基因重组肿瘤坏死因子结合蛋白Ⅰ阻断肿瘤坏死因子诱导的脑微血管内皮细胞功能的改变
作者：李静 叶丽亚 赵武述 娄晋宁
单位：李静 叶丽亚 赵武述(100029 北京，中日友好医院临床医学研究所免疫室)；娄晋宁(瑞士日内瓦大学实验外科研究室)
关键词：
中华医学杂志000226 肿瘤坏死因子(TNF)需要与靶细胞高亲合力的特异性受体结合而起作用。目前，两种可溶性的TNFRⅠ和TNFRⅡ已经被基因重组并分别称为TNF结合蛋白(TNF binding protein, TBP)Ⅰ和Ⅱ。在实验动物中，重组的TBPⅠ可以减轻TNF毒性并降低动物死亡率[1]。然而，TBP Ⅰ对TNF的抑制作用在微血管内皮细胞的水平尚未作过系统研究。为此，我们对重组的TBP Ⅰ是否能够阻断TNF诱导的鼠脑微血管内皮细胞(MB-MVEC)表型和功能的改变进行了研究，并分析TBP Ⅰ的阻断效应与TBP Ⅰ/TNF的比率及时间的关系。
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一、材料和方法
1.MB-MVEC的分离和培养：脑的微血管内皮细胞从6～8周龄的BALB/c小鼠分离，其分离方法及鉴定参考文献[2]。本实验所使用的脑微血管内皮细胞培养3～5代。
2.MTT法分析TNF对MB-MVEC的细胞毒作用：以含10%胎牛血清的DMEM(DC∶10)或DC∶10含10 μg/ml TBP Ⅰ(瑞士Ares Sernon公司惠赠)溶液将重组的小鼠TNF(瑞士Bernard Allet, Glaxo IMB)在96孔板中稀释成不同浓度，然后加入含有10 μg/ml放线菌素D的MB-MVEC细胞悬液(5×105/ml)。于37℃ 5% CO2的条件下孵育20 h后，以MTT法测定细胞溶解的百分率。
3.ELISA检测IL-6的释放：用不同浓度的小鼠TNF，在存在或缺乏10 μg/ml的TBP Ⅰ的条件下刺激MB-MVEC，TBP Ⅰ分别在TNF刺激0、1、2、3、4 h后加入，然后于TNF刺激后的6 h收集上清液，测定IL-6的释放，ELISA试剂盒购自比利时Fleurus公司。
, 百拇医药
4.细胞ELISA法检测粘附分子的表达：MB-MVEC接种于2%明胶包被的96孔板中，培养至细胞汇合后，用DC∶10稀释成不同浓度的小鼠TNF，在存在或缺乏10 μg/ml的TBP Ⅰ的条件下刺激MB-MVEC。细胞分别被刺激不同时间(ICAM-Ⅰ和VCAM-Ⅰ 20 h，ELAM-Ⅰ 3 h)，然后用已描述的细胞ELISA法检测粘附分子的表达[3]。大鼠抗小鼠细胞间粘附分子1(ICAM-1)(YN1/1)，血管细胞粘附分子1(VCAM-1)(MK277)和内皮细胞粘附分子1(ELAM-1)(21KC10)单克隆抗体分别由加拿大Vancouver FT博士、德国Hamburg SR博士和德国Munstor DV博士赠送。过氧化物酶标记的羊抗大鼠IgG抗体购自美国Sigma公司。
5.统计学分析：用Student's t检验来评价2组间的差异。
二、结果
1.荧光激活的细胞分析仪(FACS)分析结果显示：MB-MVEC表达2种TNF受体p55和p75，并且2种TNF受体的荧光强度没有明显的差异。TNF可以特异性地杀伤TNF敏感的L929细胞，并且TBP Ⅰ可以明显地抑制TNF诱导的这种细胞毒作用，表明基因重组的TBP Ⅰ是有生物学活性的(结果未显示)。
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2.TBP Ⅰ抑制TNF对MB-MVEC的细胞毒作用：在存在放线菌素D的条件下，TNF可剂量依赖地杀伤MB-MVEC。加入10 μg/ml的TBP Ⅰ可明显地阻断TNF的细胞毒作用(图1)，并且这种抑制的效率与TBP Ⅰ/TNF比例呈正相关关系(表1)。
图1 TBP Ⅰ抑制TNF对MB-MVEC的细胞毒作用
3.TBP Ⅰ抑制TNF诱导的IL-6的释放：TNF以剂量依赖的方式诱导MB-MVEC释放IL-6，而在存在10 μg/ml TBP Ⅰ的同样条件下，IL-6的释放被明显抑制(图2)，这种抑制的程度取决于TBP Ⅰ/TNF的比率(表1)。TBP Ⅰ的抑制效果也
图2 TBP Ⅰ对不同TNF剂量诱导的MB-MVEC产生IL-6的影响
, 百拇医药
依赖于TNF刺激后TBP Ⅰ的给予时间。从图3可以看出，TBP Ⅰ的最大抑制效率是在与TNF同时加入时，在TNF刺激后4 h加入TBP Ⅰ不显示明显的抑制作用。
