新城疫病毒疫苗对小鼠S18肉瘤抑瘤作用的实验研究
作者：苏雁欣 陈英准 康向华 李树祥
单位：苏雁欣(哈尔滨医科大学附属第二医院 门诊超声科)； 陈英准(哈尔滨医科大学 病理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 康向华(哈尔滨医科大学 病理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 李树祥(哈尔滨医科大学 病理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：新城疫病毒疫苗；S180肉瘤模型；坏死；病理改变；鼠
哈尔滨医科大学学报000107 摘 要：目的 研究新城疫病毒疫苗对小鼠S180肉瘤细胞的作用。方法 采用昆明种小鼠皮下移植性S180肉瘤模型，Ⅰ组瘤体内注射PBS液，Ⅱ、Ⅲ组瘤体内注射NDV疫苗(Ⅱ组在接种S180肉瘤前1周皮下注射NDV疫苗)，分2次解剖取材后光镜、电镜观察。结果 NDV颗粒附着在瘤细胞表面，瘤组织大片坏死，坏死周边部有炎细胞浸润，并可见凋亡小体。Ⅱ、Ⅲ组瘤体逐渐减小，有2只Ⅱ组小鼠瘤块完全消失，生存期延长。其他脏器无明显病理改变。结论 新城疫病毒疫苗对小鼠S180肉瘤细胞有较强的杀伤作用，抑制肿瘤的生长，安全性大。
, http://www.100md.com
分类号：R730.54 文献标识码：A
文章编号：1000-1905(2000)01-0015-03
Experimental studies on the antineoplastic effect of Newcastle disease
virus vaccine on murine S180 sarcoma
SU Yan-xin CHEN Ying-zhun KANG Xiang-hua et al
(Department of Ultrasonics,The Second Affiliated Hospital,Harbin Medical
, 百拇医药 University,Harbin 150086,China)
Abstract：Objective To investigate the effect of Newcastle disease virus(NDV) vaccine on murine S180 sarcoma.Methods NDV vaccine was injected into the murine subcutaneously transplanted S180 sarcoma,the mice of Ⅱ group were injected with NDV vaccine subcutaneously a week before the S180 sarcoma was implanted.After treatment,the changes of the tumor cells were detected by the light and electron microscopy.Results Newcastle disease virions adhered to the surface of the tumor cells,and there were plenty of necrosis and infiltration of inflammatory cells around the regions of necrosis.The tumors of 2 mice in Ⅱ group disappeared completely.The organs did not undergo pathological changes.Conclusion NDV vaccine can kill the murine S180 sarcoma cells and suppress the growth of the tumors.It is safe and effective.
, 百拇医药
