肝硬化大鼠血管平滑肌细胞Gq蛋白信号转导功能的研究
作者：张丕利 张儒 王兴鹏 王国良
单位：200080 上海市第一人民医院消化科
关键词：肝硬化；血管；信号传递
中华医学杂志000718【摘要】目的 为观察肝硬化大鼠动脉血管平滑肌细胞对血管紧张素Ⅱ(AT-Ⅱ)是否存在受体后Gq蛋白信号转导通路的异常。方法 采用总胆管结扎制备大鼠肝硬化模型，分离主动脉血管平滑肌细胞后进行细胞培养，并予免疫组化鉴定。分别采用细胞感应微生理探测系统、三磷酸肌醇(IP3)分析法、Western印迹法检测血管平滑肌细胞AT-Ⅱ受体介导的细胞外液酸化速率(ECAR)、IP3生成、P42/44丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)磷酸化功能。结果 大鼠胆管结扎后4-5周肝硬化形成。AT-Ⅱ可剂量依赖性增强假手术组ECAR及IP3生成，但肝硬化组的ECAR和IP3形成明显降低，肝硬化组中AT-Ⅱ刺激P42/44 MAPK的磷酸化亦显著减少，但2组的表达总量不变。结论 肝硬化时，动脉血管平滑肌细胞对AT-Ⅱ受体介导的Gq蛋白信号转导功能发生障碍，这种异常可能与动脉低反应性有关。
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The impairment of Gq protein-coupled receptor in aortic vascular smooth muscle cells of cirrhotic rats
ZHANG Pili ZHANG Ru WANG Xingpeng et al.
(Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200080, China)
【Abstract】Objective To test angiotensin-Ⅱ (AT-Ⅱ) receptor mediated signal transduction in aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs) of cirrhotic rats. Methods Cirrhosis was induced by bile duct ligation. VSMCs were characterized by immunohistochemistry. Cytosensor microphysiometry,inositol-1,4,5-triphosphates (IP3) assay, and Western blotting analysis were used to evaluate AT-Ⅱ-stimulated cellular responsiveness of VSMCs, such as the extracelluar acidification rate (ECAR),IP3 formation and phosphorylation of P42/44 mitogen-activated protein kinase (MAPK) in sham-operated or cirrhotic rats. Results The secondary biliary cirrhosis was developed 4-5 weeks after operation. Our results showed that ECAR and IP3 formation stimulated by AT-Ⅱ were significantly reduced in the aortic VSMCs from the cirrhotic rats. Furthermore, the maximal p42/44 MAPK phosphorylation stimulated by AT-Ⅱwas also considerably suppressed in the cirrhotic VSMCs in contrast to control cells. Conclusion Our results demonstrated that Gq-coupled receptor signaling pathway stimulated by AT-Ⅱ was severely impaired in aortic VSMCs of cirrhotic rats, which may lead to arterial hyporesponsiveness to vasoconstrictors in cirrhosis.
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【Key words】Cirrhosis； Blood vessels； Signal transduction
