丙氧鸟苷诱导转单纯疱疹病毒胸苷激酶基因人肺腺癌细胞A549凋亡研究
作者：何祥梁生 蒋小忠 郭先健 钱桂
单位：何祥梁 蒋小忠(第一军医大学珠江医院呼吸科， 广东 广州 510282)；郭先健 钱桂生(第三军医大学新桥医院呼吸研究所， 重庆 400037)
关键词：肺肿瘤；基因疗法；鸟苷
中国病理生理杂志001011
[摘 要] 目的：观察丙氧鸟苷(GCV)对A549-TK细胞的作用与诱导细胞凋亡的关系。方法：A549-TK、A549两种细胞经50 μmol/L GCV作用3～5 d后，用电镜、流式细胞仪、细胞凋亡原位检测法(Tunel)观察细胞凋亡。结果：电镜下发现A549-TK细胞有凋亡特征：如凋亡小体、半月征、核浓缩，流式细胞仪发现A549-TK细胞有亚G0G1峰，凋亡细胞占12.21%±1.66%，而A549细胞无G0G1峰，凋亡细胞占1.32%±0.25%,两者比较P<0.01。Tunel表明A549-TK、A549两种细胞凋亡发生率分别为16%±1.67%，2.5%±0.36%，两者比较P<0.01。结论：GCV诱导A549-TK细胞凋亡。
, 百拇医药
[中图分类号] 734.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)10-0912-03
[MeSH] Lung neoplasms; Gene therapy; Guanosine
单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因(herpes simplex virus-I thymine kinase gene, HSV1-TK)是一个药敏基因，即转导该基因的细胞对抗病毒药物丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)敏感，能被其杀灭，有关其杀灭瘤细胞的机理，目前认为与诱导细胞凋亡有关。本研究运用电镜、流式细胞仪(fow cell meter, FCM)、未端脱氧核苷酸转移酶介导的去氧三磷酸尿苷(deoxynu triphosphate urine, dUTP)缺口未端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)观察转HSV1-TK基因的肺癌细胞经GCV作用后诱导细胞凋亡情况，从而阐明TK/GCV系统杀灭肿瘤细胞的机制。
, 百拇医药
材 料 和 方 法
一、主要材料
人肺腺癌细胞A549购自上海细胞所，转TK 基因人肺腺癌细胞A549(简称A549-TK)由作者本人构建了含TK基因的逆转录病毒表达载体后，用电穿孔法转化、筛选、保存[1]。GCV购自瑞士Reche公司，细胞凋亡原位检测试剂盒(宝曼公司)，RPMI1640购自Gibco公司。
二、电镜观察
A549-TK、A549两种对数生长中期培养细胞各2瓶，用含50 μmol/L GCV的RPMI1640培养基培养4 d,常规消化细胞，用PBS洗两遍，离心留细胞沉淀，取部分细胞加入戌二醛固定置4℃ 8 h,1% 0S04再固定,环氧树脂Epon812包埋,Reichrt-Tung.E型超薄切片机切片。枸橼酸铅电子染色，Phillip EM型电镜观察。
, 百拇医药
三、FCM检测
取部分细胞沉淀用PBS重悬细胞，调细胞浓度为106/mL,70%乙醇固定。碘化丙淀(propidium iodide, PI)对细胞进行荧光染色，经180目尼龙网过滤，用FACS400型流式细胞仪测定每个细胞的荧光强度。细胞经微机用细胞周期分析软件COTF1T分析求出。
四、Tunel法检测细胞凋亡
以上两种细胞粘到玻片上，用4%多聚甲醛固定10 min，然后用PBS洗两遍，按宝曼公司提供的细胞凋亡原位检测试剂盒说明书操作。
结 果
一、 扫描电镜观察结果表明A549-TK细胞有明显凋亡特征，如细胞核皱缩，核呈半月征、凋亡小体形成见图1、图2。
, 百拇医药
Fig 1 A549-TK cells were treated by GCV Nuclear showed semimoon feature,Apoptotic body formed, Marked by arrows (×10000)
图1 A549-TK细胞经GCV作用后电镜观察，示核呈半月征，凋亡小体形成，如箭头所示
Fig 2 A549-TK cells were treated by GCV showing nuclearcondensation(×4000)
图2 A549-TK细胞经GCV作用后的电镜观察示核浓缩
二、FCM检测 A549-TK、A549两种细胞周期结果 从表1中可以看出A549-TK、A549两种细胞亚G0G1期(即由凋亡细胞形成分别占12.21%±1.66%，1.32%±0.25%，两者比较P<0.01。
, 百拇医药
表1 A549-TK、A549两种细胞经50 μmol/L GCV
作用后细胞周期改变
Tab 1 The cycle change of A549-TK and A549 cells treated
by 50μmol/L GCV (
±s) Cellular cycle
Square figure
A549
A549-TK
G0G1 phase
