β-胡萝卜素和维生素C对Ni2O3诱导人肺成纤维细胞转化的保护作用
作者：张敬 刘艺敏 张军 祝寿嵩 蔡梅雪
单位：张军(同济大学医学院生物学教研室)；张敬 刘艺敏 祝寿嵩 蔡梅雪(同济大学医学院，上海 200070)
关键词：镍；硒；维生素C；人肺成纤维细胞；β-胡萝卜素
卫生研究000415 摘要：为了探讨三氧化二镍(Ni2O3)诱导人肺成纤维(HLF)细胞恶性转化作用以及β-胡萝卜素和维生素C的保护作用，用不同浓度的Ni2O3在体外多次处理HLF细胞，利用刀豆凝集素A(ConA)凝集实验和软琼脂集落形成实验进行转化细胞的恶性鉴定；同时添加β-胡萝卜素(5.4mg/L)和维生素C的食物(1.8mg/L)，观察对Ni2O3转化作用的影响。结果表明Ni2O3(0.5～2.0mg/L)可诱导HLF恶性转化，转化细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，呈交叉重叠生长，转化率呈剂量-效应关系。转化细胞可被低浓度ConA凝集，并在软琼脂内生长。添加β-胡萝卜素和维生素C的处理组比单用Ni2O3组的转化率显著下降(P<0.05)，处理后细胞ConA凝集反应阴性，不能在软琼脂内生长。结论认为Ni2O3有较强的诱导HLF细胞恶性转化的能力，具有致癌性。β-胡萝卜素和维生素C对于镍诱导HLF恶性转化具有保护作用，提示职业接触镍的人群有必要在膳食中增加富含β-胡萝卜素和维生素C，以提高机体的抗氧化能力，从而提高机体的抗肿瘤能力。
, 百拇医药
中图分类号：Q56 R734.2 R135.1 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0237-03
Protection of β-carotene and vitamin C on the transformation
of human lung fibroblasts cell induced by nickel sesquioxide
Zhang Jing, Liu Yimin, Zhang Jun, Zhu Shousong, et al.
(Medical College, Tongji University, Shanghai 200070, China)
, 百拇医药
Abstract：In order to study the protection of β-carotene and vitamin C against the transformation of human lung fibroblasts(HLF) cell induced by nickel sesquioxide, HLF cells were treated repeatedly by different concentrations of Ni2O3 in vitro. β-carotene (5.4mg/L) and vitamin C(1.8mg/L) were added into the media containing Ni2O3 (1.0mg/L) respectively. The identification of malignancy of the transformation of HLF cell was carried out by the tests of ConA and the growth on semisolid agar culture. The results showed that Ni2O3 could induce the malignant transformation of HLF cell. The transformed cell proliferated rapidly. The transformed colonies exhibited in extensively random orientation and the cells were crossing-over. The frequency of transformation showed a dose-response relation at the experimental concentrations. The transformed cell could be agglutinated by lower concentration of ConA and could grow in semisolid agar. The frequencies of transformation of HLF cell exposed to β-carotene and vitamin C were decreased significantly. The cells could not be agglutinated by ConA and not grow in semisolid agar. It was concluded that Ni2O3 could induce strongly the malignant transformation of HLF cell and might be carcinogenic to human. The protection of β-carotene and vitamin C on the transformation of HLF cell induced by Ni2O3 was observed. The increase of foods riched in β-carotene and vitamin C was suggested for workers exposed to nickel.
