PC12细胞定性及定量测定神经生长因子活性的新方法*
作者：董跃伟 徐天瑞** 熊郁良 徐康森***
单位：云南省药品检验所 昆明 650011
关键词：PC12细胞；神经生长因子；活性测定
PC12细胞定性及定量测定神经生长 因子活性的新方法 提要 对用PC12细胞培养测定神经生长因子活性的方法进行了探索，通过对几种培养条件的比较，找出了较为理想的能定性及定量测定神经生长因子的两种方法，为神经生长因子作为新药检测手段提供了一条新途径。
ESTABLISHMENT OF NEW QUALITATIVE AND QUANTITATIVE
BIOASSAYS FOR NERVE GROWTH FACTOR USING
, 百拇医药
PC12 PHEOCHROMOCYTOMA CELLS
Dong Yuewei Xu Tianrui** Xiong Yuliang Xu Kangsen***
(Yunnan Institute for Control of Drugs Kunming 650011)
ABSTRACT A new quantitative bioassay for nerve growth factor (NGF) had been developed, based on the rapid outgrowth of neurites from PC12 rat pheochromocytoma cells. This method compared with others previously described is easy, rapid, sensitive and can be used to control the quality of NGF products.
, 百拇医药
Key Words Nerve growth factor (NGF) PC12 pheochromocytoma cells Bioassay
神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是一种对神经细胞生长发育、分化、新陈代谢等方面具有重要调控作用的活性多肽，作为药品在医学上有着广泛用途。该因子已从小鼠颌下腺，豚鼠、兔、牛前列腺，公牛精液，人胎盘和蛇毒等组织器官中分离纯化获得。作为药品质量检测，其生物活性测定方法主要有鸡胚背根神经节培养法和PC12细胞培养法两种。国内大都采用鸡胚背根神经节法，国外主要采用PC12细胞测定法[1～4]。后者不论是在灵敏度或是重现性方面都较前者有不可比拟的优越性，但实验条件要求高，需要可靠的细胞系等不足。在国外文献报道的基础上，特对采用PC12细胞培养测定NGF活性进行了研究，探索出了两种简便可靠，实验条件要求不高且较准确的定性与定量的新方法，为活性检测提供一种新的检测手段。
, http://www.100md.com 1 实验部分
1.1 试剂
PC12细胞[引自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库(KCB93033YJ)]；神经生长因子[从中华眼镜蛇毒(Naja Naja Atra)分离纯化获得，电泳纯度一条带，HPLC单峰]；鼠尾胶原(取大白鼠尾巴的肌腱经乙酸提取制得)；培养基(RPMI 1640日本日水制药株式会社)；马血清(美国生命技术公司，批号1009853)；小牛血清(杭州四季清生物制品厂)。
1.2 方法与结果
1.2.1 定性测定法 取适量生长良好的PC12细胞，接种于盛有10 ml培养液(85% 1640，15%小牛血清)的细胞培养瓶中，分别加入样品或对照的生理盐水，37℃培养，每3～4 d换一次培养液，10 d后，对照组的细胞仍呈球形，实验组的PC12细胞分化出神经样的突触。
, http://www.100md.com
1.2.2 定性结果 培养10 d的PC12细胞对照组细胞呈圆球形(图1C)，实验组(20 ng/ml NGF)细胞大量长出神经样纤维(图1D)。
图1 神经生长因子对PC12细胞的影响
A-B PC12细胞定量测定NGF(涂布胶原，85% 1640+10%马血清+5%小牛血清)。A 对照组 B NGF组
, http://www.100md.com
C-D PC12细胞定性测定NGF。C 对照组 D NGF组
E-F PC12细胞定量测定NGF(未涂布胶原，85% 1640+3%马血清+12%小牛血清)。E 对照组 F NGF组
A-B，E-F，标尺均为50 μm，均为C-D为25 μm
Fig 1 The effects of NGF on the outgrowth of PC12 Cells
A-B Quantitative bioassay (collagen-coated,85% 1640+10% horse serum+5% fetal bovine serum) A: Control, the cells adhered each other, but only a few of them clumped; B:Presence of NGF, the cells clumped but the border was not so distinct, the outgrowth of neurite fibre was not very well.