图3 不同TBP Ⅰ加入时间对TNF诱导的MB-MVEC产生IL-6的影响
4.TBP Ⅰ抑制TNF诱导的MB-MVEC粘附分子的表达：正常的MB-MVEC表达低水平的ICAM-1、VCAM-1及ELAM-1。在TNF刺激后，ICAM-1、VCAM-1及ELAM-1的表达明显增加，而且与TNF的浓度呈正相关。然而，在10 μg/ml TBP Ⅰ的情况下，TNF诱导的ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1的表达被明显抑制，与对照组比较差异有显著意义(P<0.05或0.01)(图4)。TBP Ⅰ抑制的程度依赖于TBP Ⅰ/TNF的比率(表1)。
, 百拇医药
注：与相同剂量的TNF对照相比，*P<0.05；**P<0.01
图4 TBP Ⅰ对TNF诱导的MB-MVEC粘附分子表达的影响
表1 TBP I对人和鼠的TNF抑制效应的比较(%) TBP Ⅰ/TNF
(wt/wt)
细胞毒
ICAM-1
IL-6
小鼠
人
小鼠
, 百拇医药
人
小鼠
人
100
86.3
-
51.9
-
64.8
13.6
300
91.1
-
, http://www.100md.com 67.5
-
75.0
26.0
1 000
97.9
-
77.3
27.6
84.0
31.4
3 000
98.0
, http://www.100md.com
76.2
81.6
38.1
86.1
66.9
三、讨论
体外及体内实验已经显示，可溶性的TNF受体具有抑制TNF的活性。生理情况下，血液中存在一定浓度的可溶性TNF受体，对防止过量的TNF所产生的病理作用起着缓冲作用。然而生理浓度的可溶性TNF受体对TNF的抑制效应是有限的。给予外源性基因重组的可溶性TNF受体，可能成为一种新的抗TNF治疗方法。本结果显示，基因重组的TBP Ⅰ可以在脑的微血管内皮细胞的水平阻断TNF的生物学作用，包括细胞毒作用和细胞因子的释放及粘附分子的表达。
虽然内皮细胞表达2种TNF受体，但TNF诱导的内皮细胞表型及功能的改变主要是通过TNF的受体Ⅰ介导[4]。TBP Ⅰ对TNF的抑制作用是剂量依赖的。TNF的生物活性形式是三聚体，而TNF的单体仅有极低或无生物活性，且易被降解。低浓度的TBP Ⅰ可以作为TNF的载体维持TNF三聚体的稳定性，从而延长其生物活性。另一方面，TBP Ⅰ需要与靶细胞的受体竞争结合TNF，因此，高浓度的TBP Ⅰ不仅能阻断TNF与靶细胞的结合，而且能够使已经结合的TNF从靶细胞上脱落下来。所以，TBP Ⅰ随浓度的不同可显示出不同的活性，低TBP Ⅰ/TNF比率可延长TNF的活性，而高TBP Ⅰ/TNF比率则抑制TNF的活性。到目前为止，抗TNF治疗仅在实验动物获得了良好的效果，而在人的疗效还相当有限。有趣的是，TBP Ⅰ对人和鼠的TNF表现出不同的抑制活性。在人脑的MVEC，TBP Ⅰ/TNF比率大于3 000，表现明显的抑制活性[3]，而在MB-MVEC，TBP Ⅰ/TNF比率大于100即可达到类似的抑制效果，表明TBP Ⅰ对鼠的TNF比人的TNF抑制效率大30倍。有人发现，TNFRⅡ是种属特异的，而TNFRⅠ是种属非特异的[5]。因此，鼠的TNF可能只结合到人的TNFRⅠ。另外，TBP Ⅰ的抑制作用在与TNF刺激后TBP加入的时间密切相关。从图3可以看出，TBP Ⅰ的最大抑制作用与TNF同时加入时。在TNF刺激2 h后加入TBP仍可明显地抑制TNF诱导的IL-6的产生，而在TNF刺激后4 h加入TBP Ⅰ，其对TNF的抑制作用几乎完全消失。这一结果强烈提示，TBP Ⅰ应在TNF升高的同时使用方能获得良好的抑制效果。这些实验数据为TBP Ⅰ的临床应用提供了实验依据。
, 百拇医药
以上结果显示，TBP Ⅰ可以抑制TNF诱导的脑MVEC的表型及功能变化。由于TNF诱导的脑MVEC的激活在CM和MS的病理过程中起关键性作用，因此，TBP Ⅰ对这些疾病的治疗有潜在的临床应用价值。
参考文献
[1]Ythier A, Gascon MP, Juillard P, et al. Protective effect of natural TNF-binding protein on human TNF-induced toxicity in mice. Cytokine, 1993,5：459-462.