, 百拇医药
M1
1.32±0.25
12.21±1.66
G0G1 phase
M2
34.92±2.89
41.12±3.78
S phase
M3
37.46±3.01
14.34±1.12
, 百拇医药 G2+M phase
M4
26.08±2.31
32.76±3.01
二、 细胞凋亡原位未端标记法(Tunel),细胞发生凋亡时，染色体DNA在核小体间发生断裂形成以核小体为单位的不同长度的DNA片段，同时产生多个3-OH末端，使用末端转移酶可将标记的去氧三磷酸尿苷连接在DNA片段的3-OH末端上进行显示，从而显示凋亡细胞。结果表明A549-TK、A549两种细胞显示的棕色细胞比例分别为16%±1.67%，2.5%±0.36%，两者比较P<0.01，见图3。讨 论
HSV1-TK基因是自杀基因中研究得最多的一个，有关其杀灭肿瘤细胞的机理目前仍不太清楚，主要包括TK酶的作用和旁观者效应(即约10%左右的TK+细胞与90%TK-细胞混合，GCV能杀灭绝大部分细胞)。而后者又与细胞凋亡吞噬及免疫反应有关。有人观察到当TK+的纤维肉瘤细胞株KBALB与TK-的细胞混合经GCV作用后，流式细胞仪和电镜分析表明TK+细胞死亡时产生的凋亡小体被近TK-的细胞吞噬，导致TK-细胞死亡，阻止凋亡小体转移可以防止旁观者效应发生[2].若将凋亡抑制基因BcL2导入3T3细胞后观察到表达BcL2的细胞不易被TK/GCV杀灭，因而间接地说明了旁观者效应的发生与凋亡有关[3]。转TK基因细胞经GCV作用后显微镜下见细胞皱缩，染色体凝集，囊泡形成，即出现明显凋亡特征[4.5]。细胞凋亡是细胞死亡时一种病理形态学特征变化，与细胞坏死有明显不同，它是由凋亡相关基因调控的主动程序性死亡，已知有许多基因与细胞凋亡有关，如P53、P21、P27、P16、Bax等凋亡基因和BcL2抗凋亡基因等等，其中P53、BcL2是研究得最多的凋亡相关基因。细胞凋亡时病理特征包括电镜下可见到凋亡细胞核聚集、浓缩、形成环绕核膜的半月征及染色质和细胞器崩解脱落形成凋亡小体，还有细胞DNA电泳时出观相差180 bp左右阶梯现象，本研究运用电镜，FCM、Tunel法均检测到转基因细胞50 μmol/LGCV作用后均出现了相应的凋亡特征变化，如电镜发现了凋亡小体，核呈半月征，核浓缩等，而对照细胞无这些改变，FCM也发现转TK基因细胞G0G1期细胞比例明显高于对照细胞。Tunel法是近年开展的一种检测细胞凋亡早期变化的灵敏方法，由于细胞凋亡时染色体DNA断裂形成许多缺口，利用未端脱氧核苷转移酶将dUTP连接到缺口上，并进行显色，从而呈现凋亡细胞。我们应用该法同样发现转TK基因细胞经GCV作用后凋亡细胞出现率明显高于对照细胞(P<0.01),以上3种方法均提示TK/GCV杀灭肿瘤细胞与诱导细胞凋亡有关。
, 百拇医药
Fig 3 Tunel method examined A549-TK apoptic cell,brown cells showed apoptosis(×200)
图3 A549-TK细胞原位未端标记法检测凋亡细胞，棕色细胞表示凋亡细胞
[参 考 文 献]
[1] 何祥梁，郭先健，黄桂君.HSV1-TK基因转导人肺腺
癌细胞A549体内外表达研究[J].第三军医大学学报，1999，21(6)：375-377.
[2] Wolfgang Hamel, Lucia Magnsll,Vincenzo P, et al.HSV1-TK/GCV mediatedapoptotic death of bystander cells[J]. Cancer Res,1996,56(15):2679-2683.
, 百拇医药
[3] Freeman M, Abound.CN,Whartenby KA, et al. The “bystander effect” tumor regression when a fraction of the tumor mass is geneticallg modified[J]. Cancer Res,1993，53(20): 5274-5280.
[4] Shigek Kariyama,Toshiya Nakatani,Kazhiro Masni, et al. By Stanber effect caused by suicide gene expression indicates the feasibility of gene therapy for hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology,1995,22(11):1838-1844.
[5] Yujo Kawashita,Akira Ohtsuru,Yasafami Kaned, et al. Regression of hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo by radiosen sitizing saicide gene therapy under the inducible and spatial control of radiation[J]. Hum Gene Ther,1999,10(7):1509-1519.