Key words：Newcastle disease virus vaccine;S180 sarcoma model;necrosis;pathological change;mouse▲
新城疫病毒疫苗(NDV)抗肿瘤是一种肿瘤生物疗法。NDV在肿瘤细胞中存活、复制，抑制肿瘤细胞蛋白质合成，杀伤肿瘤细胞。同时，病毒又作为生物反应调节剂(BRM)中的一种，能显著增强机体免疫功能，增强机体抗瘤免疫潜力，为治疗肿瘤提供了又一新途径。本实验从细胞学、组织病理学及超微结构病理学等方面证实了NDV疫苗对肿瘤细胞存在显著杀伤效应，初步探讨其抗肿瘤的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：昆明种小鼠38只，雌雄各半，5～6周龄，重(20±2)g。由黑龙江省肿瘤研究所提供。
, 百拇医药
1.1.2 瘤株：小鼠皮下移植性S180肉瘤，由黑龙江省肿瘤研究所动物室提供。
1.1.3 使用疫苗：新城疫病毒(NDV)减毒活疫苗，病毒效价1∶1280。由哈尔滨兽医研究所提供。
1.2 实验方法
随机取13只小鼠(即Ⅱ组)，每只动物腹部皮下接种0.3ml用PBS稀释10倍的NDV。1周后，小鼠S180肉瘤细胞腹腔液，用Hank's液先后稀释为5×106个瘤细胞/0.1ml，于全部小鼠背部皮下接种瘤细胞稀释液0.2ml/只。待至1周左右，肿瘤长至1.0cm×1.0cm大小时，将小鼠按随机原则分成：Ⅰ组12只，用0.1mol/L PBS液治疗；Ⅱ组13只，在接种细胞前1周已注射过NDV者，再用1∶10NDV治疗；Ⅲ组13只，用1∶10NDV治疗。Ⅱ、Ⅲ组均在瘤体内注射0.2mlNDV，Ⅰ组瘤体内注射0.2mlPBS液，隔日注射，共3次。末次注射1周后，每组各处死5只动物并自移植瘤部位取材，组织学标本用10%甲醛溶液固定，常规制片，HE染色。电镜标本用3%戊二醛和1%锇酸双重固定，EPON812包埋，常规制作电镜标本，H-600A型透射电镜观察。
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剩余23只小鼠留待作生存期观察，随着小鼠死亡，即做解剖取材，包括瘤块和各脏器如心、肝、脾、肺、肾、脑等，做光镜观察。同时记录死亡时间、体重、瘤重、瘤径(包括肿瘤的长、宽、高)及转移情况。2个月后Ⅱ组有2只小鼠存活，其余全部死亡，对该2只小鼠进行解剖取材。
计算：公式[1]：
2 结果
2.1 第1次处死动物和取材结果(末次注射后1周)
2.1.1 大体改变：Ⅰ组移植瘤大致呈圆形，灰白色，质地均匀，随着生长时间延长而增大。Ⅱ、Ⅲ组大体所见与Ⅰ组相类似，只是在注射部位可见出血坏死。
2.1.2 光镜下改变：Ⅰ组肿瘤细胞不规则，有明显异型性，呈多边形，核大，核浆比例失调，可见病理性核分裂相。Ⅱ、Ⅲ组肿瘤细胞可见坏死区，核浓缩，碎裂，核膜溶解，细胞破裂甚至消失。Ⅱ组坏死区比Ⅲ组大，连成大片坏死区，且坏死组织周围有一些炎细胞浸润。各脏器包括心、肝、肺、脾、肾和脑等。实验组均未见明显病理改变。
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2.1.3 透射电镜下改变：Ⅰ组肿瘤细胞呈多形性，核大，核仁明显，常染色质均匀分布于核内，异染色质聚集在核膜周边，核内有的可见假性包涵物。Ⅱ、Ⅲ组可见NDV病毒颗粒附着在肿瘤细胞表面上，以囊膜与胞膜相互融合的作用进入细胞，脱壳消失。可见线粒体嵴肿胀、空泡变性，甚至消失。内质网扩张。肿瘤细胞缩小，核染色质凝集，核固缩，核膜凹陷，产生凋亡，细胞结构消失，并可见炎细胞浸润在坏死区周围(见图1、2)。
图1 Ⅲ组感染NDN12天，线粒体嵴消失，肿胀空泡变性，可见成熟病毒粒子形成
图2 Ⅱ组感染NDN12天，肿瘤细胞大量坏死，核染色质凝集，核膜扩张、溶解，坏死区周围有炎细胞浸润
2.2 第2次动物取材结果(末次注射后1周至60天内)
, 百拇医药
2.2.1 大体所见：Ⅰ组肿瘤块随时间延长而渐增大，可见散在出血坏死区，Ⅱ、Ⅲ组随时间延长而逐渐减小，Ⅱ组更为明显，且有2只小鼠瘤块完全消失，生长情况良好。