肝硬化门脉高压存在的外周动脉扩张是水钠潴留、腹水生成、肝肾综合征等出现的重要原因，其导致的高动力循环对门脉高压的维持起重要作用。有研究发现，外周动脉扩张与肝硬化患者的预后密切相关。这种病理生理变化产生的机理较为复杂，至今尚未完全清楚。已发现动脉对缩血管物质的低反应性是动脉扩张的重要因素之一[1]。本研究通过肝硬化大鼠血管平滑肌细胞AT-Ⅱ受体介导的信号转导功能的检测，了解在该疾病状态下是否存在Gq蛋白信号转导通路的异常。
材料与方法
一、大鼠肝硬化模型的制备
雄性SD大鼠，体重250～300 g，共20只，随机分为2组：假手术组和肝硬化组各10只鼠。采用总胆管结扎术制备大鼠胆汁瘀积性肝硬化模型，大鼠称重后予质量分数为0.01的戊巴比妥钠腹腔内麻醉，腹部正中切口，分离。双结扎总胆管，中间切断。假手术组仅行总胆管分离。术后3日每天予青霉素肌肉注射预防感染。手术后4～5周肝硬化形成后进行下一步实验。
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二、大鼠主动脉血管平滑肌细胞培养与鉴定
大鼠处死后，迅速开胸，取胸主动脉降部，清除周围组织及外膜，于D-Hank's液中剪成1 mm2大小组织。更换D-Hank's液，并加入胶原酶1 mg/ml，弹性蛋白酶0.5 mg/ml，于37℃孵育2～2.5 h，每30 min摇动一次，直至单个细胞出现。取少许细胞用质量分数为0.02的台盼蓝染色了解细胞活性，用含质量分数为0.1的胎牛血清的DMEM悬浮细胞，将细胞按105/ml的密度接种于培养瓶，培养于37℃、质量浓度为0.05的CO2培养箱中。48 h可见细胞贴壁，72 h换新鲜培养液，之后每3天换液一次，约7～10天融合。当原代细胞生长融合成致密单层细胞时，倾去培养液，以D-Hank's液洗涤瓶壁2次，加入胰蛋白酶，于室温中孵育，倒置显微镜观察。每3天换液一次，7～10 d依同法传代。使用第3～10代血管平滑肌细胞进行实验。倒置显微镜观察；抗肌动蛋白免疫细胞化学染色鉴定。
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三、细胞外液酸化速率的检测
采用细胞感应微生理探测系统检测AT-Ⅱ刺激的细胞外液酸化速率(extracellular acidification,ECAR)，评估细胞表面AT-Ⅱ受体介导的细胞内外Na+/H+交换及细胞代谢状况。各组细胞加药前的基础ECAR 值均标定为100%，加药后ECAR 峰值按各自与基础ECAR 值的百分比计算。
四、三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)的检测
细胞贴壁后加入3H-肌醇至终浓度37 kBq/ml(1.0 μCi/ml)标记细胞。加入不同浓度AT-Ⅱ于37℃刺激细胞，最后用预冷的甲酸裂解细胞。经Dowex阴离子交换柱(BIO—RAD)洗脱后收集；收集的洗脱液A、B、C经Beckman Ls6500液闪计数仪计数，以C/A+B+C的比率表示AT-Ⅱ刺激的IP3生成。将基础IP3均标定为100%,加药后的IP3值按各自与基础IP3值的百分比表示。
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五、磷酸化P42/44丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的Western印迹法检测
将细胞按3～4×105/孔铺12孔细胞培养板，加入AT-Ⅱ孵育。加入上样缓冲液裂解细胞，超声细胞粉碎仪对细胞裂解液中的DNA进行剪切。采用改良Lowry法测定蛋白浓度。样品于沸水浴加热离心后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在转移缓冲液中将蛋白转移至硝酸纤维素膜，封闭液封闭。加入特异性一抗(兔抗磷酸化P42/44 MAPK,1∶2 000或抗总P42/44 MAPK,1∶4 000)和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，蛋白条带的检测采用ECL法。封闭液封闭后依上述步骤重复进行免疫印迹。对蛋白条带进行光密度定量分析。
六、统计学分析：所有实验数据均以均数±标准差表示，采用Student's t检验进行统计学分析。
结果
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一、肝硬化模型大鼠的建立及血管平滑肌细胞的鉴定
手术4～5周后，大鼠均存活。所有肝硬化组大鼠均表现为明显的胆汁瘀积性肝硬化，病理切片可见肝脏假小叶形成。倒置显微镜观察及抗肌动蛋白染色，证实为血管平滑肌细胞。
二、AT-Ⅱ刺激的ECAR峰值
AT-Ⅱ在两组细胞中均能增强ECAR，并呈剂量依赖性，反应达平台时所需AT-Ⅱ浓度为10-6 mol/L。当AT-Ⅱ浓度为10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L时，刺激假手术组血管平滑肌细胞的ECAR峰值分别为134.1%±1.3%、149.5%±1.8%、152.9%±2.1%,而肝硬化组仅为109.3%±1.1%、111.1%±1.1%、114.1%±1.5%，明显低于假手术组(t=2.976、3.734、3.830，P<0.05、0.05、0.05，n=6)。但在两组中，AT-Ⅱ刺激的EC50未见明显变化(5.5 nmol/L±0.3 nmol/L vs 4.3 nmol/L±0.3 nmol/L)(图1)。