[收稿日期] 1999-12-24
[修回日期] 2000-04-12, http://www.100md.com
单位：何祥梁 蒋小忠(第一军医大学珠江医院呼吸科， 广东 广州 510282)；郭先健 钱桂生(第三军医大学新桥医院呼吸研究所， 重庆 400037)
关键词：肺肿瘤；基因疗法；鸟苷
中国病理生理杂志001011
[摘 要] 目的：观察丙氧鸟苷(GCV)对A549-TK细胞的作用与诱导细胞凋亡的关系。方法：A549-TK、A549两种细胞经50 μmol/L GCV作用3～5 d后，用电镜、流式细胞仪、细胞凋亡原位检测法(Tunel)观察细胞凋亡。结果：电镜下发现A549-TK细胞有凋亡特征：如凋亡小体、半月征、核浓缩，流式细胞仪发现A549-TK细胞有亚G0G1峰，凋亡细胞占12.21%±1.66%，而A549细胞无G0G1峰，凋亡细胞占1.32%±0.25%,两者比较P<0.01。Tunel表明A549-TK、A549两种细胞凋亡发生率分别为16%±1.67%，2.5%±0.36%，两者比较P<0.01。结论：GCV诱导A549-TK细胞凋亡。
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[中图分类号] 734.2 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)10-0912-03
[MeSH] Lung neoplasms; Gene therapy; Guanosine
单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因(herpes simplex virus-I thymine kinase gene, HSV1-TK)是一个药敏基因，即转导该基因的细胞对抗病毒药物丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)敏感，能被其杀灭，有关其杀灭瘤细胞的机理，目前认为与诱导细胞凋亡有关。本研究运用电镜、流式细胞仪(fow cell meter, FCM)、未端脱氧核苷酸转移酶介导的去氧三磷酸尿苷(deoxynu triphosphate urine, dUTP)缺口未端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)观察转HSV1-TK基因的肺癌细胞经GCV作用后诱导细胞凋亡情况，从而阐明TK/GCV系统杀灭肿瘤细胞的机制。
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材 料 和 方 法
一、主要材料
人肺腺癌细胞A549购自上海细胞所，转TK 基因人肺腺癌细胞A549(简称A549-TK)由作者本人构建了含TK基因的逆转录病毒表达载体后，用电穿孔法转化、筛选、保存[1]。GCV购自瑞士Reche公司，细胞凋亡原位检测试剂盒(宝曼公司)，RPMI1640购自Gibco公司。
二、电镜观察
A549-TK、A549两种对数生长中期培养细胞各2瓶，用含50 μmol/L GCV的RPMI1640培养基培养4 d,常规消化细胞，用PBS洗两遍，离心留细胞沉淀，取部分细胞加入戌二醛固定置4℃ 8 h,1% 0S04再固定,环氧树脂Epon812包埋,Reichrt-Tung.E型超薄切片机切片。枸橼酸铅电子染色，Phillip EM型电镜观察。
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三、FCM检测
取部分细胞沉淀用PBS重悬细胞，调细胞浓度为106/mL,70%乙醇固定。碘化丙淀(propidium iodide, PI)对细胞进行荧光染色，经180目尼龙网过滤，用FACS400型流式细胞仪测定每个细胞的荧光强度。细胞经微机用细胞周期分析软件COTF1T分析求出。
四、Tunel法检测细胞凋亡
以上两种细胞粘到玻片上，用4%多聚甲醛固定10 min，然后用PBS洗两遍，按宝曼公司提供的细胞凋亡原位检测试剂盒说明书操作。
结 果
一、 扫描电镜观察结果表明A549-TK细胞有明显凋亡特征，如细胞核皱缩，核呈半月征、凋亡小体形成见图1、图2。
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Fig 1 A549-TK cells were treated by GCV Nuclear showed semimoon feature,Apoptotic body formed, Marked by arrows (×10000)
图1 A549-TK细胞经GCV作用后电镜观察，示核呈半月征，凋亡小体形成，如箭头所示
Fig 2 A549-TK cells were treated by GCV showing nuclearcondensation(×4000)
图2 A549-TK细胞经GCV作用后的电镜观察示核浓缩
二、FCM检测 A549-TK、A549两种细胞周期结果 从表1中可以看出A549-TK、A549两种细胞亚G0G1期(即由凋亡细胞形成分别占12.21%±1.66%，1.32%±0.25%，两者比较P<0.01。
, 百拇医药
表1 A549-TK、A549两种细胞经50 μmol/L GCV
作用后细胞周期改变
Tab 1 The cycle change of A549-TK and A549 cells treated