, 百拇医药
C-D Quatitative bioassay C：Control, the cells presented bead-shape;D:Presence of NGF, most of the cells presented neuron-shape
E-F Quatitative bioassay (non-collagen-coated,85% 1640+3% horse serum+12% fetal bovine serum) E：Control,the cells tended to attach in small clumps with neurite-like outgrowth;F:Presence of NGF, the cells clumped well and generated satisfactory neurite-like outgrowth.The bars represent 50 μm in A-B-E-F and 25 μm in C-D.
, 百拇医药
1.2.3 定量测定法 取适量生长良好PC12细胞，接种于盛有10 ml致敏培养液(85% 1640，14%小牛血清，1%马血清，50 ng/ml NGF)的细胞培养瓶中，37℃培养，每2～3 d换一次培养液，10 d后，离心收集，即得致敏PC12细胞(可一次大量致敏PC12细胞，液氮冷冻保存，复苏后直接用于测定)[5]。取上述致敏细胞适量，接种于盛有10 ml活性测定培养液的培养瓶中，加入不同浓度的样品或生理盐水，同法培养24 h，于显微镜下观察，随机计数10个视野，每个视野各10 个细胞团，明显长出突触的记为活性细胞团。实验组活性细胞团数减去空白对照组活性细胞团数与总观察细胞团数100相比，求得活性细胞团所占比例，根据定义(1 ml活性测定培养液中，促进产生50%活性细胞团的NGF量定义为一个活性单位)算出活性单位数。
1.2.4 定量结果 培养瓶涂布胶原，培养液为85% 1640+10%马血清+5%小牛血清。对照组细胞虽相互靠拢但较少有细胞成团(图1A)，实验组(5 ng/ml NGF)细胞聚集成团，但团块之间界限不很清楚，神经样纤维生长不十分理想(图1B)。培养瓶不涂布胶原，培养液为85% 1640+3%马血清+12%小牛血清。对照组细胞聚集成团，大多无神经样纤维长出(图1E)，实验组细胞聚集成团并长出神经样纤维(图1F)。测定灵敏度可达1 ng。活性PC12细胞团所占比例与NGF的浓度关系见表1。不同培养条件下PC12细胞生长结果比较见表2。
, http://www.100md.com
表1 定量测定中NGF与活性细胞团的量效关系
Table 1 The dose-response relationship between NGF and active clumps in quantitative bioassay
Relationship
NGF conc.(ng/ml)
0.5
1
2
3
4
5
, 百拇医药
Responding
clumps%
15～40
40～60
60～75
75～90
>95
>95
表2 几种培养液中PC12的细胞生长状况
Table 2 The neurite outgrowth of PC12 cell responding to NGF in different culture medium
, 百拇医药
Collagen
Growth
state
85% 1640+
15%△
10% horse
serum+5%△
85% 1640+3% horse
serum+12%△
NCC
Attaching to glass
, 百拇医药
+++
++
+++
Growth
+++
+
+++
Clumping
+
++
+++
Neuriteoutgrowth
++
, http://www.100md.com
++
+++
Counting
+
++
+++
CC
Attaching to glass
+++
+++
+++
Growth
+++
, 百拇医药
+++
+++
Clumping
+
++
+++
Neurite outgrowth
++
++
++
Counting
+
++
, http://www.100md.com
++
NCC＝non-collagen-coated;CC=collagen coated;+++好，++中，+差；△＝fetal bovine serum
2 讨论
2.1 不同的PC12细胞亚系有不同的生物学特性，对NGF的敏感性也不同。因此，得到合适的PC12细胞亚系是活性检测的关键。PC12细胞具有圆形或多边形，易以小簇生长，无血清或血清少用都不能正常生长[6]。马血清对NGF活性测定特别重要，并不是每一批的血清都能提供很好的培养，无马血清结果不令人满意[7]。在马血清中，PC12易强烈地自动聚集成团，贴壁不好，随着马血清浓度下降，聚团程度降低，贴壁容易。但量太低突触生长又不好，说明马血清提供了PC12细胞神经样生长突触所需的重要因子。
2.2 国际上用PC12细胞测定神经生长因子活性时，普遍采用10%的马血清+5%的小牛血清+85%的1640作为培养液，并在涂布了胶原的培养皿中开放式培养，因而需在CO2培养箱中，恒温恒湿条件下保证培养液的稳定性[8]。胶原能保证PC12细胞快速粘附培养瓶壁，但胶原的制作繁琐且过程长，除菌过滤困难，易污染。涂布瓶壁时胶原量的多少不易掌握，涂厚了神经样生长被延迟且换液时易剥落；涂薄了PC12细胞贴壁不好，PC12细胞易形成大的团块，突触生长稀少，每次涂壁都要用两倍稀释法来找出最佳浓度。另外，无菌条件下空气干燥时间长，难以保证无菌条件。在涂布了胶原后，检测的背底增高，细胞聚团大小不均，团块之间界限不很清楚，突触生长不令人满意，计数随意性大、而且这种方法对PC12细胞的不同亚系也有不同的要求，不利于定量检测。
, http://www.100md.com