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图1 AT-Ⅱ刺激的ECAR峰值剂量反应曲线
三、AT-Ⅱ诱导的IP3生成
在假手术组血管平滑肌细胞，不同浓度AT-Ⅱ(10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L)可以明显促进细胞内IP3形成，且呈剂量依赖性，最大刺激可达基础值的10倍(536%±115%, 925%±111%, 1 128%±146%)；而在肝硬化组，不同浓度AT-Ⅱ刺激IP3形成的作用均明显降低，最大刺激仅为基础值的5倍(301%±34%, 469%±53%, 515%±64%)，明显低于对照组(t=2.956、4.055、3.612，P<0.05、0.01、0.05，6只鼠)(图2)。
图2 AT-Ⅱ刺激的血管平滑肌细胞内IP3形成
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四、AT-Ⅱ刺激P42/44 MAPK的磷酸化
由AT-Ⅱ刺激P42/44 MAPK磷酸化的时间-反应曲线和剂量-反应曲线可知，在血管平滑肌细胞，AT-Ⅱ刺激后5～10 min反应达最大，所需的AT-Ⅱ浓度为10-8 mol/L，且AT-Ⅱ刺激后P42/44 MAPK的总量不发生变化。故在以下实验中，将AT-Ⅱ的刺激浓度设定为10-8 mol/L，刺激时间为5 min。假手术组，AT-Ⅱ刺激P42/44 MAPK的磷酸化可达基础值的8倍；相反，肝硬化组仅为3倍，明显低于对照组(t=4.575，P<0.01)。假手术组P42/44 MAPK的总量与肝硬化组相比未见明显变化(图3)。
1.未用药组，2.用药对照组，3.未用药肝硬化组，4.用药肝硬化组；A.磷酸化的P42/44 MAPK Western blot图片，上下两条带分别为42和44两个亚型，B.总P42/44 MAPK的Western blot图片
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图3 AT-Ⅱ刺激肝硬化组与假手术组血管平滑肌
细胞MAPK磷酸化
讨论
由Schrier提出的肝硬化腹水出现的外周动脉扩张学说，能较好地解释肝硬化从代偿期到失代偿，以及发展到肝肾综合征等最后阶段的一系列病理生理变化。研究发现，一些扩血管物质如一氧化氮、前列环素、胰高糖素等合成增加起重要作用。肝硬化时，循环中缩血管物质如血管紧张素Ⅱ、血管加压素、去甲肾上腺素及内皮素-1的水平升高，但仍表现为血管扩张状态，说明血管对缩血管物质的反应性下降[2],这种异常亦参与了外周动脉扩张的发生。缩血管物质须与血管平滑肌细胞表面的特异性受体(均为Gq蛋白偶联受体)结合才能发挥其缩血管作用[3]。因而，受体水平或受体后信号转导通路的损伤均可导致动脉的低反应性。AT-Ⅱ与其特异性受体结合后，通过活化的G蛋白激活磷脂酶C(phospholipase C,PLC),使二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)转变成第二信使，即IP3和二乙酰甘油(diacylglycerol,DAG),进而分别参与细胞内钙的动员和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的活化；AT-Ⅱ也能通过G蛋白的活化促进Na+/H+交换和MAPK的激活，促进细胞内钙浓度及细胞代谢率的增高[4]。以上通路的正常功能与血管平滑肌细胞的收缩密切相关，其损伤均可致动脉低反应性的发生。
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对于肝硬化血管的低敏感性发生机理，有人提出了血管收缩剂作用的受体下调学说，但研究发现受体数目和亲和力均正常。一些研究提示，肝硬化时受体后的异常可能与低反应性有关。有人发现，受体偶联G蛋白亚型Gi、Gs的表达及功能在肝硬化门脉高压时存在异常[5]。本研究结果显示，肝硬化时血管平滑肌细胞表面AT-Ⅱ受体介导的反应均受到明显抑制，而AT-Ⅱ刺激ECAR的EC50值与对照无明显差别，表明肝硬化时激动剂与受体结合的亲和力无明显变化，而受体后Gq蛋白信号转导通路可能存在异常。
本研究结果显示，肝硬化门脉高压大鼠动脉血管平滑肌细胞中，AT-Ⅱ刺激IP3形成的能力明显低于正常，这可能造成细胞内Ca2+动员能力的下降；另外，AT-Ⅱ刺激ECAR显示，在肝硬化状态下，AT-Ⅱ促进Na+/H+交换功能也受到抑制，有报道认为Na+/H+交换可通过促进Na+/Ca2+交换影响外Ca2+内流，并可改变细胞膜的静息电位，而膜的极化状态将影响电压依赖性Ca2+通道的正常开放。因而推测肝硬化时的Na+/H+交换异常可能通过上述途径影响外Ca2+内流，从而影响平滑肌细胞的正常功能。