, 百拇医药
Key words:nickel, selenium, vitamin C, human lung fibroblasts cell, β-carotene
镍是人类在职业和环境中广泛接触的一种金属。镍化合物可以引起镍冶炼工人的鼻癌和肺癌。国际癌症研究中心(IARC)1987年将镍及其化合物列为第一类致癌物[1]。其致癌机理之一是被吞噬的镍在细胞内产生活性氧，间接引起癌症[2]。β-胡萝卜素(β-C)和维生素C(VC)是抗氧化剂，保护机体免受自由基的损害。近年来的研究表明，细胞转化实验是研究化学致癌物的一种常用而有效的体外诱癌性模型，是短期生物遗传毒性检测中信度最高的一种[3]。本实验首先观察三氧化二镍(Ni2O3)诱导人肺成纤维(HLF)细胞的恶性转化作用，同时观察了β-胡萝卜素和维生素C在Ni2O3诱导细胞转化中的保护作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细胞培养
人肺成纤维(HLF)细胞由中科院上海细胞所细胞库提供。用RPMI 1640培养基常规培养。
1.2 受试物
将Ni2O3研磨成细粉，用三蒸水配成系列浓度，高压消毒。试验细胞接触的终浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0mg/L。阳性对照为苯并(a)芘[B(a)p]，终浓度为0.01mg/L。β-胡萝卜素为5.4mg/L，VC为1.8mg/L。用三蒸水作为阴性对照。
1.3 细胞毒性实验
接种500个细胞/3ml培养液于25ml培养瓶中，培养24小时后，加入不同浓度受试物，每个剂量5个平行样。再培养24小时，细胞用D-Hanks液洗2次，加入新鲜培养液培养6天。用甲醇固定细胞，Giemsa染色，计数形成的克隆数，并计算绝对克隆率(CFE)和相对克隆率(RCE)[4]。
, 百拇医药
CFE(%)=(克隆数/接种细胞数)×100
RCE(%)=(处理组的CFE/阴性对照组CFE)×100
1.4 细胞转化实验
按5×104个细胞/20 cm2培养瓶接种，细胞处于对数生长期时，加入受试物培养24小时后倾去处理液；用D-Hanks液洗2次，加入新鲜培养液继续培养24小时；消化细胞，将半数细胞加入培养液继续培养；按上述方法连续处理4次。终止处理后，继续传代3次。用甲醇固定细胞，Giemsa染色，计数转化灶，求出转化率(TF)[4]。
TF(%)=(细胞转化灶数/克隆数)×100
1.5 刀豆凝集素A(Con A)凝集实验
, 百拇医药
将受试物转化细胞和阴性对照组细胞配成5×104细胞悬液，各组取2滴细胞悬液和ConA溶液(200、100、50、25和0mg/L)于24孔板内充分混匀，室温镜下观察凝集现象，持续30min，并记录细胞开始发生凝集的时间。
1.6 软琼脂集落形成实验
底层培养基制备：1.2%琼脂和2×1640(含20%胎牛血清和2倍“三抗”)等体积混匀，取3ml加入直径6cm平皿中，冷却后置于37℃、5%CO2培养箱中过夜。
顶层琼脂制备：0.7%琼脂与等体积2×1640混匀，以3ml分装试管中，再向管中加入0.2ml计数约1000个细胞的悬液，充分混匀后，注入上述底层平皿中。待上层琼脂凝固后，置入37℃、5%CO2培养箱中，培养10～14天，在倒置显微镜下观察细胞集落生成情况，并计数。
, 百拇医药
2 结果
2.1 Ni2O3对人肺成纤维细胞的毒性
Ni2O3对人肺成纤维细胞的毒性及成活情况见表1，可见绝对克隆率(CFE)和相对克隆率(RCE)随浓度增加而降低，呈剂量-效应关系。当Ni2O3浓度低于2.0mg/L时对细胞无明显毒性，浓度达10mg/L时，细胞克隆明显降低，呈现毒性效应。Ni2O3+β-C(1.0mg/L+5.4mg/L)、Ni2O3+VC(1.0mg/L+1.8mg/L)及B(a)p(0.01mg/L)对HLF细胞无毒性反应。
2.2 Ni2O3对HLF的转化作用及β-胡萝卜素和维生素C保护作用
, 百拇医药
选择Ni2O3浓度低于2.0mg/L作转化实验，由表2可见细胞转化率(TF)随浓度增高而增高。而Ni2O3+β-C和Ni2O3+VC组的TF较Ni2O3各组为低(P<0.05)，接近阴性对照组水平。阴性对照组及加β-C、VC组细胞呈单层生长，排列有序，具有良好的接触抑制。而Ni2O3和Bap诱导的转化细胞生长无方向性，生长速度加快，失去接触抑制，排列紊乱，呈交叉重叠生长(图1、图2)。
表1 Ni2O3对HLF细胞毒性效应 受试物
终浓度
(mg/L)
, http://www.100md.com 克隆数
/瓶
RCE
(%)
CFE
(%)
阴性对照
—
167
100.0
33.4
Ni2O3
0.25
, 百拇医药
159
95.2