2.2.2 光镜下所见：小鼠Ⅱ、Ⅲ组各脏器如心、肝、脾、肺、肾和脑均未见明显病理改变。
2.2.3 各组小鼠瘤重、瘤体积和抑瘤率的情况分析见附表。
附表 NDV疫苗对S180肉瘤模型小鼠的杀伤效果 分组
鼠数
瘤重(g)(
±s)
瘤体积(cm3)(±s)
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瘤重抑瘤率(%)
Ⅰ组
7
4.34±0.38
8.24±2.44
Ⅱ组
8
0.613±0.41
0.12±0.08
85.89
Ⅲ组
8
1.3±0.25
, 百拇医药
1.57±1.13
70.07
瘤重和瘤体积方面，Ⅱ组与Ⅰ组之间，Ⅲ组与Ⅰ组之间均有显著差异，P值均小于0.01。3 讨论
本实验中，Ⅱ、Ⅲ组小鼠瘤块均明显减小，光、电镜下可见大量肿瘤细胞坏死，透射电镜下可见NDV病毒颗粒吸附在肉瘤细胞表面上，与Liebrich[2]报道的相符。间接免疫荧光检测[3]，NDV感染的肿瘤细胞表面有NDV抗原的表达，导入病毒基因，使肿瘤细胞膜表达病毒抗原，可以由细胞毒性淋巴细胞引起免疫损伤，或者由相应抗体吸附于细胞表面后，发生补体介导的溶细胞反应，或者吸引吞噬细胞或由杀伤细胞(K cell)发挥杀伤作用。光、电镜下可见坏死灶周围大量炎细胞浸润，说明肿瘤细胞获得了很强的免疫原性，诱导机体产生免疫反应，最终杀灭肿瘤。
Ⅱ组小鼠瘤块明显减小，有2只小鼠瘤块完全消失，生存期延长，抑瘤率亦比Ⅲ组高。Von Hoegen[4]证实，治疗前先用病毒启动其免疫系统，使其对TATA特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的频数增加，细胞毒性抗瘤活性明显增强。NDV局部瘤内注射，可能是瘤内异种化的作用，NDV的作用并非简单类似BCG等的免疫作用[5]，而是依赖NDV与瘤细胞的相互作用，NDV的核衣壳从瘤细胞表面获得囊膜，NDV从瘤细胞中以“芽生”的方式释放出来，作为抗原，刺激机体产生抗体，该抗体既可与NDV作用，也可与瘤细胞作用，杀伤肿瘤细胞，而且这种作用是持续性的。
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本实验选用的NDV减毒活疫苗，为Ⅳ系苗(弱毒)，La Sota株，无致病力。本实验证明了NDV疫苗对小鼠心、肝、肺、脾、肾和脑等器官无病毒感染及明显病理改变。Heicappell证实[6]，NDV只在感染的肿瘤细胞内完成一个复制周期，不感染其他正常细胞。Rommelaere证实，某些细胞基因对正常细胞生长并非必需，但对病毒却十分必需。正常细胞中这些基因表达的缺乏引起病毒生命周期若干步骤之一的阻断，也就防止了病毒对于正常的成熟机体产生明显病变。
综上所述，新城疫病毒减毒活疫苗对肿瘤细胞有较强的杀伤作用，抑制肿瘤的生长，不损伤正常组织器官，安全性大，方法简便易行，治疗恶性肿瘤具有一定的优越性，可进一步广泛应用。■
作者简介：苏雁欣(1968-)，女，主治医师，硕士
参考文献：
[1]Liebrich W,Schlag P,Manasterski M,et al.Invitro and clinical characterisation of a NDV-modified autologous tumor cell vaccine for treatment of collorectal cancer patients[J].Eur J Cancer,1991,27(6):703.
, 百拇医药
[2]乔健，等.新城鸡瘟病毒瘤苗对小鼠宫颈癌U14主动免疫防治效应的研究[J].中国免疫学杂志，1993，11(9)：65.
[3]Von Hoegen P,et al.Modification of Tumor cells by a low dose of NDV.Febmentation of the tumor-specific T cell response[J].Eur J Immunol,1988,18:1159.
