肠道需氧优势菌群分离方法的建立及初步应用
作者：李文建
单位：第三军医大学临床微生物教研室 重庆 630038
关键词：优势菌群；需氧菌群；分离方法；慢性腹泻
摘 要 采用双平板 摘 要 采用双平板(Mac Conkey平板和血液琼脂平板)法进行肠道需氧优势菌群。通过对109例慢性腹泻门诊患者和30例健康成人进行需氧条件下肠道优势菌群分离鉴定，前者73例分离到非大肠埃希菌优势菌群，占67.0%，共22种76株细菌、3株真菌，其中G-杆菌17种55株，G+球、杆菌5种21株，以两种以上非大肠埃希菌为混合优势菌群者6例，占8.2%(6/73)；而后者无一例有非大肠埃希菌优势菌群生长。结果表明，慢性腹泻与肠道需氧优势菌群种类显著相关(P<0.001)。
肠道菌种群很多，主要分为需氧菌群和厌氧菌群。正常成人需氧与厌氧菌群的比例为1：1000，但需氧菌群在肠道中起着重要作用，如大肠埃希菌合成机体必需的维生素K和B族，痢疾杆菌生长引起“痢疾”样腹泻等。变形杆菌、克雷伯菌等可引起婴幼儿腹泻[1,2]，对于成人属于肠道常居菌群。本文通过分离鉴定肠道需氧优势菌群，确定了慢性腹泻(Chronic Diarrhea，CD)与这些常居菌群之间有显著相关性。报告如下：
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基和诊断血清 Mac Conkey及血液琼脂平板按常规方法制备；志贺氏菌、沙门氏菌及致病性大肠埃希菌等诊断血清购自上海市医学化验所。
1.1.2 实验对象 慢性腹泻组：共109例，男33例，女76例，年龄14～73岁，平均年龄35.8岁，腹痛、腹泻6个月以上，病程最长21年，平均5.8年。实验室三次常规采用SS平板进行粪便培养均报告无沙门、志贺菌等致病菌生长。其中临床初诊肠激惹综合征28例，炎症性肠病31例，急性腹泻后转慢性者19例，术后7例，吸收不良综合征4例，未能诊断20例。提前1周禁用抗生素，采集腹泻症状时的粘液或未成形粪便共109份；健康组：共30例，男14例，女16例，平均年龄31.2岁，2周内无腹痛、腹泻、腹涨等症状，同法取粪便30份。
1.2 优势菌群的分离与鉴定 用灭菌接种环挑取新鲜粪便0.1克置1.0ml无菌生理盐水中，振摇数次，使尽量混匀，然后静置3～5分钟，取等量上层菌悬液(5μl)分别均匀划线接种于Mac Conkey及血液琼脂平板上，35℃24～48h后从均匀分布的单个菌落选取1～3种优势生长的菌落数个进行鉴定，鉴定时按常规方法进行。
, 百拇医药
1.3 优势菌群定义标准 菌落数占总菌落数的比例为10%以上。每份标本可有二种以上优势菌群，称为混合优势菌群。
2 结 果
慢性腹泻组分离出以非大肠埃希菌为优势菌者73例，占67.0%(73/109)，共22种76株细菌、3株真菌。其中G-杆菌17种55株，以奇异变形杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、液化沙雷菌、肺炎克雷伯菌为主，占58.0%(32/55)；G+球、杆菌5种21株，以屎链球菌、枯草芽胞杆菌为主，占71.4%(15/21)；其中以两种以上非大肠埃希菌为混合优势菌者6例，占8.2%(6/73)，它们是：藤黄微球菌与真菌、产碱假单胞菌与屎链球菌、弗劳地枸橼酸杆菌与枯草芽胞杆菌、屎链球菌与枯草芽胞杆菌、产气肠杆菌与铜绿假单胞菌、产气肠杆菌与摩根氏变形杆菌。见表1。
表1 109例慢性腹泻患者肠道需氧优势菌群分析情况 菌种
, http://www.100md.com
株数
%
菌种
株数
%
大肠埃希菌
36
33.0
普通变形杆菌
1
0.92
奇异变形杆菌
11
, 百拇医药
10.1
亚利桑那菌
1
0.92
弗劳地枸橼酸杆菌
9
8.28
洋葱假单胞菌
1
0.92
液化沙雷菌
7
6.42
, http://www.100md.com
催产克雷伯菌
1
0.92
肺炎克雷伯菌
5
4.59
