腺病毒介导的人p27kip1基因高表达对大鼠血管平滑肌细胞增殖的抑制作用
作者：潘晓明 章卫平 吴宗贵 曹雪涛
单位：潘晓明(200003 上海，第二军医大学附属长征医院心内科)；吴宗贵(200003 上海，第二军医大学附属长征医院心内科)；章卫平(第二军医大学免疫学教研室)；曹雪涛(第二军医大学免疫学教研室)
关键词：
中华医学杂志000426 p27kip1是近年发现的一个细胞周期负调节物，可以抑制细胞周期由G0/G1期向S期过渡，本实验中我们构建了含人p27kip1cDNA的重组腺病毒载体并将此在体外转染原代培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)，以此观察外源性p27kip1基因导入对VSMC细胞周期及增殖的抑制作用。
一、材料与方法
1.主要试剂：人全长p27kip1 cDNA由纽约Memorial Sloan Kettering Cancer Center Massague博士惠赠；真核表达载体pCIcc、E1区替代的腺病毒载体pAxlcw由日本东京大学Saito博士惠赠；LacZ重组腺病毒(AdLacZ，滴度3×109 pfu/ml)由日本癌研究会肿瘤研究所Hamada博士惠赠。Ⅳ型胶原酶(购自Sigma)，兔抗人p27kip1多抗、辣根过氧化物酶结合的抗兔IgG单克隆抗体及荧光自显影试剂(购自Santa Cruz)。
, 百拇医药
2.人p27kip1重组腺病毒载体的构建与鉴定：从pCMV5-kip1载体中切出含人p27kip1 cDNA的kpnI、BamHI小片段(约690 bp)，将此片段克隆至真核表达载体pCIcc的kpnI、SmaI位点，使其受巨细胞病毒(CMV)启动子的转录调控，所得到的重组子pCI-p27含有CMV-hp27 kip1-SV40 polyA完整的表达单元。将含此表达单元的ClaI小片段与pAxlcw的ClaI大片段连接后，选择左向转录的阳性克隆pAxlcw-CIhp27，纯化后与经E-coT221酶切的Ad5腺病毒DNA-末端肽复合物共转染293细胞，制备人p27kip1重组腺病毒(Adhp27kip1)。重组腺病毒的扩增、鉴定及滴度测定参见文献[1]。以AdLacZ作为对照病毒。
3.大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养：分离雄性SD大鼠(178～225 g)胸主动脉，消化法分离、培养VSMC，鉴定后，3～5代细胞用于实验[2]。
, 百拇医药 4.X-gal组织化学染色：VSMC于6孔培养板中培养24 h后，按不同的重复感染度(Multiplicity of Infection MOI)转染AdLacZ后，继续培养48 h，经0.5%戊二醛/PBS室温固定10 min，加入X-gal染液，37℃孵育3～24 h后观察结果。
5.p27kip1蛋白的Western blot检测：取5.0×105大鼠VSMC培养于6 cm平皿中，待细胞铺至约60%时，用AdLacZ(MOI 40)或Adhp27kip1(MOI 40、20、10)转染后，继续培养24 h，用预冷的RIPA液裂解细胞，离心后，取上清，测蛋白浓度，行Western blot检测[3]。
6.VSMC Adhp27kip1转染后的细胞周期分析：取1.7×105大鼠VSMC培养于6孔板中，待细胞铺至约60%时，用Adhp27kip(MOI 40)或AdLacZ(MOI 40)转染VSMC后，继续培养48 h，用0.1%胰蛋白酶消化后收集细胞，于Citrate溶液中4℃固定过夜，PI染色30 min，FACS(FACScalibur Becton-Dickinson公司)检测，分析细胞周期[4]。
, http://www.100md.com
7.Adhp27kip1体外转染对VSMC细胞增殖的影响：在96孔板中的VSMC转染Adhp27kip(MOI 40)或AdLacZ(MOI 40)，于0、24、48及72 h以四唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，实验重复3次，以
±s表示每个时间点样本的A值。
二、结果
1.人p27kip1重组腺病毒载体的构建与鉴定：首先将人p27kip1 cDNA克隆至pCIcc载体中，使其受CMV启动子转录调控，后接SV40 polyA，再将次表达单元CMV-ph27kip1-SV40 polyA克隆至腺病毒载体pAxlcw，得到的重组体pAxlcw-CIhp27，经COS/TPC共转染后，同源重组产生人p27kip1的重组腺病毒，经酶切鉴定正确后，扩增、纯化得到重组腺病毒载体(3rdseed)滴度为1.7×1011pfu/ml。
