丙氨瑞林对人子宫内膜癌细胞株HEC-1A作用的研究
作者：张玉泉 曹斌融 张惜阴 孙红 葛柏青 冯炜炜
单位：张玉泉(南通医学院附属医院妇产科，南通226001)；曹斌融 张惜阴 孙红 葛柏青 冯炜炜(上海医科大学妇产科医院)
关键词：丙氨瑞林；垂体激素释放激素类；子宫内膜癌
南通医学院学报000125[摘 要] 目的：研究丙氨瑞林对子宫内膜癌直接作用的可能性。方法：以不同浓度丙氨瑞林(浓度为10-9～10-5mol/L)与人子宫内膜癌细胞株HEC-1A(中分化子宫内膜腺癌)一起进行培养72h，观察各浓度下癌细胞的抑制情况。结果：当丙氨瑞林浓度为10-9mol/L时，癌细胞生长即受到抑制，抑制率为37.0±26.2%；随着丙氨瑞林浓度的增大，抑制率渐高。结论：丙氨瑞林在体外对HEC-1A细胞可能有直接抑制作用，且呈剂量依赖关系。
, 百拇医药
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)01-0052-02
THE STUDY CONCERNING THE ACTION OF ALARELIN ON
HUMAN ENDOMETRIAL CARCINOMA LINE HEC-1A
ZHANG Yuquan CAO Binrong ZHANG Xiyin SUN Hong GE Baiqing FENG Weiwei
(Obstetrics and Gynecology Department,the Affiliated Hospital,Nantong Medical College,Nantong226001)
, http://www.100md.com
[Abstract] Objective:To evaluate the possible direct effect of Alarelin on endometrial carcinoma.Methods:Human endometrial carcinoma cell line HEC-1A cells was chosen to assay the inhibitory rate when given a range of concentrations Alarelin (from 10-9mol/L to 10-5mol/L) and co-cultured for 72 hours.Results:The growth of HEC-1A cells was inhibited when the lowest Alarelin concentration 10-9mol/L was given,the inhibitory rate was 37.0±26.2%. The inhibitory rate increased with the rising of Alarelin concentrations.Conclusion:Alarelin might have direct inhibitory response on HEC-1A cells in vitro and the effect was dose-dependent.
, http://www.100md.com
[Key words] alarelin;pituitary hormone releasing hormones;endometrial carcinoma
促进腺激素释放激素类似物(Gonadotropin releasing hormone analogue,GnRH-A)对激素依赖性肿瘤具有治疗作用，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及子宫内膜癌。丙氨瑞林(Alarelin)是国产GnRH激动剂(agonist)，其生物活性为天然GnRH的15倍。它对子宫内膜癌有一定的治疗作用，且对子宫内膜癌的相关癌基因ras、neu、myc的表达具有调控作用[1～3]。本研究用丙氨瑞林与人子宫内膜癌细胞株HEC-1A细胞进行培养，观察对子宫内膜癌直接作用的可能性。
1 材料与方法
1.1 材料 丙氨瑞林(上海丽珠东风生物技术有限公司生产)，RPMI1640(系美国纽约生命技术公司产品)，台盼兰及胰蛋白酶(均为美国Sigma公司产品)，小牛血清(上海崇明县新星小牛血站产品)，CO2培养箱(美国SHEL LAB产品)，24孔孔径16mm培养箱(美国Corning玻璃厂产品)。
, 百拇医药