恶臭假单胞菌
1
0.92
聚团肠杆菌
3
2.75
臭鼻克雷白菌
, http://www.100md.com
1
0.92
产气肠杆菌
3
2.75
屎链球菌
11
10.1
产碱假单胞菌
3
2.75
细胞菌
3
, 百拇医药
2.75
铜绿假单胞菌
2
1.83
马肠链球菌
1
0.92
摩根变形杆菌
2
1.83
牛链球菌
2
1.83
, 百拇医药
福氏志贺菌
2
1.83
枯草芽胞杆菌
4
3.67
温和气单胞菌
2
1.83
真菌
3
2.75
合计
, 百拇医药
115
105.5
健康组没有分离出以非大肠埃希菌为优势菌者。两组比较，P<0.001。
所分离大肠埃希菌用致病性大肠埃希菌诊断血清(EPEC、ETEC、EIEC)做凝集试验，均不凝集。
3 讨 论
严格控制患者做便培养之前使用抗生素，并留取腹泻症状时的粪便，稀释后分别接种于Mac Conkey及血液琼脂平板，是确保一定条件下各种细菌包括营养要求较高的链球菌等分离成功的关键。粪便稀释后得到的菌悬液接种平板可得到较均匀的单个菌落，Mac Conkey琼脂因含胆盐而抑制G+菌生长，并可根据乳糖利用和H2S生成情况初步分类鉴定临床常见G-杆菌；血平板有利于G+菌初步鉴定及各种细菌分类计数。
, 百拇医药
肠炎或腹泻时，肠道厌氧菌与需氧菌的比例减小，但厌氧菌仍呈优势状态，临床也常以分离到某种需氧致病菌如沙门、志贺菌等作为腹泻的病因之一[3-5]。某些亚临床致病菌(如变形杆菌、克雷伯菌等肠道正常菌群，传统上又称为条件致病菌)主要引起尿路感染、肾盂肾炎等[6,7]，与成人腹泻的关系目前尚无文献报道。
本研究表明，CD与肠道需氧优势菌群之间存在显著相关性(P<0.001)。健康成年人肠道需氧菌群中仅以大肠埃希菌为优势菌群，是健康人肠道的功能菌群和拮抗侵袭菌群；而CD患者多数(67%)肠道优势菌群发生了改变，除正常大肠埃希菌以外的其他菌群如奇异变形杆菌、液化沙雷菌、屎链球菌等单独或者与大肠埃希菌一起成为优势菌群，导致肠道微生态环境改变，刺激肠道粘膜进而引起肠道功能异常，其作用机制值得进一步探讨。肠道需氧优势菌群检验双平板法简便易行，适于临床推广，将为CD的诊断与治疗学研究提供新的途径。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Leug AK,Rebson WL.Evaluating the child with chronic diarrhea.Am Fam Physician.1996 Feb 1;53(2):635-43
2 严靖，蒋晓天，徐元善等.奇异变形杆菌肠炎临床与实验研究.中华儿科杂志.1992；30(1)：16-17
3 侯晓光，张锦坤，代立人.慢性腹泻病人肠道菌群的研究.中华消化杂志.1990；10(1)：22
4 李国雄，任少华.肠道感染细菌的实验室诊断.国外医学临床生物化学与检验学分册.1996；17(4)：170-2
5 Framm SR,Soave R.Afents of dirrhea.Med Clin North Am.1997 Mar;81(2):427-47
, 百拇医药
6 Chippendale GR,Warren JW,Trifillis AL,et al. Internalization of Proteus mirabilis by human renal epithelial cells. Infect Immun.1994 Aug;62(8):3115-21
7 Allison C,Emody L,Coleman N,et al. The role of swarm cell differentiation and multicellular migration in the uropathogenicity of Proteus mirabilis.J Infect Dis.1994 May;169(5):1155-8