[4]Kazunori S,et al.A new morphologically characterized cell wall preparation (whole peptidoglycan) from bifidobacterium infantis with a higher efficacy on the regressin of an established tumor in mice[J].Cancer Res,1985,45:1300.
, 百拇医药
[5]Rutten VP,Klein WR,De Jeng WA,et al.Immunotherapy of bovine ocular squamous cell carcinoma by repeated intralesional injections of live bacillus calmette-cuerin (BCG) or BCG cell walls[J].Cancer Immunol Immunother,1991,34(3):186.
[6]Heicappell R,et al.Prevention of metastatic spread by Postoperative immunotherapy with virally modified autologous tumor cells.I.parameters for optimal therapeutic effects[J].Int J Cancer,1986,37:569.
收稿日期：1999-06-22, 百拇医药
单位：苏雁欣(哈尔滨医科大学附属第二医院 门诊超声科)； 陈英准(哈尔滨医科大学 病理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 康向华(哈尔滨医科大学 病理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)； 李树祥(哈尔滨医科大学 病理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：新城疫病毒疫苗；S180肉瘤模型；坏死；病理改变；鼠
哈尔滨医科大学学报000107 摘 要：目的 研究新城疫病毒疫苗对小鼠S180肉瘤细胞的作用。方法 采用昆明种小鼠皮下移植性S180肉瘤模型，Ⅰ组瘤体内注射PBS液，Ⅱ、Ⅲ组瘤体内注射NDV疫苗(Ⅱ组在接种S180肉瘤前1周皮下注射NDV疫苗)，分2次解剖取材后光镜、电镜观察。结果 NDV颗粒附着在瘤细胞表面，瘤组织大片坏死，坏死周边部有炎细胞浸润，并可见凋亡小体。Ⅱ、Ⅲ组瘤体逐渐减小，有2只Ⅱ组小鼠瘤块完全消失，生存期延长。其他脏器无明显病理改变。结论 新城疫病毒疫苗对小鼠S180肉瘤细胞有较强的杀伤作用，抑制肿瘤的生长，安全性大。
, http://www.100md.com
分类号：R730.54 文献标识码：A
文章编号：1000-1905(2000)01-0015-03
Experimental studies on the antineoplastic effect of Newcastle disease
virus vaccine on murine S180 sarcoma
SU Yan-xin CHEN Ying-zhun KANG Xiang-hua et al
(Department of Ultrasonics,The Second Affiliated Hospital,Harbin Medical
, 百拇医药 University,Harbin 150086,China)
Abstract：Objective To investigate the effect of Newcastle disease virus(NDV) vaccine on murine S180 sarcoma.Methods NDV vaccine was injected into the murine subcutaneously transplanted S180 sarcoma,the mice of Ⅱ group were injected with NDV vaccine subcutaneously a week before the S180 sarcoma was implanted.After treatment,the changes of the tumor cells were detected by the light and electron microscopy.Results Newcastle disease virions adhered to the surface of the tumor cells,and there were plenty of necrosis and infiltration of inflammatory cells around the regions of necrosis.The tumors of 2 mice in Ⅱ group disappeared completely.The organs did not undergo pathological changes.Conclusion NDV vaccine can kill the murine S180 sarcoma cells and suppress the growth of the tumors.It is safe and effective.