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AT-Ⅱ、ET-1等内源性血管活性物质不仅有缩血管作用，同时也是有丝分裂原，对血管平滑肌细胞的增殖、分化及蛋白合成起重要调节作用。这些功能亦为细胞正常收缩所必需。G蛋白偶联受体同样具备有丝分裂原信号转导功能。MAPK又称胞外信号调节激酶，是真核细胞中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其底物包括受体、酶等膜蛋白、胞浆蛋白、核骨架蛋白以及多种存在于胞浆或核内的转录调控因子，在细胞的增殖和分化中起十分重要的作用。它具有ERK1、ERK2两种亚型，相对分子质量分别为42 000和44 000。Gq蛋白偶联受体可能通过DAG激活PKC，再由ras或raf激活MAPK。Tazi等[6]的研究已证实，AT-Ⅱ刺激的肝硬化鼠血管平滑肌细胞的增殖与蛋白合成均明显低于正常。而本研究结果显示，肝硬化时，AT-Ⅱ受体介导的动脉血管平滑肌细胞P42/44 MAPK磷酸化的能力明显下降，因而可能导致细胞内基因转录调节障碍，造成细胞增殖以及蛋白合成异常，从而影响细胞的正常功能。
肝硬化时，引起AT-Ⅱ受体介导的信号转导功能异常的分子机制目前尚未阐明。其原因可能与内源性缩血管物质明显升高，血管平滑肌细胞长期暴露于其中，导致了受体后信号转导的脱敏及下调，继而使信号转导功能受损。
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基金项目：上海市卫生局青年基金；上海市卫生局中医药重点科研基金资助
参考文献
1，张丕利，梁扩寰. 全身性高动力循环状态. 见：梁扩寰，李绍白，主编.门静脉高压症.北京：人民军医出版社， 1999:136-145.
2，张丕利，梁扩寰, 张文英，等. 一氧化氮对肝硬变大鼠离体主动脉环收缩的影响.同济医科大学学报,1995，24：279-281.
3，Berridge MJ. Inositol triphosphate and calcium signalling. Nature, 1993,361:315-325.
4，Boston DR, Koyama R, Larrain J, et al. Effects of angiotensin Ⅱ on intracellular calcium and contracture in metabolically inhibited cardiomyocytes. J Pharmacol Exp Ther, 1998,285:716-723.
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5，Ma Z, Miyamoto A, Lee SS. Role of altered beta-adrenoceptor signal transduction in the pathogenesis of cirrhotic cardiomyopathy in rats. Gastroenterology, 1996,110:1191-1198.
6，Tazi KA, Moreau R, Cailmail S, et al. Altered growth and lack of responsivenes to angiotension Ⅱ in aortic vascular smooth muscle cells from cirrhotic rats. Gastroenterology, 1997,112:2065-2072.
收稿日期：1999-08-13, 百拇医药
单位：200080 上海市第一人民医院消化科
关键词：肝硬化；血管；信号传递
中华医学杂志000718【摘要】目的 为观察肝硬化大鼠动脉血管平滑肌细胞对血管紧张素Ⅱ(AT-Ⅱ)是否存在受体后Gq蛋白信号转导通路的异常。方法 采用总胆管结扎制备大鼠肝硬化模型，分离主动脉血管平滑肌细胞后进行细胞培养，并予免疫组化鉴定。分别采用细胞感应微生理探测系统、三磷酸肌醇(IP3)分析法、Western印迹法检测血管平滑肌细胞AT-Ⅱ受体介导的细胞外液酸化速率(ECAR)、IP3生成、P42/44丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)磷酸化功能。结果 大鼠胆管结扎后4-5周肝硬化形成。AT-Ⅱ可剂量依赖性增强假手术组ECAR及IP3生成，但肝硬化组的ECAR和IP3形成明显降低，肝硬化组中AT-Ⅱ刺激P42/44 MAPK的磷酸化亦显著减少，但2组的表达总量不变。结论 肝硬化时，动脉血管平滑肌细胞对AT-Ⅱ受体介导的Gq蛋白信号转导功能发生障碍，这种异常可能与动脉低反应性有关。
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The impairment of Gq protein-coupled receptor in aortic vascular smooth muscle cells of cirrhotic rats
ZHANG Pili ZHANG Ru WANG Xingpeng et al.
(Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200080, China)
【Abstract】Objective To test angiotensin-Ⅱ (AT-Ⅱ) receptor mediated signal transduction in aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs) of cirrhotic rats. Methods Cirrhosis was induced by bile duct ligation. VSMCs were characterized by immunohistochemistry. Cytosensor microphysiometry,inositol-1,4,5-triphosphates (IP3) assay, and Western blotting analysis were used to evaluate AT-Ⅱ-stimulated cellular responsiveness of VSMCs, such as the extracelluar acidification rate (ECAR),IP3 formation and phosphorylation of P42/44 mitogen-activated protein kinase (MAPK) in sham-operated or cirrhotic rats. Results The secondary biliary cirrhosis was developed 4-5 weeks after operation. Our results showed that ECAR and IP3 formation stimulated by AT-Ⅱ were significantly reduced in the aortic VSMCs from the cirrhotic rats. Furthermore, the maximal p42/44 MAPK phosphorylation stimulated by AT-Ⅱwas also considerably suppressed in the cirrhotic VSMCs in contrast to control cells. Conclusion Our results demonstrated that Gq-coupled receptor signaling pathway stimulated by AT-Ⅱ was severely impaired in aortic VSMCs of cirrhotic rats, which may lead to arterial hyporesponsiveness to vasoconstrictors in cirrhosis.
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【Key words】Cirrhosis； Blood vessels； Signal transduction
肝硬化门脉高压存在的外周动脉扩张是水钠潴留、腹水生成、肝肾综合征等出现的重要原因，其导致的高动力循环对门脉高压的维持起重要作用。有研究发现，外周动脉扩张与肝硬化患者的预后密切相关。这种病理生理变化产生的机理较为复杂，至今尚未完全清楚。已发现动脉对缩血管物质的低反应性是动脉扩张的重要因素之一[1]。本研究通过肝硬化大鼠血管平滑肌细胞AT-Ⅱ受体介导的信号转导功能的检测，了解在该疾病状态下是否存在Gq蛋白信号转导通路的异常。
材料与方法
一、大鼠肝硬化模型的制备
雄性SD大鼠，体重250～300 g，共20只，随机分为2组：假手术组和肝硬化组各10只鼠。采用总胆管结扎术制备大鼠胆汁瘀积性肝硬化模型，大鼠称重后予质量分数为0.01的戊巴比妥钠腹腔内麻醉，腹部正中切口，分离。双结扎总胆管，中间切断。假手术组仅行总胆管分离。术后3日每天予青霉素肌肉注射预防感染。手术后4～5周肝硬化形成后进行下一步实验。
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二、大鼠主动脉血管平滑肌细胞培养与鉴定
大鼠处死后，迅速开胸，取胸主动脉降部，清除周围组织及外膜，于D-Hank's液中剪成1 mm2大小组织。更换D-Hank's液，并加入胶原酶1 mg/ml，弹性蛋白酶0.5 mg/ml，于37℃孵育2～2.5 h，每30 min摇动一次，直至单个细胞出现。取少许细胞用质量分数为0.02的台盼蓝染色了解细胞活性，用含质量分数为0.1的胎牛血清的DMEM悬浮细胞，将细胞按105/ml的密度接种于培养瓶，培养于37℃、质量浓度为0.05的CO2培养箱中。48 h可见细胞贴壁，72 h换新鲜培养液，之后每3天换液一次，约7～10天融合。当原代细胞生长融合成致密单层细胞时，倾去培养液，以D-Hank's液洗涤瓶壁2次，加入胰蛋白酶，于室温中孵育，倒置显微镜观察。每3天换液一次，7～10 d依同法传代。使用第3～10代血管平滑肌细胞进行实验。倒置显微镜观察；抗肌动蛋白免疫细胞化学染色鉴定。