1.2 细胞培养 HEC-1A为人中分化内膜腺癌细胞株，由美国ATCC细胞库提供。癌细胞从液氮中取出，按常规方法融化、复苏，培养于10%小牛血清、100u/ml庆大霉素的RPMI1640培养液中，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.3 绘制HEC-1A细胞生长曲线 将生长良好的HEC-1A细胞分置于30瓶容量为25ml的培养瓶中，每瓶含细胞悬液3ml，每毫升的细胞数为5×104，置37℃ 5%CO2培养箱松盖培养。次日起每24h取3瓶细胞，胰蛋白酶消化，0.4%台盼兰染色计数细胞数，连续10天。以每天细胞数为纵坐标，时间(天)为横坐标，绘制生长曲线。
1.4 丙氨瑞林对HEC-1A细胞的抑制率(Inhibitory rate,IR)测定 取24孔培养板，每孔加入含HEC-1A细胞数6×104的细胞悬液1ml。24h后细胞贴壁生长。吸去原培养液，予1ml新培养液(对照组)或用药组丙氨瑞林，终浓度为10-9～10-5mol/L，每个稀释度的丙氨瑞林或新培养液各置4孔。置37℃ 5%CO2培养箱培养。72h后，以胰蛋白酶消化，台盼兰染色计数非染色细胞，并计算抑制率，其公式为：
, http://www.100md.com
IR=(Nn-N)/(Nn-No)×100%
其中No为接种细胞数，N为实验组72h后各浓度下的细胞数，Nn对照组72h后的细胞数。
1.5 统计学检验 t检验。
2 结 果
2.1 HEC-1A细胞生长曲线 HEC-1A细胞在接种后1细胞数(×104)
图1 HEC-1A细胞生长曲线
天内为生长潜伏期，第1天到第5天为指数生长期。第6天后进入平稳期。见图1。
2.2 丙氨瑞林对HEC-1A细胞的抑制率 不同浓度丙氨瑞林与HEC-1A细胞作用72h的细胞数及抑制率见表1a。表1 不同浓度丙氨瑞林对HEC-1A抑制情况(
±s) 药物浓度(mol/L)
, 百拇医药
对照组
10-9
10-8
10-7
10-6
10-5
细胞数(104)
抑制率(%)
19.6±5.7
0.0
14.2±4.0
, 百拇医药
37.0±26.2
13.5±0.6
38.6±16.7
13.2±3.0
45.3±21.1
11.8±2.6
53.2±26.8
10.8±2.4
56.3±38.0
与对照组比P<0.05
由表1可见，当丙氨瑞林浓度为10-9mol/L时，HEC-1A细胞数与对照组相比明显下降(P<0.05)。随着丙氨瑞林浓度增高，细胞数下降更多，抑制率更高。当丙氨瑞林剂量达10-6mol/L时，抑制率达50%。
, 百拇医药
3 讨 论
GnRH-A对促性腺素的降调节作用以及其后所引起的甾体激素水平的下降，是GnRH-A引入激素依赖性肿瘤治疗的理论基础。它对肿瘤尚具有直接作用的可能[4]。
资料已表明丙氨瑞林对子宫内膜癌有一定的治疗作用，但其作用机理尚不清楚。本实验将不同浓度的丙氨瑞林(10-9～10-5mol/L)与HEC-1A细胞株进行培养72h后，在最低浓度10-9mol/L时即对细胞有抑制作用；且随着浓度增高，抑制作用增强。表明丙氨瑞林对人子宫内膜癌细胞株HEC-1A具有直接抑制作用，且呈剂量依赖关系。
HEC-1A是一种人源性中分化内膜癌细胞株。文献报道，在HEC-1A细胞存在二类GnRH受体，一类是高亲和力、低容量受体(平均解离常数Kd1=5.7±3.8×10-9mol/L细胞，结合容量Bmax1=78±53fmol/106细胞)；一类是低亲和力、高容量受体(Kd2=1.4±0.6×10-6mol/L，Bmax2=21±8pmol/106细胞)[5]。丙氨瑞林对癌细胞的抑制作用可能即通过癌细胞表面受体所致。
, http://www.100md.com
[参考文献]
[1] 张玉泉，曹斌融，周先荣，等.丙氨瑞林治疗子宫内膜癌病人后性激素及有丝分裂指数的变化[J].新药与临床，1996,15(4)∶194.
[2] 张玉泉，曹斌融，郑松国，等.促性腺激素释放激素激动剂对子宫内膜癌neu基因表达的调控[J].中华妇产科杂志，1998,33(2)∶110.
[3] 张玉泉，曹斌融，张惜阴，等.丙氨瑞林对子宫内膜癌ras、myc、及P53基因表达调控的研究[J].南通医学院学报，1999,19(1)∶19.
[4] 张玉泉，曹斌融.GnRH-A作用于卵巢肿瘤的研究[J].国外医学妇产科学分册，1997,24(1)∶27.
[5] Emons G,Schroder B,Ortmann O,et al.High affinity binding and direct antiproliferative effects of luteinizing hormone-releasing hormone analogs in human endometrial cancer cell lines[J]. J Clin Endocrinol Metab,1993,77∶1458.