(收稿日期：1999-02-04), 百拇医药
单位：第三军医大学临床微生物教研室 重庆 630038
关键词：优势菌群；需氧菌群；分离方法；慢性腹泻
摘 要 采用双平板 摘 要 采用双平板(Mac Conkey平板和血液琼脂平板)法进行肠道需氧优势菌群。通过对109例慢性腹泻门诊患者和30例健康成人进行需氧条件下肠道优势菌群分离鉴定，前者73例分离到非大肠埃希菌优势菌群，占67.0%，共22种76株细菌、3株真菌，其中G-杆菌17种55株，G+球、杆菌5种21株，以两种以上非大肠埃希菌为混合优势菌群者6例，占8.2%(6/73)；而后者无一例有非大肠埃希菌优势菌群生长。结果表明，慢性腹泻与肠道需氧优势菌群种类显著相关(P<0.001)。
肠道菌种群很多，主要分为需氧菌群和厌氧菌群。正常成人需氧与厌氧菌群的比例为1：1000，但需氧菌群在肠道中起着重要作用，如大肠埃希菌合成机体必需的维生素K和B族，痢疾杆菌生长引起“痢疾”样腹泻等。变形杆菌、克雷伯菌等可引起婴幼儿腹泻[1,2]，对于成人属于肠道常居菌群。本文通过分离鉴定肠道需氧优势菌群，确定了慢性腹泻(Chronic Diarrhea，CD)与这些常居菌群之间有显著相关性。报告如下：
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基和诊断血清 Mac Conkey及血液琼脂平板按常规方法制备；志贺氏菌、沙门氏菌及致病性大肠埃希菌等诊断血清购自上海市医学化验所。
1.1.2 实验对象 慢性腹泻组：共109例，男33例，女76例，年龄14～73岁，平均年龄35.8岁，腹痛、腹泻6个月以上，病程最长21年，平均5.8年。实验室三次常规采用SS平板进行粪便培养均报告无沙门、志贺菌等致病菌生长。其中临床初诊肠激惹综合征28例，炎症性肠病31例，急性腹泻后转慢性者19例，术后7例，吸收不良综合征4例，未能诊断20例。提前1周禁用抗生素，采集腹泻症状时的粘液或未成形粪便共109份；健康组：共30例，男14例，女16例，平均年龄31.2岁，2周内无腹痛、腹泻、腹涨等症状，同法取粪便30份。
1.2 优势菌群的分离与鉴定 用灭菌接种环挑取新鲜粪便0.1克置1.0ml无菌生理盐水中，振摇数次，使尽量混匀，然后静置3～5分钟，取等量上层菌悬液(5μl)分别均匀划线接种于Mac Conkey及血液琼脂平板上，35℃24～48h后从均匀分布的单个菌落选取1～3种优势生长的菌落数个进行鉴定，鉴定时按常规方法进行。
, 百拇医药
1.3 优势菌群定义标准 菌落数占总菌落数的比例为10%以上。每份标本可有二种以上优势菌群，称为混合优势菌群。
2 结 果
慢性腹泻组分离出以非大肠埃希菌为优势菌者73例，占67.0%(73/109)，共22种76株细菌、3株真菌。其中G-杆菌17种55株，以奇异变形杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、液化沙雷菌、肺炎克雷伯菌为主，占58.0%(32/55)；G+球、杆菌5种21株，以屎链球菌、枯草芽胞杆菌为主，占71.4%(15/21)；其中以两种以上非大肠埃希菌为混合优势菌者6例，占8.2%(6/73)，它们是：藤黄微球菌与真菌、产碱假单胞菌与屎链球菌、弗劳地枸橼酸杆菌与枯草芽胞杆菌、屎链球菌与枯草芽胞杆菌、产气肠杆菌与铜绿假单胞菌、产气肠杆菌与摩根氏变形杆菌。见表1。
表1 109例慢性腹泻患者肠道需氧优势菌群分析情况 菌种
, http://www.100md.com
株数
%
菌种
株数
%
大肠埃希菌
36
33.0
普通变形杆菌
1
0.92
奇异变形杆菌
11
, 百拇医药
10.1
亚利桑那菌
1
0.92
弗劳地枸橼酸杆菌
9
8.28
洋葱假单胞菌
1
0.92
液化沙雷菌
7
6.42
, http://www.100md.com
催产克雷伯菌
1
0.92
肺炎克雷伯菌
5
4.59
恶臭假单胞菌
1
0.92