2.3 实验中发现，小牛血清在PC12细胞培养中对细胞贴壁起着重要的作用。在考虑到PC12细胞的贴壁和生长良好的情况下，比较研究了不同的血清比例，摸索出了定性培养液和定量培养液。只用15%小牛血清培养PC12细胞，国内外均未见报道，在该培养液中，24 h内PC12细胞就完全贴壁且牢固，不易聚团，可生存，但生长状态不佳，细胞呈圆球形。而加入神经生长因子后，PC12细胞可以正常生长并分化出神经元样的突触，并可十分清晰地定性区分有活性的样品和无活性的样品，克服判断上的人为因素。通过对几种培养条件的比较研究，找出了较为理想的定量方法。该新方法在定量测定培养液中调整了牛血清与马血清所占比例，免去繁琐且难以掌握的胶原涂布，PC12细胞既能贴壁又能聚团均匀，团块分散且界限清晰，突出生长明显，背底低，而且在传代时只需振荡 培养液即可使PC12细胞脱离培养瓶，不须使用胰酶或EDTA等其它手段来分离细胞，计数准确，十分有利于定量检测。采用密闭培养，普通培养箱即可。
2.4 PC12细胞测定法是一种以细胞生长状况为判断标准的测定法，存在着实验结果离差较宽的现象。实际操作中，用PC12细胞测定NGF活性时，NGF浓度应尽量控制在活性细胞团比例为30～70%之间，以确保结果可靠。超出此浓度范围，活性细胞团数不再呈线性关系。国外测定结果可信度为±25%[8]，文中建立的新方法与国外报道的可信度有所提高，更准确的测定方法目前我们正在进一步研究中。
, http://www.100md.com
*云南省重点基金“蛇毒NGF治疗男性不育研究”资助，编号980468
**通讯人 中国科学院昆明动物研究所，昆明650223
***中国药品生物制品检定所，北京 100050
参考文献
1 Tischler AS, Greene LA. Nerve growth factor induced process formation of cultured rat pheochromocytoma cells.Nature,1975,258∶341
2 Greene LA. A quantitative bioassay for never growth factor activity employing a clonal pheochromocytoma cell line. Brain Res,1977,133∶350
, http://www.100md.com
3 Pean JI, Venier-Julienne IC, Boury F, et al. NGF release from poly(L-lactide-coglycolide) microspheres. Effect of some formulation parameters on encapsulated NGF stability. J Controlled Release,1988,56∶87
4 Guo I, Ieyer SL, Kaur H, et al. Mutational studies of conserved residues in the dimer interface of nerve growth factor. Protein Sci,1996,5∶55
5 Rukenstein A, Greene LA. The quantitative bioassay of nerve growth factor:use of frozen primed'PC12 pheochromocytoma cells. Brain Res,1983,263∶177
, 百拇医药
6 Greene LA, Tischler AS. Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA,1976,73∶2424
7 Greene LA, Aletta JM, Rukenstein A, et al. PC12 pheochromocytoma cells:culture, nerve growth factor treatment and experimental exploitation. Meth Enzymol,1987,147∶207
8 Rush RA. IBRO Handbook series:Method in the neurosciences. vol 12,Chichester,UK:John Wiley and Sons,1989,139, 百拇医药(董跃伟 徐天瑞** 熊郁良 徐康森***)
单位：云南省药品检验所 昆明 650011
关键词：PC12细胞；神经生长因子；活性测定
PC12细胞定性及定量测定神经生长 因子活性的新方法 提要 对用PC12细胞培养测定神经生长因子活性的方法进行了探索，通过对几种培养条件的比较，找出了较为理想的能定性及定量测定神经生长因子的两种方法，为神经生长因子作为新药检测手段提供了一条新途径。
ESTABLISHMENT OF NEW QUALITATIVE AND QUANTITATIVE
BIOASSAYS FOR NERVE GROWTH FACTOR USING
, 百拇医药
PC12 PHEOCHROMOCYTOMA CELLS
Dong Yuewei Xu Tianrui** Xiong Yuliang Xu Kangsen***
(Yunnan Institute for Control of Drugs Kunming 650011)
ABSTRACT A new quantitative bioassay for nerve growth factor (NGF) had been developed, based on the rapid outgrowth of neurites from PC12 rat pheochromocytoma cells. This method compared with others previously described is easy, rapid, sensitive and can be used to control the quality of NGF products.
