载脂蛋白A-I对内皮细胞粘附分子表达的影响
作者：梁利波 王抒 黎健
单位：卫生部北京医院卫生部北京老年医学研究所卫生部老年医学重点实验室 100730
关键词：
中华医学杂志000627 载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I, apoA-I)是高密度脂蛋白(HDL)中主要的载脂蛋白，它是否与HDL一样，具有抑制内皮细胞粘附分子表达的作用。本实验以培养的人脐静脉内皮细胞为材料，研究apoA-I对粘附分子VCAM-1、ICAM-1、ELAM-1表达的影响。
一、材料与方法
1.载脂蛋白A-I(apoA-I)的制备: 见参考文献[1]。
2.人脐静脉内皮细胞的培养:胶原酶消化法分离人脐静脉内皮细胞，加入含质量分数为0.2的胎牛血清的M199培养基(美国GIBCO公司)。取2～3代细胞分别用于流式细胞术和RT-PCR实验。在培养基中加入不同浓度apoA-I孵育20h，随后加肿瘤坏死因子α(TNFα)(100 U/ml) 继续孵育4 h以诱导粘附分子的表达。
, 百拇医药
3.流式细胞术检测粘附分子的表达: 消化内皮细胞，加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记鼠抗人细胞间粘附分子-1(ICAM-1)[血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、内皮细胞白细胞粘附分子-1(ELAM-1)]单克隆抗体(英国R ＆ D System公司)。用流式细胞仪(美国BD公司)测定。以不加TNFα诱导的细胞作为阴性对照，以不加抗体组作为空白对照。
4.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析粘附分子mRNA水平: 应用总RNA提取试剂盒(美国Promega公司)提取细胞RNA，以反转录试剂盒(Promega公司)逆转录RNA，然后进行PCR反应。PCR条件为：95℃变性10 min, 94℃ 15 s，56℃ 70 s, 72℃ 90 s，反应进行25个循环, 72℃延伸10 min。每组样品同时对作为内对照的看家基因GAPDH进行扩增。所用引物序列：VCAM-1：5′-AGTGGTGGCCTCGTGAATGG-3′, 5′-CTGTGTCTCCTGTCTCCGCT-3′,(700 bp);ELAM-1:5′-GGGACAACGAGAAGCCCAACG-3′, 5′-CCGAAGCCAGAGGAG-AAATG-3′, (863 bp); ICAM-1 5′-GTCCCCCTCAAAAGTCATCC-3′, 5′-AACCCCATTCAGCGTCACCT-3′, (943 bp); GAPDH 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTT-3′, 5′-CATGTGGGCCAT-GAGGTCCACCAC-3′,(983 bp)。
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5.PCR产物的半定量分析：PCR产物行质量分数为0.05的聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴乙锭染色后，用凝胶成像分析系统(美国Pharmacia公司)分析各电泳区带。
6.统计学处理：数据以SPSS软件处理。
二、结果
1.流式细胞术测定内皮细胞表面粘附分子的表达：将apoA-I与内皮细胞预先孵育能抑制 TNFα诱导的粘附分子的表达。结果证实apoA-I对ICAM-1的抑制作用呈剂量依赖性。0.25、0.5、1.0、1.5 mg/ml apoA-I对ICAM-1的抑制率分别为8.63%、14.60%、37.68%、38.73%; 对VCAM-1的抑制率为24.14%、29.53%、49.67%、61.50%; 对ELAM-1的抑制率为13.66%、20.14%、26.17%、29.86%(P<0.05)。
2.RT-PCR分析粘附分子mRNA水平(图1)：加入apoA-I后，粘附分子 mRNA水平显著降低，随着apoA-I浓度的增加，其抑制效果愈加明显。apoA-I浓度为1.5mg/ml时，ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1 mRNA水平分别下降了38.82%、56.10%、49.69%(P<0.05)；而作为内参照的GAPDH电泳带基本不受影响。
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1：Marker，2～6：0、0.25、0.5、1.0、1.5 mg/ml apoA-Ⅰ