31.8
0.50
153
91.6
30.6
1.00
148
88.6
29.6
2.00
136
, 百拇医药
81.4
27.2
5.00
95
56.9
19.1
10.00
40
24.0
8.0
Ni2O3+β-C
1.0+5.4
, 百拇医药
141
84.4
28.2
Ni2O3+VC
1.0+1.8
179
107.2
35.8
Bap
0.01
155
92.8
, 百拇医药
31.0
表2 Ni2O3对HLF细胞的转化作用及β-C和VC的保护作用 受试物
终浓度
(mg/L)
总转化
灶数
总瓶数
转化
灶/瓶
克隆
数/瓶
TF
, 百拇医药
(%)
阴性对照
—
0.04
5
0.20
167
0.12
Ni2O3
0.5
30
4
7.50
, http://www.100md.com
153
4.90
1.0
64
5
12.80
148
8.38
2.0
67
4
16.75
136
, http://www.100md.com
12.35
Ni2O3+β-C
1.0+5.4
1
4
0.25
141
0.18
Ni2O3+VC
1.0+1.8
8
5
, http://www.100md.com
1.60
179
0.89
Bap
0.01
44
5
8.80
155
5.68
图1 阴性对照组细胞(×250)
2.3 转化细胞对ConA凝集反应
, 百拇医药
由表3可见，转化细胞对ConA的凝集敏感性增强，随着ConA浓度增加，细胞凝集速度加快，肉眼可见沙粒状，镜下可见细胞凝集成团，而加β-C、VC组相应凝集时间延长甚至不发生凝集。阴性对照组和未加凝集素实验组细胞则分散均匀30min尚未出现凝集(图3、图4)。
2.4 Ni2O3对细胞软琼脂集落形成的影响
经Ni2O3和Bap处理后形成的转化细胞均能在软琼脂中形成细胞集落，而阴性对照组及加β-C、VC组细胞在软琼脂中不能生长。表明转化细胞已丧失生长贴壁依赖性，获得了某些恶性细胞的生物学特征。
图2 Ni2O3处理HLF细胞形成的转化灶(×250)
, http://www.100md.com
表3 正常和转化细胞对ConA的凝集反应时间min 受试物
C/mg.L-1
ConA (mg/L)
0
25
50
100
200
Ni2O3
0
>30
, 百拇医药
>30
>30
>30
>30
0.5
>30
18
16
12
9
1.0
>30
16
, 百拇医药 9
6
4
2.0
>30
16
9
5
4
Ni2O3+β-C
1.0+5.4
>30
>30
, 百拇医药
>30
>30
>30
Ni2O3+VC
1.0+1.8
>30
>30
>30
>30
>30
B(a)p
0.01
, http://www.100md.com >30
20
15
6
4
图3 无ConA凝集能力的细胞状态(×450)
图4 转化细胞对ConA的凝集状态(×250)
3 讨论
细胞转化实验在检测化学物质的致癌活性、研究肿瘤的发生和发展机制方面具有重要意义。本实验采用的人肺成纤维细胞具有二倍体性质，容易培养，对各种诱变剂耐受性强，自发转化率低，细胞发生转化后易识别，用于研究癌变机理不失为一种好的细胞[5]。细胞转化是细胞发生遗传性改变的一种变化，涉及DNA或基因的改变，是一个多因素、多阶段、多途径的过程。因而，无论用化学、物理、病毒和癌基因等处理正常人体细胞，经一次处理是难以发生恶性转化的。在本实验条件下，Ni2O3在0.5～2.0mg/L范围内，各组均可诱发HLF细胞恶性转化，转化率TF呈剂量-效应关系。转化后的细胞失去接触抑制，细胞呈现交叉重叠生长，细胞膜表面ConA受体数明显增多，凝集时间明显缩短。软琼脂培养显示，转化细胞呈现出贴壁不依赖性生长(AI)状态，非转化细胞在软琼脂中不生长。而AI表型在人体细胞恶性转化中为较早阶段的改变，为恶性转化所必需。
, 百拇医药
Sunderman认为镍诱发的脂质过氧化作用(LPO)可能是镍及其化合物的毒作用及致癌机制之一[6]。被吞噬入细胞内的Ni(Ⅱ)可同寡肽结合，主要以Ni(Ⅱ)GlyGlyHis复合物形式，通过Haber-Weiss反应和Fenton/Haber-Weiss反应生成羟基自由基而引起细胞内的一系列损伤。被细胞吞噬的Ni(Ⅱ)还可与Mg2+竞争DNA复制酶、DNA修复酶上的结合位点，导致错误的遗传信息增加，引起细胞恶性转化[7]。β-胡萝卜素是抗氧化物，是氧的清除剂，能淬灭
。VC是一种广谱的抗氧化物，形成血浆中的第一道抗氧化防线。二者皆可保护细胞免遭脂质过氧化的损坏。本实验观察Ni2O3诱导HLF转化过程中添加β-C和VC的效果。结果显示加入β-C和VC处理的细胞与Ni2O3组相比转化率TF明显下降(P<0.05)，ConA凝集时间延长达正常细胞水平，且处理后的细胞不能在软琼脂培养基上生长。表明β-C和VC在Ni2O3诱导HLF转化过程中起保护作用。该作用可能与它们的抗氧化作用有关。因此对职业接触镍的人群有必要在膳食中增加β-C和VC的摄入量，以提高机体抗氧化能力，从而提高机体的抗肿瘤能力。