, 百拇医药
Key Words Nerve growth factor (NGF) PC12 pheochromocytoma cells Bioassay
神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是一种对神经细胞生长发育、分化、新陈代谢等方面具有重要调控作用的活性多肽，作为药品在医学上有着广泛用途。该因子已从小鼠颌下腺，豚鼠、兔、牛前列腺，公牛精液，人胎盘和蛇毒等组织器官中分离纯化获得。作为药品质量检测，其生物活性测定方法主要有鸡胚背根神经节培养法和PC12细胞培养法两种。国内大都采用鸡胚背根神经节法，国外主要采用PC12细胞测定法[1～4]。后者不论是在灵敏度或是重现性方面都较前者有不可比拟的优越性，但实验条件要求高，需要可靠的细胞系等不足。在国外文献报道的基础上，特对采用PC12细胞培养测定NGF活性进行了研究，探索出了两种简便可靠，实验条件要求不高且较准确的定性与定量的新方法，为活性检测提供一种新的检测手段。
, http://www.100md.com 1 实验部分
1.1 试剂
PC12细胞[引自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库(KCB93033YJ)]；神经生长因子[从中华眼镜蛇毒(Naja Naja Atra)分离纯化获得，电泳纯度一条带，HPLC单峰]；鼠尾胶原(取大白鼠尾巴的肌腱经乙酸提取制得)；培养基(RPMI 1640日本日水制药株式会社)；马血清(美国生命技术公司，批号1009853)；小牛血清(杭州四季清生物制品厂)。
1.2 方法与结果
1.2.1 定性测定法 取适量生长良好的PC12细胞，接种于盛有10 ml培养液(85% 1640，15%小牛血清)的细胞培养瓶中，分别加入样品或对照的生理盐水，37℃培养，每3～4 d换一次培养液，10 d后，对照组的细胞仍呈球形，实验组的PC12细胞分化出神经样的突触。
, http://www.100md.com
1.2.2 定性结果 培养10 d的PC12细胞对照组细胞呈圆球形(图1C)，实验组(20 ng/ml NGF)细胞大量长出神经样纤维(图1D)。
图1 神经生长因子对PC12细胞的影响
A-B PC12细胞定量测定NGF(涂布胶原，85% 1640+10%马血清+5%小牛血清)。A 对照组 B NGF组
, http://www.100md.com
C-D PC12细胞定性测定NGF。C 对照组 D NGF组
E-F PC12细胞定量测定NGF(未涂布胶原，85% 1640+3%马血清+12%小牛血清)。E 对照组 F NGF组
A-B，E-F，标尺均为50 μm，均为C-D为25 μm
Fig 1 The effects of NGF on the outgrowth of PC12 Cells
A-B Quantitative bioassay (collagen-coated,85% 1640+10% horse serum+5% fetal bovine serum) A: Control, the cells adhered each other, but only a few of them clumped; B:Presence of NGF, the cells clumped but the border was not so distinct, the outgrowth of neurite fibre was not very well.