, 百拇医药
2.X-gal组织化学染色：用AdLacZ感染VSMC后，通过X-gal染色对腺病毒介导的基因转移率进行评估，结果显示当MOI值20～40时，感染率近90%，表明重组腺病毒体外能有效地介导基因向VSMC转移。
3.人p27kip1重组腺病毒的体外转染大鼠原代VSMC后的p27kip1蛋白表达：人p27kip1蛋白在Adhp27kip1转染的VSMC内高表达，而AdlacZ转染的VSMC内则仅能检测出极低水平的p27kip1蛋白(内源性)表达显示27 000的条带。证明本实验所构建的人p27kip1重组腺病毒可正确地表达人p27kip1的基因并在VSMC内实现其蛋白产物的高表达。
4.外源性p27kip1基因对VSMC细胞周期的影响：人p27kip1重组腺病转染的VSMC(MOI 40)20%血清刺激后，FACS检测显示88%的细胞处于G1期，而LacZ重组腺病毒转染的VSMC 20%血清刺激后仅有62%的细胞处于G1期，表明外源性p27kip1蛋白在VSMC高表达可在G1期抑制细胞周期向S期过渡使VSMC的增殖终止于G1期(图1)。
, 百拇医药
5.外源性p27kip1基因对VSMC增殖的抑制作用：人p27kip1重组腺病毒(MOI 40、20、10)转染的VSMC 20%血清刺激后，24、48及72 h后的A值均明显低于LacZ重组腺病毒转染的VSMC(图2)。表明外源性p27kip1蛋白在VSMC中表达可明显抑制VSMC的增殖并且呈剂量依赖性。
图1 Adhp27kip1体外转染对大鼠VSMC增殖抑制的细胞周期分析
图2 Adhp27kip1体外转染对大鼠VSMC的
增殖抑制作用
三、讨论
动脉粥样硬化及再狭窄是心血管疾病基因治疗的热点，国内已有学者将腺病毒介导的基因转移的方法用于心血管疾病防治研究[5]。VSMC的增殖在动脉粥样硬化及再狭窄的发病过程中起着重要的作用。细胞周期是细胞增殖的最后共同通道，通过对细胞周期的基因调控阻断VSMC的增殖可能是再狭窄防治的一个潜在有效的途径。 p27kip1是目前发现的一个cip/kip家族的CKI，对许多cyclins-CDKs复合物均具有抑制作用，使细胞周期终止于G1期而使细胞停止增殖。在对粥样硬化病变组织中的p27kip1的表达研究发现，与正常组织相比p27kip1的表达明显增高，并与血管重构有关。将其基因导入肿瘤细胞中实现高表达可明显地抑制肿瘤细胞的增殖并可促使肿瘤细胞的凋亡[4]。本实验表明外源性p27kip1在VSMC中高表达可以通过对G1期的负调控抑制VSMC的增殖，有关p27kip1对VSMC的其它生物学行为的影响以及对再狭窄的防治作用正在进一步研究中。
, http://www.100md.com
参考文献
1，章卫平，曹雪涛，滨田洋文.COS/TPC同源重组法高效制备人B7(CD80)重组腺病毒.中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4：6-8.
2，Chang MW, Barr E, Seltzer J, et al. Cytostatic gene therapy for vascular proliferative disorders with a constitutively active form of the retinoblastoma gene product. Science, 1995, 267:518-522.
3，Chen J, Willingham T, Shuford M, et al. Tumor Suppression And Inhibition of Aneuploid Cell Accumulation in Human Brain Tumor Cells by Ectopic Overexpression of the Cyclindependent Kinase Inhibitor p27kip1. J Clin Invest, 1996, 97:1983-1988.
4，Yang Zh-Y, Simari RD, Perkins ND, et al. Role of the p21 cyclin-dependent kinase inhibitor in limiting intimal cell proliferation in response to arterial injury. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:7905-7910.
5，朱甫祥，陈光慧，朱小君，等.兔动脉导入尿激酶原基因重组缺陷型腺病毒对血栓的预防作用.中华医学杂志，1997，77：776-778.