, 百拇医药
基金项目：铁道部科技基金资助项目(No.J96Z093)
作者简介：张敬，女，硕士，讲师
参考文献
1，WHO， International Agency for Research on Cancer. IARC monographs on the evalluation of carcinogenic rish to humans, overall evalluation of carcinogencity:an updating of IARC monographs. Volumes 1 to 42. Supplement 7. Lyon:IARC,1987
2，Kawanishi S, Inoue S, Yamanoto K. Active oxygen species in DNA damage induced by carcinogenic metal compounds. Environ Health Perspect,1994,21:367
, http://www.100md.com
3，沈建英.致癌物鉴定方法的现状及展望.中国公共卫生学报，1996，15(6)：35
4，Dunkel VC, Rogers C, Swierenga SH, et al. Recommended protocols based on a survey of current practice in genotoxicity testing laboratories:cell transformation in C3H/10T1/2 mouse embryo cell, BALB/C 3T3 mouse fibroblast and syrian hamster embryo cell cultures. Muta Res,1991，246:285
5，鄂征.组织培养技术.第2版.北京：人民卫生出版社，1993
6，Sunderman FW. Metal and lipid peroxidation. Acta Pharmacol Toxicol Copenh，1986,59(Suppl Ⅶ):248
7，周晓.镍化合物的致癌机制.国外医学卫生学分册，1996，23(3)：129
(2000-01-12收稿), http://www.100md.com
单位：张军(同济大学医学院生物学教研室)；张敬 刘艺敏 祝寿嵩 蔡梅雪(同济大学医学院，上海 200070)
关键词：镍；硒；维生素C；人肺成纤维细胞；β-胡萝卜素
卫生研究000415 摘要：为了探讨三氧化二镍(Ni2O3)诱导人肺成纤维(HLF)细胞恶性转化作用以及β-胡萝卜素和维生素C的保护作用，用不同浓度的Ni2O3在体外多次处理HLF细胞，利用刀豆凝集素A(ConA)凝集实验和软琼脂集落形成实验进行转化细胞的恶性鉴定；同时添加β-胡萝卜素(5.4mg/L)和维生素C的食物(1.8mg/L)，观察对Ni2O3转化作用的影响。结果表明Ni2O3(0.5～2.0mg/L)可诱导HLF恶性转化，转化细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，呈交叉重叠生长，转化率呈剂量-效应关系。转化细胞可被低浓度ConA凝集，并在软琼脂内生长。添加β-胡萝卜素和维生素C的处理组比单用Ni2O3组的转化率显著下降(P<0.05)，处理后细胞ConA凝集反应阴性，不能在软琼脂内生长。结论认为Ni2O3有较强的诱导HLF细胞恶性转化的能力，具有致癌性。β-胡萝卜素和维生素C对于镍诱导HLF恶性转化具有保护作用，提示职业接触镍的人群有必要在膳食中增加富含β-胡萝卜素和维生素C，以提高机体的抗氧化能力，从而提高机体的抗肿瘤能力。
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中图分类号：Q56 R734.2 R135.1 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0237-03
Protection of β-carotene and vitamin C on the transformation
of human lung fibroblasts cell induced by nickel sesquioxide
Zhang Jing, Liu Yimin, Zhang Jun, Zhu Shousong, et al.