[2]Lou L, Gasche Y, Zheng L, et al. Differential reactivity of brain microvascular endothelial cells to TNF reflects the genetic susceptibility to cerebral malaria. Eur J Immunol. 1998,28：3989-4000.
, http://www.100md.com
[3]Lou J, Ythier A, Burger D, et al. Modulation of soluble and membrane-bound TNF-induced phenotypic and functional changes of human brain microvascular endothelial cells by recombinant TNF binding protein I. J Neuroimmunol, 1997,77：107-115.
[4]Mackay F, Loetscher H, Stueber D, et al. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha): Induced cell adhesion to human endothelial cells is under dominant control of one TNF receptor type, TNF-R55. J Exp Med, 1993,177：1277-1286.
[5]Lewis M, Tartaglia LA, Lee A, et al. Cloning and expression of cDNAs for two distinct murine tumor necrosis factor receptors demonstrate one receptor is species specific. Proc Natl Acad Sci, 1991,88：2830-2840.
收稿日期：1998-12-10, 百拇医药
单位：李静 叶丽亚 赵武述(100029 北京，中日友好医院临床医学研究所免疫室)；娄晋宁(瑞士日内瓦大学实验外科研究室)
关键词：
中华医学杂志000226 肿瘤坏死因子(TNF)需要与靶细胞高亲合力的特异性受体结合而起作用。目前，两种可溶性的TNFRⅠ和TNFRⅡ已经被基因重组并分别称为TNF结合蛋白(TNF binding protein, TBP)Ⅰ和Ⅱ。在实验动物中，重组的TBPⅠ可以减轻TNF毒性并降低动物死亡率[1]。然而，TBP Ⅰ对TNF的抑制作用在微血管内皮细胞的水平尚未作过系统研究。为此，我们对重组的TBP Ⅰ是否能够阻断TNF诱导的鼠脑微血管内皮细胞(MB-MVEC)表型和功能的改变进行了研究，并分析TBP Ⅰ的阻断效应与TBP Ⅰ/TNF的比率及时间的关系。
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一、材料和方法
1.MB-MVEC的分离和培养：脑的微血管内皮细胞从6～8周龄的BALB/c小鼠分离，其分离方法及鉴定参考文献[2]。本实验所使用的脑微血管内皮细胞培养3～5代。
2.MTT法分析TNF对MB-MVEC的细胞毒作用：以含10%胎牛血清的DMEM(DC∶10)或DC∶10含10 μg/ml TBP Ⅰ(瑞士Ares Sernon公司惠赠)溶液将重组的小鼠TNF(瑞士Bernard Allet, Glaxo IMB)在96孔板中稀释成不同浓度，然后加入含有10 μg/ml放线菌素D的MB-MVEC细胞悬液(5×105/ml)。于37℃ 5% CO2的条件下孵育20 h后，以MTT法测定细胞溶解的百分率。
3.ELISA检测IL-6的释放：用不同浓度的小鼠TNF，在存在或缺乏10 μg/ml的TBP Ⅰ的条件下刺激MB-MVEC，TBP Ⅰ分别在TNF刺激0、1、2、3、4 h后加入，然后于TNF刺激后的6 h收集上清液，测定IL-6的释放，ELISA试剂盒购自比利时Fleurus公司。