by 50μmol/L GCV (
±s) Cellular cycleSquare figure
A549
A549-TK
G0G1 phase
, 百拇医药
M1
1.32±0.25
12.21±1.66
G0G1 phase
M2
34.92±2.89
41.12±3.78
S phase
M3
37.46±3.01
14.34±1.12
, 百拇医药 G2+M phase
M4
26.08±2.31
32.76±3.01
二、 细胞凋亡原位未端标记法(Tunel),细胞发生凋亡时，染色体DNA在核小体间发生断裂形成以核小体为单位的不同长度的DNA片段，同时产生多个3-OH末端，使用末端转移酶可将标记的去氧三磷酸尿苷连接在DNA片段的3-OH末端上进行显示，从而显示凋亡细胞。结果表明A549-TK、A549两种细胞显示的棕色细胞比例分别为16%±1.67%，2.5%±0.36%，两者比较P<0.01，见图3。讨 论
HSV1-TK基因是自杀基因中研究得最多的一个，有关其杀灭肿瘤细胞的机理目前仍不太清楚，主要包括TK酶的作用和旁观者效应(即约10%左右的TK+细胞与90%TK-细胞混合，GCV能杀灭绝大部分细胞)。而后者又与细胞凋亡吞噬及免疫反应有关。有人观察到当TK+的纤维肉瘤细胞株KBALB与TK-的细胞混合经GCV作用后，流式细胞仪和电镜分析表明TK+细胞死亡时产生的凋亡小体被近TK-的细胞吞噬，导致TK-细胞死亡，阻止凋亡小体转移可以防止旁观者效应发生[2].若将凋亡抑制基因BcL2导入3T3细胞后观察到表达BcL2的细胞不易被TK/GCV杀灭，因而间接地说明了旁观者效应的发生与凋亡有关[3]。转TK基因细胞经GCV作用后显微镜下见细胞皱缩，染色体凝集，囊泡形成，即出现明显凋亡特征[4.5]。细胞凋亡是细胞死亡时一种病理形态学特征变化，与细胞坏死有明显不同，它是由凋亡相关基因调控的主动程序性死亡，已知有许多基因与细胞凋亡有关，如P53、P21、P27、P16、Bax等凋亡基因和BcL2抗凋亡基因等等，其中P53、BcL2是研究得最多的凋亡相关基因。细胞凋亡时病理特征包括电镜下可见到凋亡细胞核聚集、浓缩、形成环绕核膜的半月征及染色质和细胞器崩解脱落形成凋亡小体，还有细胞DNA电泳时出观相差180 bp左右阶梯现象，本研究运用电镜，FCM、Tunel法均检测到转基因细胞50 μmol/LGCV作用后均出现了相应的凋亡特征变化，如电镜发现了凋亡小体，核呈半月征，核浓缩等，而对照细胞无这些改变，FCM也发现转TK基因细胞G0G1期细胞比例明显高于对照细胞。Tunel法是近年开展的一种检测细胞凋亡早期变化的灵敏方法，由于细胞凋亡时染色体DNA断裂形成许多缺口，利用未端脱氧核苷转移酶将dUTP连接到缺口上，并进行显色，从而呈现凋亡细胞。我们应用该法同样发现转TK基因细胞经GCV作用后凋亡细胞出现率明显高于对照细胞(P<0.01),以上3种方法均提示TK/GCV杀灭肿瘤细胞与诱导细胞凋亡有关。
, 百拇医药
Fig 3 Tunel method examined A549-TK apoptic cell,brown cells showed apoptosis(×200)
图3 A549-TK细胞原位未端标记法检测凋亡细胞，棕色细胞表示凋亡细胞
[参 考 文 献]
[1] 何祥梁，郭先健，黄桂君.HSV1-TK基因转导人肺腺
癌细胞A549体内外表达研究[J].第三军医大学学报，1999，21(6)：375-377.
[2] Wolfgang Hamel, Lucia Magnsll,Vincenzo P, et al.HSV1-TK/GCV mediatedapoptotic death of bystander cells[J]. Cancer Res,1996,56(15):2679-2683.
, 百拇医药
[3] Freeman M, Abound.CN,Whartenby KA, et al. The “bystander effect” tumor regression when a fraction of the tumor mass is geneticallg modified[J]. Cancer Res,1993，53(20): 5274-5280.
[4] Shigek Kariyama,Toshiya Nakatani,Kazhiro Masni, et al. By Stanber effect caused by suicide gene expression indicates the feasibility of gene therapy for hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology,1995,22(11):1838-1844.
[5] Yujo Kawashita,Akira Ohtsuru,Yasafami Kaned, et al. Regression of hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo by radiosen sitizing saicide gene therapy under the inducible and spatial control of radiation[J]. Hum Gene Ther,1999,10(7):1509-1519.
[收稿日期] 1999-12-24
[修回日期] 2000-04-12, http://www.100md.com