(Medical College, Tongji University, Shanghai 200070, China)
, 百拇医药
Abstract：In order to study the protection of β-carotene and vitamin C against the transformation of human lung fibroblasts(HLF) cell induced by nickel sesquioxide, HLF cells were treated repeatedly by different concentrations of Ni2O3 in vitro. β-carotene (5.4mg/L) and vitamin C(1.8mg/L) were added into the media containing Ni2O3 (1.0mg/L) respectively. The identification of malignancy of the transformation of HLF cell was carried out by the tests of ConA and the growth on semisolid agar culture. The results showed that Ni2O3 could induce the malignant transformation of HLF cell. The transformed cell proliferated rapidly. The transformed colonies exhibited in extensively random orientation and the cells were crossing-over. The frequency of transformation showed a dose-response relation at the experimental concentrations. The transformed cell could be agglutinated by lower concentration of ConA and could grow in semisolid agar. The frequencies of transformation of HLF cell exposed to β-carotene and vitamin C were decreased significantly. The cells could not be agglutinated by ConA and not grow in semisolid agar. It was concluded that Ni2O3 could induce strongly the malignant transformation of HLF cell and might be carcinogenic to human. The protection of β-carotene and vitamin C on the transformation of HLF cell induced by Ni2O3 was observed. The increase of foods riched in β-carotene and vitamin C was suggested for workers exposed to nickel.
, 百拇医药
Key words:nickel, selenium, vitamin C, human lung fibroblasts cell, β-carotene
镍是人类在职业和环境中广泛接触的一种金属。镍化合物可以引起镍冶炼工人的鼻癌和肺癌。国际癌症研究中心(IARC)1987年将镍及其化合物列为第一类致癌物[1]。其致癌机理之一是被吞噬的镍在细胞内产生活性氧，间接引起癌症[2]。β-胡萝卜素(β-C)和维生素C(VC)是抗氧化剂，保护机体免受自由基的损害。近年来的研究表明，细胞转化实验是研究化学致癌物的一种常用而有效的体外诱癌性模型，是短期生物遗传毒性检测中信度最高的一种[3]。本实验首先观察三氧化二镍(Ni2O3)诱导人肺成纤维(HLF)细胞的恶性转化作用，同时观察了β-胡萝卜素和维生素C在Ni2O3诱导细胞转化中的保护作用。
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1 材料和方法
1.1 细胞培养
人肺成纤维(HLF)细胞由中科院上海细胞所细胞库提供。用RPMI 1640培养基常规培养。
1.2 受试物
将Ni2O3研磨成细粉，用三蒸水配成系列浓度，高压消毒。试验细胞接触的终浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0mg/L。阳性对照为苯并(a)芘[B(a)p]，终浓度为0.01mg/L。β-胡萝卜素为5.4mg/L，VC为1.8mg/L。用三蒸水作为阴性对照。
1.3 细胞毒性实验
接种500个细胞/3ml培养液于25ml培养瓶中，培养24小时后，加入不同浓度受试物，每个剂量5个平行样。再培养24小时，细胞用D-Hanks液洗2次，加入新鲜培养液培养6天。用甲醇固定细胞，Giemsa染色，计数形成的克隆数，并计算绝对克隆率(CFE)和相对克隆率(RCE)[4]。
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CFE(%)=(克隆数/接种细胞数)×100