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三、细胞外液酸化速率的检测
采用细胞感应微生理探测系统检测AT-Ⅱ刺激的细胞外液酸化速率(extracellular acidification,ECAR)，评估细胞表面AT-Ⅱ受体介导的细胞内外Na+/H+交换及细胞代谢状况。各组细胞加药前的基础ECAR 值均标定为100%，加药后ECAR 峰值按各自与基础ECAR 值的百分比计算。
四、三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)的检测
细胞贴壁后加入3H-肌醇至终浓度37 kBq/ml(1.0 μCi/ml)标记细胞。加入不同浓度AT-Ⅱ于37℃刺激细胞，最后用预冷的甲酸裂解细胞。经Dowex阴离子交换柱(BIO—RAD)洗脱后收集；收集的洗脱液A、B、C经Beckman Ls6500液闪计数仪计数，以C/A+B+C的比率表示AT-Ⅱ刺激的IP3生成。将基础IP3均标定为100%,加药后的IP3值按各自与基础IP3值的百分比表示。
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五、磷酸化P42/44丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的Western印迹法检测
将细胞按3～4×105/孔铺12孔细胞培养板，加入AT-Ⅱ孵育。加入上样缓冲液裂解细胞，超声细胞粉碎仪对细胞裂解液中的DNA进行剪切。采用改良Lowry法测定蛋白浓度。样品于沸水浴加热离心后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在转移缓冲液中将蛋白转移至硝酸纤维素膜，封闭液封闭。加入特异性一抗(兔抗磷酸化P42/44 MAPK,1∶2 000或抗总P42/44 MAPK,1∶4 000)和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，蛋白条带的检测采用ECL法。封闭液封闭后依上述步骤重复进行免疫印迹。对蛋白条带进行光密度定量分析。
六、统计学分析：所有实验数据均以均数±标准差表示，采用Student's t检验进行统计学分析。
结果
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一、肝硬化模型大鼠的建立及血管平滑肌细胞的鉴定
手术4～5周后，大鼠均存活。所有肝硬化组大鼠均表现为明显的胆汁瘀积性肝硬化，病理切片可见肝脏假小叶形成。倒置显微镜观察及抗肌动蛋白染色，证实为血管平滑肌细胞。
二、AT-Ⅱ刺激的ECAR峰值
AT-Ⅱ在两组细胞中均能增强ECAR，并呈剂量依赖性，反应达平台时所需AT-Ⅱ浓度为10-6 mol/L。当AT-Ⅱ浓度为10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L时，刺激假手术组血管平滑肌细胞的ECAR峰值分别为134.1%±1.3%、149.5%±1.8%、152.9%±2.1%,而肝硬化组仅为109.3%±1.1%、111.1%±1.1%、114.1%±1.5%，明显低于假手术组(t=2.976、3.734、3.830，P<0.05、0.05、0.05，n=6)。但在两组中，AT-Ⅱ刺激的EC50未见明显变化(5.5 nmol/L±0.3 nmol/L vs 4.3 nmol/L±0.3 nmol/L)(图1)。
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图1 AT-Ⅱ刺激的ECAR峰值剂量反应曲线
三、AT-Ⅱ诱导的IP3生成
在假手术组血管平滑肌细胞，不同浓度AT-Ⅱ(10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L)可以明显促进细胞内IP3形成，且呈剂量依赖性，最大刺激可达基础值的10倍(536%±115%, 925%±111%, 1 128%±146%)；而在肝硬化组，不同浓度AT-Ⅱ刺激IP3形成的作用均明显降低，最大刺激仅为基础值的5倍(301%±34%, 469%±53%, 515%±64%)，明显低于对照组(t=2.956、4.055、3.612，P<0.05、0.01、0.05，6只鼠)(图2)。
图2 AT-Ⅱ刺激的血管平滑肌细胞内IP3形成
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四、AT-Ⅱ刺激P42/44 MAPK的磷酸化
由AT-Ⅱ刺激P42/44 MAPK磷酸化的时间-反应曲线和剂量-反应曲线可知，在血管平滑肌细胞，AT-Ⅱ刺激后5～10 min反应达最大，所需的AT-Ⅱ浓度为10-8 mol/L，且AT-Ⅱ刺激后P42/44 MAPK的总量不发生变化。故在以下实验中，将AT-Ⅱ的刺激浓度设定为10-8 mol/L，刺激时间为5 min。假手术组，AT-Ⅱ刺激P42/44 MAPK的磷酸化可达基础值的8倍；相反，肝硬化组仅为3倍，明显低于对照组(t=4.575，P<0.01)。假手术组P42/44 MAPK的总量与肝硬化组相比未见明显变化(图3)。