, 百拇医药
Key words：Newcastle disease virus vaccine;S180 sarcoma model;necrosis;pathological change;mouse▲
新城疫病毒疫苗(NDV)抗肿瘤是一种肿瘤生物疗法。NDV在肿瘤细胞中存活、复制，抑制肿瘤细胞蛋白质合成，杀伤肿瘤细胞。同时，病毒又作为生物反应调节剂(BRM)中的一种，能显著增强机体免疫功能，增强机体抗瘤免疫潜力，为治疗肿瘤提供了又一新途径。本实验从细胞学、组织病理学及超微结构病理学等方面证实了NDV疫苗对肿瘤细胞存在显著杀伤效应，初步探讨其抗肿瘤的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：昆明种小鼠38只，雌雄各半，5～6周龄，重(20±2)g。由黑龙江省肿瘤研究所提供。
, 百拇医药
1.1.2 瘤株：小鼠皮下移植性S180肉瘤，由黑龙江省肿瘤研究所动物室提供。
1.1.3 使用疫苗：新城疫病毒(NDV)减毒活疫苗，病毒效价1∶1280。由哈尔滨兽医研究所提供。
1.2 实验方法
随机取13只小鼠(即Ⅱ组)，每只动物腹部皮下接种0.3ml用PBS稀释10倍的NDV。1周后，小鼠S180肉瘤细胞腹腔液，用Hank's液先后稀释为5×106个瘤细胞/0.1ml，于全部小鼠背部皮下接种瘤细胞稀释液0.2ml/只。待至1周左右，肿瘤长至1.0cm×1.0cm大小时，将小鼠按随机原则分成：Ⅰ组12只，用0.1mol/L PBS液治疗；Ⅱ组13只，在接种细胞前1周已注射过NDV者，再用1∶10NDV治疗；Ⅲ组13只，用1∶10NDV治疗。Ⅱ、Ⅲ组均在瘤体内注射0.2mlNDV，Ⅰ组瘤体内注射0.2mlPBS液，隔日注射，共3次。末次注射1周后，每组各处死5只动物并自移植瘤部位取材，组织学标本用10%甲醛溶液固定，常规制片，HE染色。电镜标本用3%戊二醛和1%锇酸双重固定，EPON812包埋，常规制作电镜标本，H-600A型透射电镜观察。
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剩余23只小鼠留待作生存期观察，随着小鼠死亡，即做解剖取材，包括瘤块和各脏器如心、肝、脾、肺、肾、脑等，做光镜观察。同时记录死亡时间、体重、瘤重、瘤径(包括肿瘤的长、宽、高)及转移情况。2个月后Ⅱ组有2只小鼠存活，其余全部死亡，对该2只小鼠进行解剖取材。
计算：公式[1]：
2 结果
2.1 第1次处死动物和取材结果(末次注射后1周)
2.1.1 大体改变：Ⅰ组移植瘤大致呈圆形，灰白色，质地均匀，随着生长时间延长而增大。Ⅱ、Ⅲ组大体所见与Ⅰ组相类似，只是在注射部位可见出血坏死。
2.1.2 光镜下改变：Ⅰ组肿瘤细胞不规则，有明显异型性，呈多边形，核大，核浆比例失调，可见病理性核分裂相。Ⅱ、Ⅲ组肿瘤细胞可见坏死区，核浓缩，碎裂，核膜溶解，细胞破裂甚至消失。Ⅱ组坏死区比Ⅲ组大，连成大片坏死区，且坏死组织周围有一些炎细胞浸润。各脏器包括心、肝、肺、脾、肾和脑等。实验组均未见明显病理改变。
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2.1.3 透射电镜下改变：Ⅰ组肿瘤细胞呈多形性，核大，核仁明显，常染色质均匀分布于核内，异染色质聚集在核膜周边，核内有的可见假性包涵物。Ⅱ、Ⅲ组可见NDV病毒颗粒附着在肿瘤细胞表面上，以囊膜与胞膜相互融合的作用进入细胞，脱壳消失。可见线粒体嵴肿胀、空泡变性，甚至消失。内质网扩张。肿瘤细胞缩小，核染色质凝集，核固缩，核膜凹陷，产生凋亡，细胞结构消失，并可见炎细胞浸润在坏死区周围(见图1、2)。