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4.细胞ELISA法检测粘附分子的表达：MB-MVEC接种于2%明胶包被的96孔板中，培养至细胞汇合后，用DC∶10稀释成不同浓度的小鼠TNF，在存在或缺乏10 μg/ml的TBP Ⅰ的条件下刺激MB-MVEC。细胞分别被刺激不同时间(ICAM-Ⅰ和VCAM-Ⅰ 20 h，ELAM-Ⅰ 3 h)，然后用已描述的细胞ELISA法检测粘附分子的表达[3]。大鼠抗小鼠细胞间粘附分子1(ICAM-1)(YN1/1)，血管细胞粘附分子1(VCAM-1)(MK277)和内皮细胞粘附分子1(ELAM-1)(21KC10)单克隆抗体分别由加拿大Vancouver FT博士、德国Hamburg SR博士和德国Munstor DV博士赠送。过氧化物酶标记的羊抗大鼠IgG抗体购自美国Sigma公司。
5.统计学分析：用Student's t检验来评价2组间的差异。
二、结果
1.荧光激活的细胞分析仪(FACS)分析结果显示：MB-MVEC表达2种TNF受体p55和p75，并且2种TNF受体的荧光强度没有明显的差异。TNF可以特异性地杀伤TNF敏感的L929细胞，并且TBP Ⅰ可以明显地抑制TNF诱导的这种细胞毒作用，表明基因重组的TBP Ⅰ是有生物学活性的(结果未显示)。
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2.TBP Ⅰ抑制TNF对MB-MVEC的细胞毒作用：在存在放线菌素D的条件下，TNF可剂量依赖地杀伤MB-MVEC。加入10 μg/ml的TBP Ⅰ可明显地阻断TNF的细胞毒作用(图1)，并且这种抑制的效率与TBP Ⅰ/TNF比例呈正相关关系(表1)。
图1 TBP Ⅰ抑制TNF对MB-MVEC的细胞毒作用
3.TBP Ⅰ抑制TNF诱导的IL-6的释放：TNF以剂量依赖的方式诱导MB-MVEC释放IL-6，而在存在10 μg/ml TBP Ⅰ的同样条件下，IL-6的释放被明显抑制(图2)，这种抑制的程度取决于TBP Ⅰ/TNF的比率(表1)。TBP Ⅰ的抑制效果也
图2 TBP Ⅰ对不同TNF剂量诱导的MB-MVEC产生IL-6的影响
, 百拇医药
依赖于TNF刺激后TBP Ⅰ的给予时间。从图3可以看出，TBP Ⅰ的最大抑制效率是在与TNF同时加入时，在TNF刺激后4 h加入TBP Ⅰ不显示明显的抑制作用。
图3 不同TBP Ⅰ加入时间对TNF诱导的MB-MVEC产生IL-6的影响
4.TBP Ⅰ抑制TNF诱导的MB-MVEC粘附分子的表达：正常的MB-MVEC表达低水平的ICAM-1、VCAM-1及ELAM-1。在TNF刺激后，ICAM-1、VCAM-1及ELAM-1的表达明显增加，而且与TNF的浓度呈正相关。然而，在10 μg/ml TBP Ⅰ的情况下，TNF诱导的ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1的表达被明显抑制，与对照组比较差异有显著意义(P<0.05或0.01)(图4)。TBP Ⅰ抑制的程度依赖于TBP Ⅰ/TNF的比率(表1)。
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注：与相同剂量的TNF对照相比，*P<0.05；**P<0.01
图4 TBP Ⅰ对TNF诱导的MB-MVEC粘附分子表达的影响
表1 TBP I对人和鼠的TNF抑制效应的比较(%) TBP Ⅰ/TNF
(wt/wt)
细胞毒
ICAM-1
IL-6
小鼠
人
小鼠
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人
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三、讨论
体外及体内实验已经显示，可溶性的TNF受体具有抑制TNF的活性。生理情况下，血液中存在一定浓度的可溶性TNF受体，对防止过量的TNF所产生的病理作用起着缓冲作用。然而生理浓度的可溶性TNF受体对TNF的抑制效应是有限的。给予外源性基因重组的可溶性TNF受体，可能成为一种新的抗TNF治疗方法。本结果显示，基因重组的TBP Ⅰ可以在脑的微血管内皮细胞的水平阻断TNF的生物学作用，包括细胞毒作用和细胞因子的释放及粘附分子的表达。