, 百拇医药
C-D Quatitative bioassay C：Control, the cells presented bead-shape;D:Presence of NGF, most of the cells presented neuron-shape
E-F Quatitative bioassay (non-collagen-coated,85% 1640+3% horse serum+12% fetal bovine serum) E：Control,the cells tended to attach in small clumps with neurite-like outgrowth;F:Presence of NGF, the cells clumped well and generated satisfactory neurite-like outgrowth.The bars represent 50 μm in A-B-E-F and 25 μm in C-D.
, 百拇医药
1.2.3 定量测定法 取适量生长良好PC12细胞，接种于盛有10 ml致敏培养液(85% 1640，14%小牛血清，1%马血清，50 ng/ml NGF)的细胞培养瓶中，37℃培养，每2～3 d换一次培养液，10 d后，离心收集，即得致敏PC12细胞(可一次大量致敏PC12细胞，液氮冷冻保存，复苏后直接用于测定)[5]。取上述致敏细胞适量，接种于盛有10 ml活性测定培养液的培养瓶中，加入不同浓度的样品或生理盐水，同法培养24 h，于显微镜下观察，随机计数10个视野，每个视野各10 个细胞团，明显长出突触的记为活性细胞团。实验组活性细胞团数减去空白对照组活性细胞团数与总观察细胞团数100相比，求得活性细胞团所占比例，根据定义(1 ml活性测定培养液中，促进产生50%活性细胞团的NGF量定义为一个活性单位)算出活性单位数。
1.2.4 定量结果 培养瓶涂布胶原，培养液为85% 1640+10%马血清+5%小牛血清。对照组细胞虽相互靠拢但较少有细胞成团(图1A)，实验组(5 ng/ml NGF)细胞聚集成团，但团块之间界限不很清楚，神经样纤维生长不十分理想(图1B)。培养瓶不涂布胶原，培养液为85% 1640+3%马血清+12%小牛血清。对照组细胞聚集成团，大多无神经样纤维长出(图1E)，实验组细胞聚集成团并长出神经样纤维(图1F)。测定灵敏度可达1 ng。活性PC12细胞团所占比例与NGF的浓度关系见表1。不同培养条件下PC12细胞生长结果比较见表2。
, http://www.100md.com
表1 定量测定中NGF与活性细胞团的量效关系
Table 1 The dose-response relationship between NGF and active clumps in quantitative bioassay
Relationship
NGF conc.(ng/ml)
0.5
1
2
3
4
5
, 百拇医药
Responding
clumps%
15～40
40～60
60～75
75～90
>95
>95
表2 几种培养液中PC12的细胞生长状况
Table 2 The neurite outgrowth of PC12 cell responding to NGF in different culture medium
, 百拇医药
Collagen
Growth
state
85% 1640+
15%△
10% horse
serum+5%△
85% 1640+3% horse
serum+12%△
NCC
Attaching to glass
, 百拇医药
+++
++
+++
Growth
+++
+
+++
Clumping
+
++
+++
Neuriteoutgrowth
++
, http://www.100md.com
++
+++
Counting
+
++
+++
CC
Attaching to glass
+++
+++
+++
Growth
+++
, 百拇医药
+++
+++
Clumping
+
++
+++
Neurite outgrowth
++
++
++
Counting
+
++
, http://www.100md.com
++
NCC＝non-collagen-coated;CC=collagen coated;+++好，++中，+差；△＝fetal bovine serum
2 讨论
2.1 不同的PC12细胞亚系有不同的生物学特性，对NGF的敏感性也不同。因此，得到合适的PC12细胞亚系是活性检测的关键。PC12细胞具有圆形或多边形，易以小簇生长，无血清或血清少用都不能正常生长[6]。马血清对NGF活性测定特别重要，并不是每一批的血清都能提供很好的培养，无马血清结果不令人满意[7]。在马血清中，PC12易强烈地自动聚集成团，贴壁不好，随着马血清浓度下降，聚团程度降低，贴壁容易。但量太低突触生长又不好，说明马血清提供了PC12细胞神经样生长突触所需的重要因子。