(1999-10-05收稿), http://www.100md.com
单位：张玉泉(南通医学院附属医院妇产科，南通226001)；曹斌融 张惜阴 孙红 葛柏青 冯炜炜(上海医科大学妇产科医院)
关键词：丙氨瑞林；垂体激素释放激素类；子宫内膜癌
南通医学院学报000125[摘 要] 目的：研究丙氨瑞林对子宫内膜癌直接作用的可能性。方法：以不同浓度丙氨瑞林(浓度为10-9～10-5mol/L)与人子宫内膜癌细胞株HEC-1A(中分化子宫内膜腺癌)一起进行培养72h，观察各浓度下癌细胞的抑制情况。结果：当丙氨瑞林浓度为10-9mol/L时，癌细胞生长即受到抑制，抑制率为37.0±26.2%；随着丙氨瑞林浓度的增大，抑制率渐高。结论：丙氨瑞林在体外对HEC-1A细胞可能有直接抑制作用，且呈剂量依赖关系。
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[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A
[文章编号]1000-2057(2000)01-0052-02
THE STUDY CONCERNING THE ACTION OF ALARELIN ON
HUMAN ENDOMETRIAL CARCINOMA LINE HEC-1A
ZHANG Yuquan CAO Binrong ZHANG Xiyin SUN Hong GE Baiqing FENG Weiwei
(Obstetrics and Gynecology Department,the Affiliated Hospital,Nantong Medical College,Nantong226001)
, http://www.100md.com
[Abstract] Objective:To evaluate the possible direct effect of Alarelin on endometrial carcinoma.Methods:Human endometrial carcinoma cell line HEC-1A cells was chosen to assay the inhibitory rate when given a range of concentrations Alarelin (from 10-9mol/L to 10-5mol/L) and co-cultured for 72 hours.Results:The growth of HEC-1A cells was inhibited when the lowest Alarelin concentration 10-9mol/L was given,the inhibitory rate was 37.0±26.2%. The inhibitory rate increased with the rising of Alarelin concentrations.Conclusion:Alarelin might have direct inhibitory response on HEC-1A cells in vitro and the effect was dose-dependent.
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[Key words] alarelin;pituitary hormone releasing hormones;endometrial carcinoma
促进腺激素释放激素类似物(Gonadotropin releasing hormone analogue,GnRH-A)对激素依赖性肿瘤具有治疗作用，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌及子宫内膜癌。丙氨瑞林(Alarelin)是国产GnRH激动剂(agonist)，其生物活性为天然GnRH的15倍。它对子宫内膜癌有一定的治疗作用，且对子宫内膜癌的相关癌基因ras、neu、myc的表达具有调控作用[1～3]。本研究用丙氨瑞林与人子宫内膜癌细胞株HEC-1A细胞进行培养，观察对子宫内膜癌直接作用的可能性。
1 材料与方法
1.1 材料 丙氨瑞林(上海丽珠东风生物技术有限公司生产)，RPMI1640(系美国纽约生命技术公司产品)，台盼兰及胰蛋白酶(均为美国Sigma公司产品)，小牛血清(上海崇明县新星小牛血站产品)，CO2培养箱(美国SHEL LAB产品)，24孔孔径16mm培养箱(美国Corning玻璃厂产品)。
, 百拇医药