图1 内皮细胞粘附分子RT-PCR产物电泳图谱
三、讨论
本实验研究apoA-I对TNFα诱导的粘附分子表达的影响。结果显示，预先加入apoA-I孵育后，内皮细胞粘附分子的表达有显著下降。apoA-I对ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1的抑制作用具有剂量依赖性。应用RT-PCR检测粘附分子mRNA水平，结果表明，apoA-I抑制了粘附分子RNA的转录，降低其mRNA水平，导致蛋白表达下降。由于粘附分子的表达调控相当复杂，因而也不能排除apoA-I对其翻译和翻译后水平调控的影响。apoA-I通过何种途径影响粘附分子表达尚不清楚。Cockerill等[2]曾指出HDL对由IL-1、TNFα诱导的粘附分子的表达都有抑制作用，推测其作用不是受体特异性的，而可能是通过一个共同的信号传导途径起作用。apoA-I的作用与HDL相似，说明HDL抑制细胞粘附的作用可能由(至少部分由)apoA-I来完成。
, 百拇医药
apoA-I具有抗动脉粥样硬化作用，其作用机理涉及到多个方面[3]。本实验发现apoA-I能抑制粘附分子的表达，推测这是apoA-I抗动脉粥样硬化作用机理之一，为用apoA-I防止动脉粥样硬化提供了新的依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670796)
参考文献
1，黎健.人血清载脂蛋白A-I、B的分离提纯及抗血清的制备.老年医学专刊，1986，6：100-102.
2，Cockerill GW, Rye KA, Gambal JR, et al. High-density lipoprotein inhibit cytokine-induced expression of endothelial cell adhesion molecules. Atherosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 1995, 15:1987-1994.
3，梁利波，黎健.载脂蛋白A-I的抗动脉粥样硬化作用.中国动脉硬化杂志，1998，6：353-356.
(收稿日期：1999-07-07), 百拇医药
单位：卫生部北京医院卫生部北京老年医学研究所卫生部老年医学重点实验室 100730
关键词：
中华医学杂志000627 载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I, apoA-I)是高密度脂蛋白(HDL)中主要的载脂蛋白，它是否与HDL一样，具有抑制内皮细胞粘附分子表达的作用。本实验以培养的人脐静脉内皮细胞为材料，研究apoA-I对粘附分子VCAM-1、ICAM-1、ELAM-1表达的影响。
一、材料与方法
1.载脂蛋白A-I(apoA-I)的制备: 见参考文献[1]。
2.人脐静脉内皮细胞的培养:胶原酶消化法分离人脐静脉内皮细胞，加入含质量分数为0.2的胎牛血清的M199培养基(美国GIBCO公司)。取2～3代细胞分别用于流式细胞术和RT-PCR实验。在培养基中加入不同浓度apoA-I孵育20h，随后加肿瘤坏死因子α(TNFα)(100 U/ml) 继续孵育4 h以诱导粘附分子的表达。
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3.流式细胞术检测粘附分子的表达: 消化内皮细胞，加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记鼠抗人细胞间粘附分子-1(ICAM-1)[血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、内皮细胞白细胞粘附分子-1(ELAM-1)]单克隆抗体(英国R ＆ D System公司)。用流式细胞仪(美国BD公司)测定。以不加TNFα诱导的细胞作为阴性对照，以不加抗体组作为空白对照。
4.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析粘附分子mRNA水平: 应用总RNA提取试剂盒(美国Promega公司)提取细胞RNA，以反转录试剂盒(Promega公司)逆转录RNA，然后进行PCR反应。PCR条件为：95℃变性10 min, 94℃ 15 s，56℃ 70 s, 72℃ 90 s，反应进行25个循环, 72℃延伸10 min。每组样品同时对作为内对照的看家基因GAPDH进行扩增。所用引物序列：VCAM-1：5′-AGTGGTGGCCTCGTGAATGG-3′, 5′-CTGTGTCTCCTGTCTCCGCT-3′,(700 bp);ELAM-1:5′-GGGACAACGAGAAGCCCAACG-3′, 5′-CCGAAGCCAGAGGAG-AAATG-3′, (863 bp); ICAM-1 5′-GTCCCCCTCAAAAGTCATCC-3′, 5′-AACCCCATTCAGCGTCACCT-3′, (943 bp); GAPDH 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTT-3′, 5′-CATGTGGGCCAT-GAGGTCCACCAC-3′,(983 bp)。