聚团肠杆菌
3
2.75
臭鼻克雷白菌
, http://www.100md.com
1
0.92
产气肠杆菌
3
2.75
屎链球菌
11
10.1
产碱假单胞菌
3
2.75
细胞菌
3
, 百拇医药
2.75
铜绿假单胞菌
2
1.83
马肠链球菌
1
0.92
摩根变形杆菌
2
1.83
牛链球菌
2
1.83
, 百拇医药
福氏志贺菌
2
1.83
枯草芽胞杆菌
4
3.67
温和气单胞菌
2
1.83
真菌
3
2.75
合计
, 百拇医药
115
105.5
健康组没有分离出以非大肠埃希菌为优势菌者。两组比较，P<0.001。
所分离大肠埃希菌用致病性大肠埃希菌诊断血清(EPEC、ETEC、EIEC)做凝集试验，均不凝集。
3 讨 论
严格控制患者做便培养之前使用抗生素，并留取腹泻症状时的粪便，稀释后分别接种于Mac Conkey及血液琼脂平板，是确保一定条件下各种细菌包括营养要求较高的链球菌等分离成功的关键。粪便稀释后得到的菌悬液接种平板可得到较均匀的单个菌落，Mac Conkey琼脂因含胆盐而抑制G+菌生长，并可根据乳糖利用和H2S生成情况初步分类鉴定临床常见G-杆菌；血平板有利于G+菌初步鉴定及各种细菌分类计数。
, 百拇医药
肠炎或腹泻时，肠道厌氧菌与需氧菌的比例减小，但厌氧菌仍呈优势状态，临床也常以分离到某种需氧致病菌如沙门、志贺菌等作为腹泻的病因之一[3-5]。某些亚临床致病菌(如变形杆菌、克雷伯菌等肠道正常菌群，传统上又称为条件致病菌)主要引起尿路感染、肾盂肾炎等[6,7]，与成人腹泻的关系目前尚无文献报道。
本研究表明，CD与肠道需氧优势菌群之间存在显著相关性(P<0.001)。健康成年人肠道需氧菌群中仅以大肠埃希菌为优势菌群，是健康人肠道的功能菌群和拮抗侵袭菌群；而CD患者多数(67%)肠道优势菌群发生了改变，除正常大肠埃希菌以外的其他菌群如奇异变形杆菌、液化沙雷菌、屎链球菌等单独或者与大肠埃希菌一起成为优势菌群，导致肠道微生态环境改变，刺激肠道粘膜进而引起肠道功能异常，其作用机制值得进一步探讨。肠道需氧优势菌群检验双平板法简便易行，适于临床推广，将为CD的诊断与治疗学研究提供新的途径。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Leug AK,Rebson WL.Evaluating the child with chronic diarrhea.Am Fam Physician.1996 Feb 1;53(2):635-43
2 严靖，蒋晓天，徐元善等.奇异变形杆菌肠炎临床与实验研究.中华儿科杂志.1992；30(1)：16-17
3 侯晓光，张锦坤，代立人.慢性腹泻病人肠道菌群的研究.中华消化杂志.1990；10(1)：22
4 李国雄，任少华.肠道感染细菌的实验室诊断.国外医学临床生物化学与检验学分册.1996；17(4)：170-2
5 Framm SR,Soave R.Afents of dirrhea.Med Clin North Am.1997 Mar;81(2):427-47
, 百拇医药
6 Chippendale GR,Warren JW,Trifillis AL,et al. Internalization of Proteus mirabilis by human renal epithelial cells. Infect Immun.1994 Aug;62(8):3115-21
7 Allison C,Emody L,Coleman N,et al. The role of swarm cell differentiation and multicellular migration in the uropathogenicity of Proteus mirabilis.J Infect Dis.1994 May;169(5):1155-8
(收稿日期：1999-02-04), 百拇医药