus type 11 L1 capsid protein virus-like particles are recognized by neutralizing monoclonal antibodies and induce high titers of neutralizing antibodies[J]. J Gen Virol, 1994,75:2271
[4]Hagensce ME, et al. Immunization of mice with HPV vaccina virus recombinants generates serum IgG, IgM and muco sal IgA antibodies[J].J Virol,1995,206:174
[5]Dupuy C, et al. Cell mediated immunity induced in mice by human papillomavirus 16 L1 virus-like particles[J]. Microb Pathol,1997,22:219
收稿日期：1999-05-20, 百拇医药