虽然内皮细胞表达2种TNF受体，但TNF诱导的内皮细胞表型及功能的改变主要是通过TNF的受体Ⅰ介导[4]。TBP Ⅰ对TNF的抑制作用是剂量依赖的。TNF的生物活性形式是三聚体，而TNF的单体仅有极低或无生物活性，且易被降解。低浓度的TBP Ⅰ可以作为TNF的载体维持TNF三聚体的稳定性，从而延长其生物活性。另一方面，TBP Ⅰ需要与靶细胞的受体竞争结合TNF，因此，高浓度的TBP Ⅰ不仅能阻断TNF与靶细胞的结合，而且能够使已经结合的TNF从靶细胞上脱落下来。所以，TBP Ⅰ随浓度的不同可显示出不同的活性，低TBP Ⅰ/TNF比率可延长TNF的活性，而高TBP Ⅰ/TNF比率则抑制TNF的活性。到目前为止，抗TNF治疗仅在实验动物获得了良好的效果，而在人的疗效还相当有限。有趣的是，TBP Ⅰ对人和鼠的TNF表现出不同的抑制活性。在人脑的MVEC，TBP Ⅰ/TNF比率大于3 000，表现明显的抑制活性[3]，而在MB-MVEC，TBP Ⅰ/TNF比率大于100即可达到类似的抑制效果，表明TBP Ⅰ对鼠的TNF比人的TNF抑制效率大30倍。有人发现，TNFRⅡ是种属特异的，而TNFRⅠ是种属非特异的[5]。因此，鼠的TNF可能只结合到人的TNFRⅠ。另外，TBP Ⅰ的抑制作用在与TNF刺激后TBP加入的时间密切相关。从图3可以看出，TBP Ⅰ的最大抑制作用与TNF同时加入时。在TNF刺激2 h后加入TBP仍可明显地抑制TNF诱导的IL-6的产生，而在TNF刺激后4 h加入TBP Ⅰ，其对TNF的抑制作用几乎完全消失。这一结果强烈提示，TBP Ⅰ应在TNF升高的同时使用方能获得良好的抑制效果。这些实验数据为TBP Ⅰ的临床应用提供了实验依据。
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以上结果显示，TBP Ⅰ可以抑制TNF诱导的脑MVEC的表型及功能变化。由于TNF诱导的脑MVEC的激活在CM和MS的病理过程中起关键性作用，因此，TBP Ⅰ对这些疾病的治疗有潜在的临床应用价值。
参考文献
[1]Ythier A, Gascon MP, Juillard P, et al. Protective effect of natural TNF-binding protein on human TNF-induced toxicity in mice. Cytokine, 1993,5：459-462.
[2]Lou L, Gasche Y, Zheng L, et al. Differential reactivity of brain microvascular endothelial cells to TNF reflects the genetic susceptibility to cerebral malaria. Eur J Immunol. 1998,28：3989-4000.
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[3]Lou J, Ythier A, Burger D, et al. Modulation of soluble and membrane-bound TNF-induced phenotypic and functional changes of human brain microvascular endothelial cells by recombinant TNF binding protein I. J Neuroimmunol, 1997,77：107-115.
[4]Mackay F, Loetscher H, Stueber D, et al. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha): Induced cell adhesion to human endothelial cells is under dominant control of one TNF receptor type, TNF-R55. J Exp Med, 1993,177：1277-1286.
[5]Lewis M, Tartaglia LA, Lee A, et al. Cloning and expression of cDNAs for two distinct murine tumor necrosis factor receptors demonstrate one receptor is species specific. Proc Natl Acad Sci, 1991,88：2830-2840.
收稿日期：1998-12-10, 百拇医药