RCE(%)=(处理组的CFE/阴性对照组CFE)×100
1.4 细胞转化实验
按5×104个细胞/20 cm2培养瓶接种，细胞处于对数生长期时，加入受试物培养24小时后倾去处理液；用D-Hanks液洗2次，加入新鲜培养液继续培养24小时；消化细胞，将半数细胞加入培养液继续培养；按上述方法连续处理4次。终止处理后，继续传代3次。用甲醇固定细胞，Giemsa染色，计数转化灶，求出转化率(TF)[4]。
TF(%)=(细胞转化灶数/克隆数)×100
1.5 刀豆凝集素A(Con A)凝集实验
, 百拇医药
将受试物转化细胞和阴性对照组细胞配成5×104细胞悬液，各组取2滴细胞悬液和ConA溶液(200、100、50、25和0mg/L)于24孔板内充分混匀，室温镜下观察凝集现象，持续30min，并记录细胞开始发生凝集的时间。
1.6 软琼脂集落形成实验
底层培养基制备：1.2%琼脂和2×1640(含20%胎牛血清和2倍“三抗”)等体积混匀，取3ml加入直径6cm平皿中，冷却后置于37℃、5%CO2培养箱中过夜。
顶层琼脂制备：0.7%琼脂与等体积2×1640混匀，以3ml分装试管中，再向管中加入0.2ml计数约1000个细胞的悬液，充分混匀后，注入上述底层平皿中。待上层琼脂凝固后，置入37℃、5%CO2培养箱中，培养10～14天，在倒置显微镜下观察细胞集落生成情况，并计数。
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2 结果
2.1 Ni2O3对人肺成纤维细胞的毒性
Ni2O3对人肺成纤维细胞的毒性及成活情况见表1，可见绝对克隆率(CFE)和相对克隆率(RCE)随浓度增加而降低，呈剂量-效应关系。当Ni2O3浓度低于2.0mg/L时对细胞无明显毒性，浓度达10mg/L时，细胞克隆明显降低，呈现毒性效应。Ni2O3+β-C(1.0mg/L+5.4mg/L)、Ni2O3+VC(1.0mg/L+1.8mg/L)及B(a)p(0.01mg/L)对HLF细胞无毒性反应。
2.2 Ni2O3对HLF的转化作用及β-胡萝卜素和维生素C保护作用
, 百拇医药
选择Ni2O3浓度低于2.0mg/L作转化实验，由表2可见细胞转化率(TF)随浓度增高而增高。而Ni2O3+β-C和Ni2O3+VC组的TF较Ni2O3各组为低(P<0.05)，接近阴性对照组水平。阴性对照组及加β-C、VC组细胞呈单层生长，排列有序，具有良好的接触抑制。而Ni2O3和Bap诱导的转化细胞生长无方向性，生长速度加快，失去接触抑制，排列紊乱，呈交叉重叠生长(图1、图2)。
表1 Ni2O3对HLF细胞毒性效应 受试物
终浓度
(mg/L)
, http://www.100md.com 克隆数
/瓶
RCE
(%)
CFE
(%)
阴性对照
—
167
100.0
33.4
Ni2O3
0.25
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159
95.2
31.8
0.50
153
91.6
30.6
1.00
148
88.6
29.6
2.00
136
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81.4
27.2
5.00
95
56.9
19.1
10.00
40
24.0
8.0
Ni2O3+β-C
1.0+5.4
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141
84.4
28.2
Ni2O3+VC
1.0+1.8
179
107.2
35.8
Bap
0.01
155
92.8
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31.0
表2 Ni2O3对HLF细胞的转化作用及β-C和VC的保护作用 受试物
终浓度
(mg/L)
总转化
灶数
总瓶数
转化
灶/瓶
克隆
数/瓶
TF
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(%)
阴性对照
—
0.04
5
0.20
167
0.12
Ni2O3
0.5
30
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12.80
148
8.38
2.0
67
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16.75
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12.35
Ni2O3+β-C
1.0+5.4
1
4
0.25
141
0.18
Ni2O3+VC
1.0+1.8
8
5
, http://www.100md.com
1.60
179
0.89
Bap
0.01
44
5
8.80
155
5.68
图1 阴性对照组细胞(×250)
2.3 转化细胞对ConA凝集反应
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由表3可见，转化细胞对ConA的凝集敏感性增强，随着ConA浓度增加，细胞凝集速度加快，肉眼可见沙粒状，镜下可见细胞凝集成团，而加β-C、VC组相应凝集时间延长甚至不发生凝集。阴性对照组和未加凝集素实验组细胞则分散均匀30min尚未出现凝集(图3、图4)。
2.4 Ni2O3对细胞软琼脂集落形成的影响
经Ni2O3和Bap处理后形成的转化细胞均能在软琼脂中形成细胞集落，而阴性对照组及加β-C、VC组细胞在软琼脂中不能生长。表明转化细胞已丧失生长贴壁依赖性，获得了某些恶性细胞的生物学特征。