1.2 细胞培养 HEC-1A为人中分化内膜腺癌细胞株，由美国ATCC细胞库提供。癌细胞从液氮中取出，按常规方法融化、复苏，培养于10%小牛血清、100u/ml庆大霉素的RPMI1640培养液中，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.3 绘制HEC-1A细胞生长曲线 将生长良好的HEC-1A细胞分置于30瓶容量为25ml的培养瓶中，每瓶含细胞悬液3ml，每毫升的细胞数为5×104，置37℃ 5%CO2培养箱松盖培养。次日起每24h取3瓶细胞，胰蛋白酶消化，0.4%台盼兰染色计数细胞数，连续10天。以每天细胞数为纵坐标，时间(天)为横坐标，绘制生长曲线。
1.4 丙氨瑞林对HEC-1A细胞的抑制率(Inhibitory rate,IR)测定 取24孔培养板，每孔加入含HEC-1A细胞数6×104的细胞悬液1ml。24h后细胞贴壁生长。吸去原培养液，予1ml新培养液(对照组)或用药组丙氨瑞林，终浓度为10-9～10-5mol/L，每个稀释度的丙氨瑞林或新培养液各置4孔。置37℃ 5%CO2培养箱培养。72h后，以胰蛋白酶消化，台盼兰染色计数非染色细胞，并计算抑制率，其公式为：
, http://www.100md.com
IR=(Nn-N)/(Nn-No)×100%
其中No为接种细胞数，N为实验组72h后各浓度下的细胞数，Nn对照组72h后的细胞数。
1.5 统计学检验 t检验。
2 结 果
2.1 HEC-1A细胞生长曲线 HEC-1A细胞在接种后1细胞数(×104)
图1 HEC-1A细胞生长曲线
天内为生长潜伏期，第1天到第5天为指数生长期。第6天后进入平稳期。见图1。
2.2 丙氨瑞林对HEC-1A细胞的抑制率 不同浓度丙氨瑞林与HEC-1A细胞作用72h的细胞数及抑制率见表1a。表1 不同浓度丙氨瑞林对HEC-1A抑制情况(
±s) 药物浓度(mol/L), 百拇医药
对照组
10-9
10-8
10-7
10-6
10-5
细胞数(104)
抑制率(%)
19.6±5.7
0.0
14.2±4.0
, 百拇医药
37.0±26.2
13.5±0.6
38.6±16.7
13.2±3.0
45.3±21.1
11.8±2.6
53.2±26.8
10.8±2.4
56.3±38.0
与对照组比P<0.05
由表1可见，当丙氨瑞林浓度为10-9mol/L时，HEC-1A细胞数与对照组相比明显下降(P<0.05)。随着丙氨瑞林浓度增高，细胞数下降更多，抑制率更高。当丙氨瑞林剂量达10-6mol/L时，抑制率达50%。
, 百拇医药
3 讨 论
GnRH-A对促性腺素的降调节作用以及其后所引起的甾体激素水平的下降，是GnRH-A引入激素依赖性肿瘤治疗的理论基础。它对肿瘤尚具有直接作用的可能[4]。
资料已表明丙氨瑞林对子宫内膜癌有一定的治疗作用，但其作用机理尚不清楚。本实验将不同浓度的丙氨瑞林(10-9～10-5mol/L)与HEC-1A细胞株进行培养72h后，在最低浓度10-9mol/L时即对细胞有抑制作用；且随着浓度增高，抑制作用增强。表明丙氨瑞林对人子宫内膜癌细胞株HEC-1A具有直接抑制作用，且呈剂量依赖关系。
HEC-1A是一种人源性中分化内膜癌细胞株。文献报道，在HEC-1A细胞存在二类GnRH受体，一类是高亲和力、低容量受体(平均解离常数Kd1=5.7±3.8×10-9mol/L细胞，结合容量Bmax1=78±53fmol/106细胞)；一类是低亲和力、高容量受体(Kd2=1.4±0.6×10-6mol/L，Bmax2=21±8pmol/106细胞)[5]。丙氨瑞林对癌细胞的抑制作用可能即通过癌细胞表面受体所致。
, http://www.100md.com
[参考文献]
[1] 张玉泉，曹斌融，周先荣，等.丙氨瑞林治疗子宫内膜癌病人后性激素及有丝分裂指数的变化[J].新药与临床，1996,15(4)∶194.
[2] 张玉泉，曹斌融，郑松国，等.促性腺激素释放激素激动剂对子宫内膜癌neu基因表达的调控[J].中华妇产科杂志，1998,33(2)∶110.
[3] 张玉泉，曹斌融，张惜阴，等.丙氨瑞林对子宫内膜癌ras、myc、及P53基因表达调控的研究[J].南通医学院学报，1999,19(1)∶19.
[4] 张玉泉，曹斌融.GnRH-A作用于卵巢肿瘤的研究[J].国外医学妇产科学分册，1997,24(1)∶27.
[5] Emons G,Schroder B,Ortmann O,et al.High affinity binding and direct antiproliferative effects of luteinizing hormone-releasing hormone analogs in human endometrial cancer cell lines[J]. J Clin Endocrinol Metab,1993,77∶1458.
(1999-10-05收稿), http://www.100md.com