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5.PCR产物的半定量分析：PCR产物行质量分数为0.05的聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴乙锭染色后，用凝胶成像分析系统(美国Pharmacia公司)分析各电泳区带。
6.统计学处理：数据以SPSS软件处理。
二、结果
1.流式细胞术测定内皮细胞表面粘附分子的表达：将apoA-I与内皮细胞预先孵育能抑制 TNFα诱导的粘附分子的表达。结果证实apoA-I对ICAM-1的抑制作用呈剂量依赖性。0.25、0.5、1.0、1.5 mg/ml apoA-I对ICAM-1的抑制率分别为8.63%、14.60%、37.68%、38.73%; 对VCAM-1的抑制率为24.14%、29.53%、49.67%、61.50%; 对ELAM-1的抑制率为13.66%、20.14%、26.17%、29.86%(P<0.05)。
2.RT-PCR分析粘附分子mRNA水平(图1)：加入apoA-I后，粘附分子 mRNA水平显著降低，随着apoA-I浓度的增加，其抑制效果愈加明显。apoA-I浓度为1.5mg/ml时，ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1 mRNA水平分别下降了38.82%、56.10%、49.69%(P<0.05)；而作为内参照的GAPDH电泳带基本不受影响。
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1：Marker，2～6：0、0.25、0.5、1.0、1.5 mg/ml apoA-Ⅰ
图1 内皮细胞粘附分子RT-PCR产物电泳图谱
三、讨论
本实验研究apoA-I对TNFα诱导的粘附分子表达的影响。结果显示，预先加入apoA-I孵育后，内皮细胞粘附分子的表达有显著下降。apoA-I对ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1的抑制作用具有剂量依赖性。应用RT-PCR检测粘附分子mRNA水平，结果表明，apoA-I抑制了粘附分子RNA的转录，降低其mRNA水平，导致蛋白表达下降。由于粘附分子的表达调控相当复杂，因而也不能排除apoA-I对其翻译和翻译后水平调控的影响。apoA-I通过何种途径影响粘附分子表达尚不清楚。Cockerill等[2]曾指出HDL对由IL-1、TNFα诱导的粘附分子的表达都有抑制作用，推测其作用不是受体特异性的，而可能是通过一个共同的信号传导途径起作用。apoA-I的作用与HDL相似，说明HDL抑制细胞粘附的作用可能由(至少部分由)apoA-I来完成。
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apoA-I具有抗动脉粥样硬化作用，其作用机理涉及到多个方面[3]。本实验发现apoA-I能抑制粘附分子的表达，推测这是apoA-I抗动脉粥样硬化作用机理之一，为用apoA-I防止动脉粥样硬化提供了新的依据。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670796)
参考文献
1，黎健.人血清载脂蛋白A-I、B的分离提纯及抗血清的制备.老年医学专刊，1986，6：100-102.
2，Cockerill GW, Rye KA, Gambal JR, et al. High-density lipoprotein inhibit cytokine-induced expression of endothelial cell adhesion molecules. Atherosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 1995, 15:1987-1994.
3，梁利波，黎健.载脂蛋白A-I的抗动脉粥样硬化作用.中国动脉硬化杂志，1998，6：353-356.
(收稿日期：1999-07-07), 百拇医药