(收稿日期：1999-03-15), http://www.100md.com
单位：潘晓明(200003 上海，第二军医大学附属长征医院心内科)；吴宗贵(200003 上海，第二军医大学附属长征医院心内科)；章卫平(第二军医大学免疫学教研室)；曹雪涛(第二军医大学免疫学教研室)
关键词：
中华医学杂志000426 p27kip1是近年发现的一个细胞周期负调节物，可以抑制细胞周期由G0/G1期向S期过渡，本实验中我们构建了含人p27kip1cDNA的重组腺病毒载体并将此在体外转染原代培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)，以此观察外源性p27kip1基因导入对VSMC细胞周期及增殖的抑制作用。
一、材料与方法
1.主要试剂：人全长p27kip1 cDNA由纽约Memorial Sloan Kettering Cancer Center Massague博士惠赠；真核表达载体pCIcc、E1区替代的腺病毒载体pAxlcw由日本东京大学Saito博士惠赠；LacZ重组腺病毒(AdLacZ，滴度3×109 pfu/ml)由日本癌研究会肿瘤研究所Hamada博士惠赠。Ⅳ型胶原酶(购自Sigma)，兔抗人p27kip1多抗、辣根过氧化物酶结合的抗兔IgG单克隆抗体及荧光自显影试剂(购自Santa Cruz)。
, 百拇医药
2.人p27kip1重组腺病毒载体的构建与鉴定：从pCMV5-kip1载体中切出含人p27kip1 cDNA的kpnI、BamHI小片段(约690 bp)，将此片段克隆至真核表达载体pCIcc的kpnI、SmaI位点，使其受巨细胞病毒(CMV)启动子的转录调控，所得到的重组子pCI-p27含有CMV-hp27 kip1-SV40 polyA完整的表达单元。将含此表达单元的ClaI小片段与pAxlcw的ClaI大片段连接后，选择左向转录的阳性克隆pAxlcw-CIhp27，纯化后与经E-coT221酶切的Ad5腺病毒DNA-末端肽复合物共转染293细胞，制备人p27kip1重组腺病毒(Adhp27kip1)。重组腺病毒的扩增、鉴定及滴度测定参见文献[1]。以AdLacZ作为对照病毒。
3.大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养：分离雄性SD大鼠(178～225 g)胸主动脉，消化法分离、培养VSMC，鉴定后，3～5代细胞用于实验[2]。
, 百拇医药 4.X-gal组织化学染色：VSMC于6孔培养板中培养24 h后，按不同的重复感染度(Multiplicity of Infection MOI)转染AdLacZ后，继续培养48 h，经0.5%戊二醛/PBS室温固定10 min，加入X-gal染液，37℃孵育3～24 h后观察结果。
5.p27kip1蛋白的Western blot检测：取5.0×105大鼠VSMC培养于6 cm平皿中，待细胞铺至约60%时，用AdLacZ(MOI 40)或Adhp27kip1(MOI 40、20、10)转染后，继续培养24 h，用预冷的RIPA液裂解细胞，离心后，取上清，测蛋白浓度，行Western blot检测[3]。
6.VSMC Adhp27kip1转染后的细胞周期分析：取1.7×105大鼠VSMC培养于6孔板中，待细胞铺至约60%时，用Adhp27kip(MOI 40)或AdLacZ(MOI 40)转染VSMC后，继续培养48 h，用0.1%胰蛋白酶消化后收集细胞，于Citrate溶液中4℃固定过夜，PI染色30 min，FACS(FACScalibur Becton-Dickinson公司)检测，分析细胞周期[4]。
, http://www.100md.com
7.Adhp27kip1体外转染对VSMC细胞增殖的影响：在96孔板中的VSMC转染Adhp27kip(MOI 40)或AdLacZ(MOI 40)，于0、24、48及72 h以四唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，实验重复3次，以
±s表示每个时间点样本的A值。二、结果
1.人p27kip1重组腺病毒载体的构建与鉴定：首先将人p27kip1 cDNA克隆至pCIcc载体中，使其受CMV启动子转录调控，后接SV40 polyA，再将次表达单元CMV-ph27kip1-SV40 polyA克隆至腺病毒载体pAxlcw，得到的重组体pAxlcw-CIhp27，经COS/TPC共转染后，同源重组产生人p27kip1的重组腺病毒，经酶切鉴定正确后，扩增、纯化得到重组腺病毒载体(3rdseed)滴度为1.7×1011pfu/ml。
, 百拇医药