2.2 国际上用PC12细胞测定神经生长因子活性时，普遍采用10%的马血清+5%的小牛血清+85%的1640作为培养液，并在涂布了胶原的培养皿中开放式培养，因而需在CO2培养箱中，恒温恒湿条件下保证培养液的稳定性[8]。胶原能保证PC12细胞快速粘附培养瓶壁，但胶原的制作繁琐且过程长，除菌过滤困难，易污染。涂布瓶壁时胶原量的多少不易掌握，涂厚了神经样生长被延迟且换液时易剥落；涂薄了PC12细胞贴壁不好，PC12细胞易形成大的团块，突触生长稀少，每次涂壁都要用两倍稀释法来找出最佳浓度。另外，无菌条件下空气干燥时间长，难以保证无菌条件。在涂布了胶原后，检测的背底增高，细胞聚团大小不均，团块之间界限不很清楚，突触生长不令人满意，计数随意性大、而且这种方法对PC12细胞的不同亚系也有不同的要求，不利于定量检测。
, http://www.100md.com
2.3 实验中发现，小牛血清在PC12细胞培养中对细胞贴壁起着重要的作用。在考虑到PC12细胞的贴壁和生长良好的情况下，比较研究了不同的血清比例，摸索出了定性培养液和定量培养液。只用15%小牛血清培养PC12细胞，国内外均未见报道，在该培养液中，24 h内PC12细胞就完全贴壁且牢固，不易聚团，可生存，但生长状态不佳，细胞呈圆球形。而加入神经生长因子后，PC12细胞可以正常生长并分化出神经元样的突触，并可十分清晰地定性区分有活性的样品和无活性的样品，克服判断上的人为因素。通过对几种培养条件的比较研究，找出了较为理想的定量方法。该新方法在定量测定培养液中调整了牛血清与马血清所占比例，免去繁琐且难以掌握的胶原涂布，PC12细胞既能贴壁又能聚团均匀，团块分散且界限清晰，突出生长明显，背底低，而且在传代时只需振荡 培养液即可使PC12细胞脱离培养瓶，不须使用胰酶或EDTA等其它手段来分离细胞，计数准确，十分有利于定量检测。采用密闭培养，普通培养箱即可。
2.4 PC12细胞测定法是一种以细胞生长状况为判断标准的测定法，存在着实验结果离差较宽的现象。实际操作中，用PC12细胞测定NGF活性时，NGF浓度应尽量控制在活性细胞团比例为30～70%之间，以确保结果可靠。超出此浓度范围，活性细胞团数不再呈线性关系。国外测定结果可信度为±25%[8]，文中建立的新方法与国外报道的可信度有所提高，更准确的测定方法目前我们正在进一步研究中。
, http://www.100md.com
*云南省重点基金“蛇毒NGF治疗男性不育研究”资助，编号980468
**通讯人 中国科学院昆明动物研究所，昆明650223
***中国药品生物制品检定所，北京 100050
参考文献
1 Tischler AS, Greene LA. Nerve growth factor induced process formation of cultured rat pheochromocytoma cells.Nature,1975,258∶341
2 Greene LA. A quantitative bioassay for never growth factor activity employing a clonal pheochromocytoma cell line. Brain Res,1977,133∶350
, http://www.100md.com
3 Pean JI, Venier-Julienne IC, Boury F, et al. NGF release from poly(L-lactide-coglycolide) microspheres. Effect of some formulation parameters on encapsulated NGF stability. J Controlled Release,1988,56∶87
4 Guo I, Ieyer SL, Kaur H, et al. Mutational studies of conserved residues in the dimer interface of nerve growth factor. Protein Sci,1996,5∶55
5 Rukenstein A, Greene LA. The quantitative bioassay of nerve growth factor:use of frozen primed'PC12 pheochromocytoma cells. Brain Res,1983,263∶177
, 百拇医药
6 Greene LA, Tischler AS. Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA,1976,73∶2424
7 Greene LA, Aletta JM, Rukenstein A, et al. PC12 pheochromocytoma cells:culture, nerve growth factor treatment and experimental exploitation. Meth Enzymol,1987,147∶207
8 Rush RA. IBRO Handbook series:Method in the neurosciences. vol 12,Chichester,UK:John Wiley and Sons,1989,139, 百拇医药(董跃伟 徐天瑞** 熊郁良 徐康森***)