图2 Ni2O3处理HLF细胞形成的转化灶(×250)
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表3 正常和转化细胞对ConA的凝集反应时间min 受试物
C/mg.L-1
ConA (mg/L)
0
25
50
100
200
Ni2O3
0
>30
, 百拇医药
>30
>30
>30
>30
0.5
>30
18
16
12
9
1.0
>30
16
, 百拇医药 9
6
4
2.0
>30
16
9
5
4
Ni2O3+β-C
1.0+5.4
>30
>30
, 百拇医药
>30
>30
>30
Ni2O3+VC
1.0+1.8
>30
>30
>30
>30
>30
B(a)p
0.01
, http://www.100md.com >30
20
15
6
4
图3 无ConA凝集能力的细胞状态(×450)
图4 转化细胞对ConA的凝集状态(×250)
3 讨论
细胞转化实验在检测化学物质的致癌活性、研究肿瘤的发生和发展机制方面具有重要意义。本实验采用的人肺成纤维细胞具有二倍体性质，容易培养，对各种诱变剂耐受性强，自发转化率低，细胞发生转化后易识别，用于研究癌变机理不失为一种好的细胞[5]。细胞转化是细胞发生遗传性改变的一种变化，涉及DNA或基因的改变，是一个多因素、多阶段、多途径的过程。因而，无论用化学、物理、病毒和癌基因等处理正常人体细胞，经一次处理是难以发生恶性转化的。在本实验条件下，Ni2O3在0.5～2.0mg/L范围内，各组均可诱发HLF细胞恶性转化，转化率TF呈剂量-效应关系。转化后的细胞失去接触抑制，细胞呈现交叉重叠生长，细胞膜表面ConA受体数明显增多，凝集时间明显缩短。软琼脂培养显示，转化细胞呈现出贴壁不依赖性生长(AI)状态，非转化细胞在软琼脂中不生长。而AI表型在人体细胞恶性转化中为较早阶段的改变，为恶性转化所必需。
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Sunderman认为镍诱发的脂质过氧化作用(LPO)可能是镍及其化合物的毒作用及致癌机制之一[6]。被吞噬入细胞内的Ni(Ⅱ)可同寡肽结合，主要以Ni(Ⅱ)GlyGlyHis复合物形式，通过Haber-Weiss反应和Fenton/Haber-Weiss反应生成羟基自由基而引起细胞内的一系列损伤。被细胞吞噬的Ni(Ⅱ)还可与Mg2+竞争DNA复制酶、DNA修复酶上的结合位点，导致错误的遗传信息增加，引起细胞恶性转化[7]。β-胡萝卜素是抗氧化物，是氧的清除剂，能淬灭
。VC是一种广谱的抗氧化物，形成血浆中的第一道抗氧化防线。二者皆可保护细胞免遭脂质过氧化的损坏。本实验观察Ni2O3诱导HLF转化过程中添加β-C和VC的效果。结果显示加入β-C和VC处理的细胞与Ni2O3组相比转化率TF明显下降(P<0.05)，ConA凝集时间延长达正常细胞水平，且处理后的细胞不能在软琼脂培养基上生长。表明β-C和VC在Ni2O3诱导HLF转化过程中起保护作用。该作用可能与它们的抗氧化作用有关。因此对职业接触镍的人群有必要在膳食中增加β-C和VC的摄入量，以提高机体抗氧化能力，从而提高机体的抗肿瘤能力。, 百拇医药
基金项目：铁道部科技基金资助项目(No.J96Z093)
作者简介：张敬，女，硕士，讲师
参考文献
1，WHO， International Agency for Research on Cancer. IARC monographs on the evalluation of carcinogenic rish to humans, overall evalluation of carcinogencity:an updating of IARC monographs. Volumes 1 to 42. Supplement 7. Lyon:IARC,1987
2，Kawanishi S, Inoue S, Yamanoto K. Active oxygen species in DNA damage induced by carcinogenic metal compounds. Environ Health Perspect,1994,21:367
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3，沈建英.致癌物鉴定方法的现状及展望.中国公共卫生学报，1996，15(6)：35
4，Dunkel VC, Rogers C, Swierenga SH, et al. Recommended protocols based on a survey of current practice in genotoxicity testing laboratories:cell transformation in C3H/10T1/2 mouse embryo cell, BALB/C 3T3 mouse fibroblast and syrian hamster embryo cell cultures. Muta Res,1991，246:285
5，鄂征.组织培养技术.第2版.北京：人民卫生出版社，1993
6，Sunderman FW. Metal and lipid peroxidation. Acta Pharmacol Toxicol Copenh，1986,59(Suppl Ⅶ):248
7，周晓.镍化合物的致癌机制.国外医学卫生学分册，1996，23(3)：129
(2000-01-12收稿), http://www.100md.com