1.未用药组，2.用药对照组，3.未用药肝硬化组，4.用药肝硬化组；A.磷酸化的P42/44 MAPK Western blot图片，上下两条带分别为42和44两个亚型，B.总P42/44 MAPK的Western blot图片
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图3 AT-Ⅱ刺激肝硬化组与假手术组血管平滑肌
细胞MAPK磷酸化
讨论
由Schrier提出的肝硬化腹水出现的外周动脉扩张学说，能较好地解释肝硬化从代偿期到失代偿，以及发展到肝肾综合征等最后阶段的一系列病理生理变化。研究发现，一些扩血管物质如一氧化氮、前列环素、胰高糖素等合成增加起重要作用。肝硬化时，循环中缩血管物质如血管紧张素Ⅱ、血管加压素、去甲肾上腺素及内皮素-1的水平升高，但仍表现为血管扩张状态，说明血管对缩血管物质的反应性下降[2],这种异常亦参与了外周动脉扩张的发生。缩血管物质须与血管平滑肌细胞表面的特异性受体(均为Gq蛋白偶联受体)结合才能发挥其缩血管作用[3]。因而，受体水平或受体后信号转导通路的损伤均可导致动脉的低反应性。AT-Ⅱ与其特异性受体结合后，通过活化的G蛋白激活磷脂酶C(phospholipase C,PLC),使二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)转变成第二信使，即IP3和二乙酰甘油(diacylglycerol,DAG),进而分别参与细胞内钙的动员和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的活化；AT-Ⅱ也能通过G蛋白的活化促进Na+/H+交换和MAPK的激活，促进细胞内钙浓度及细胞代谢率的增高[4]。以上通路的正常功能与血管平滑肌细胞的收缩密切相关，其损伤均可致动脉低反应性的发生。
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对于肝硬化血管的低敏感性发生机理，有人提出了血管收缩剂作用的受体下调学说，但研究发现受体数目和亲和力均正常。一些研究提示，肝硬化时受体后的异常可能与低反应性有关。有人发现，受体偶联G蛋白亚型Gi、Gs的表达及功能在肝硬化门脉高压时存在异常[5]。本研究结果显示，肝硬化时血管平滑肌细胞表面AT-Ⅱ受体介导的反应均受到明显抑制，而AT-Ⅱ刺激ECAR的EC50值与对照无明显差别，表明肝硬化时激动剂与受体结合的亲和力无明显变化，而受体后Gq蛋白信号转导通路可能存在异常。
本研究结果显示，肝硬化门脉高压大鼠动脉血管平滑肌细胞中，AT-Ⅱ刺激IP3形成的能力明显低于正常，这可能造成细胞内Ca2+动员能力的下降；另外，AT-Ⅱ刺激ECAR显示，在肝硬化状态下，AT-Ⅱ促进Na+/H+交换功能也受到抑制，有报道认为Na+/H+交换可通过促进Na+/Ca2+交换影响外Ca2+内流，并可改变细胞膜的静息电位，而膜的极化状态将影响电压依赖性Ca2+通道的正常开放。因而推测肝硬化时的Na+/H+交换异常可能通过上述途径影响外Ca2+内流，从而影响平滑肌细胞的正常功能。
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AT-Ⅱ、ET-1等内源性血管活性物质不仅有缩血管作用，同时也是有丝分裂原，对血管平滑肌细胞的增殖、分化及蛋白合成起重要调节作用。这些功能亦为细胞正常收缩所必需。G蛋白偶联受体同样具备有丝分裂原信号转导功能。MAPK又称胞外信号调节激酶，是真核细胞中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其底物包括受体、酶等膜蛋白、胞浆蛋白、核骨架蛋白以及多种存在于胞浆或核内的转录调控因子，在细胞的增殖和分化中起十分重要的作用。它具有ERK1、ERK2两种亚型，相对分子质量分别为42 000和44 000。Gq蛋白偶联受体可能通过DAG激活PKC，再由ras或raf激活MAPK。Tazi等[6]的研究已证实，AT-Ⅱ刺激的肝硬化鼠血管平滑肌细胞的增殖与蛋白合成均明显低于正常。而本研究结果显示，肝硬化时，AT-Ⅱ受体介导的动脉血管平滑肌细胞P42/44 MAPK磷酸化的能力明显下降，因而可能导致细胞内基因转录调节障碍，造成细胞增殖以及蛋白合成异常，从而影响细胞的正常功能。
肝硬化时，引起AT-Ⅱ受体介导的信号转导功能异常的分子机制目前尚未阐明。其原因可能与内源性缩血管物质明显升高，血管平滑肌细胞长期暴露于其中，导致了受体后信号转导的脱敏及下调，继而使信号转导功能受损。
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基金项目：上海市卫生局青年基金；上海市卫生局中医药重点科研基金资助
参考文献
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收稿日期：1999-08-13, 百拇医药