2.X-gal组织化学染色：用AdLacZ感染VSMC后，通过X-gal染色对腺病毒介导的基因转移率进行评估，结果显示当MOI值20～40时，感染率近90%，表明重组腺病毒体外能有效地介导基因向VSMC转移。
3.人p27kip1重组腺病毒的体外转染大鼠原代VSMC后的p27kip1蛋白表达：人p27kip1蛋白在Adhp27kip1转染的VSMC内高表达，而AdlacZ转染的VSMC内则仅能检测出极低水平的p27kip1蛋白(内源性)表达显示27 000的条带。证明本实验所构建的人p27kip1重组腺病毒可正确地表达人p27kip1的基因并在VSMC内实现其蛋白产物的高表达。
4.外源性p27kip1基因对VSMC细胞周期的影响：人p27kip1重组腺病转染的VSMC(MOI 40)20%血清刺激后，FACS检测显示88%的细胞处于G1期，而LacZ重组腺病毒转染的VSMC 20%血清刺激后仅有62%的细胞处于G1期，表明外源性p27kip1蛋白在VSMC高表达可在G1期抑制细胞周期向S期过渡使VSMC的增殖终止于G1期(图1)。
, 百拇医药
5.外源性p27kip1基因对VSMC增殖的抑制作用：人p27kip1重组腺病毒(MOI 40、20、10)转染的VSMC 20%血清刺激后，24、48及72 h后的A值均明显低于LacZ重组腺病毒转染的VSMC(图2)。表明外源性p27kip1蛋白在VSMC中表达可明显抑制VSMC的增殖并且呈剂量依赖性。
图1 Adhp27kip1体外转染对大鼠VSMC增殖抑制的细胞周期分析
图2 Adhp27kip1体外转染对大鼠VSMC的
增殖抑制作用
三、讨论
动脉粥样硬化及再狭窄是心血管疾病基因治疗的热点，国内已有学者将腺病毒介导的基因转移的方法用于心血管疾病防治研究[5]。VSMC的增殖在动脉粥样硬化及再狭窄的发病过程中起着重要的作用。细胞周期是细胞增殖的最后共同通道，通过对细胞周期的基因调控阻断VSMC的增殖可能是再狭窄防治的一个潜在有效的途径。 p27kip1是目前发现的一个cip/kip家族的CKI，对许多cyclins-CDKs复合物均具有抑制作用，使细胞周期终止于G1期而使细胞停止增殖。在对粥样硬化病变组织中的p27kip1的表达研究发现，与正常组织相比p27kip1的表达明显增高，并与血管重构有关。将其基因导入肿瘤细胞中实现高表达可明显地抑制肿瘤细胞的增殖并可促使肿瘤细胞的凋亡[4]。本实验表明外源性p27kip1在VSMC中高表达可以通过对G1期的负调控抑制VSMC的增殖，有关p27kip1对VSMC的其它生物学行为的影响以及对再狭窄的防治作用正在进一步研究中。
, http://www.100md.com
参考文献
1，章卫平，曹雪涛，滨田洋文.COS/TPC同源重组法高效制备人B7(CD80)重组腺病毒.中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4：6-8.
2，Chang MW, Barr E, Seltzer J, et al. Cytostatic gene therapy for vascular proliferative disorders with a constitutively active form of the retinoblastoma gene product. Science, 1995, 267:518-522.
3，Chen J, Willingham T, Shuford M, et al. Tumor Suppression And Inhibition of Aneuploid Cell Accumulation in Human Brain Tumor Cells by Ectopic Overexpression of the Cyclindependent Kinase Inhibitor p27kip1. J Clin Invest, 1996, 97:1983-1988.
4，Yang Zh-Y, Simari RD, Perkins ND, et al. Role of the p21 cyclin-dependent kinase inhibitor in limiting intimal cell proliferation in response to arterial injury. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:7905-7910.
5，朱甫祥，陈光慧，朱小君，等.兔动脉导入尿激酶原基因重组缺陷型腺病毒对血栓的预防作用.中华医学杂志，1997，77：776-778.
(收稿日期：1999-03-15), http://www.100md.com