图1 Ⅲ组感染NDN12天，线粒体嵴消失，肿胀空泡变性，可见成熟病毒粒子形成
图2 Ⅱ组感染NDN12天，肿瘤细胞大量坏死，核染色质凝集，核膜扩张、溶解，坏死区周围有炎细胞浸润
2.2 第2次动物取材结果(末次注射后1周至60天内)
, 百拇医药
2.2.1 大体所见：Ⅰ组肿瘤块随时间延长而渐增大，可见散在出血坏死区，Ⅱ、Ⅲ组随时间延长而逐渐减小，Ⅱ组更为明显，且有2只小鼠瘤块完全消失，生长情况良好。
2.2.2 光镜下所见：小鼠Ⅱ、Ⅲ组各脏器如心、肝、脾、肺、肾和脑均未见明显病理改变。
2.2.3 各组小鼠瘤重、瘤体积和抑瘤率的情况分析见附表。
附表 NDV疫苗对S180肉瘤模型小鼠的杀伤效果 分组
鼠数
瘤重(g)(
±s)瘤体积(cm3)(
±s), http://www.100md.com
瘤重抑瘤率(%)
Ⅰ组
7
4.34±0.38
8.24±2.44
Ⅱ组
8
0.613±0.41
0.12±0.08
85.89
Ⅲ组
8
1.3±0.25
, 百拇医药
1.57±1.13
70.07
瘤重和瘤体积方面，Ⅱ组与Ⅰ组之间，Ⅲ组与Ⅰ组之间均有显著差异，P值均小于0.01。3 讨论
本实验中，Ⅱ、Ⅲ组小鼠瘤块均明显减小，光、电镜下可见大量肿瘤细胞坏死，透射电镜下可见NDV病毒颗粒吸附在肉瘤细胞表面上，与Liebrich[2]报道的相符。间接免疫荧光检测[3]，NDV感染的肿瘤细胞表面有NDV抗原的表达，导入病毒基因，使肿瘤细胞膜表达病毒抗原，可以由细胞毒性淋巴细胞引起免疫损伤，或者由相应抗体吸附于细胞表面后，发生补体介导的溶细胞反应，或者吸引吞噬细胞或由杀伤细胞(K cell)发挥杀伤作用。光、电镜下可见坏死灶周围大量炎细胞浸润，说明肿瘤细胞获得了很强的免疫原性，诱导机体产生免疫反应，最终杀灭肿瘤。
Ⅱ组小鼠瘤块明显减小，有2只小鼠瘤块完全消失，生存期延长，抑瘤率亦比Ⅲ组高。Von Hoegen[4]证实，治疗前先用病毒启动其免疫系统，使其对TATA特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的频数增加，细胞毒性抗瘤活性明显增强。NDV局部瘤内注射，可能是瘤内异种化的作用，NDV的作用并非简单类似BCG等的免疫作用[5]，而是依赖NDV与瘤细胞的相互作用，NDV的核衣壳从瘤细胞表面获得囊膜，NDV从瘤细胞中以“芽生”的方式释放出来，作为抗原，刺激机体产生抗体，该抗体既可与NDV作用，也可与瘤细胞作用，杀伤肿瘤细胞，而且这种作用是持续性的。
, http://www.100md.com
本实验选用的NDV减毒活疫苗，为Ⅳ系苗(弱毒)，La Sota株，无致病力。本实验证明了NDV疫苗对小鼠心、肝、肺、脾、肾和脑等器官无病毒感染及明显病理改变。Heicappell证实[6]，NDV只在感染的肿瘤细胞内完成一个复制周期，不感染其他正常细胞。Rommelaere证实，某些细胞基因对正常细胞生长并非必需，但对病毒却十分必需。正常细胞中这些基因表达的缺乏引起病毒生命周期若干步骤之一的阻断，也就防止了病毒对于正常的成熟机体产生明显病变。
综上所述，新城疫病毒减毒活疫苗对肿瘤细胞有较强的杀伤作用，抑制肿瘤的生长，不损伤正常组织器官，安全性大，方法简便易行，治疗恶性肿瘤具有一定的优越性，可进一步广泛应用。■
作者简介：苏雁欣(1968-)，女，主治医师，硕士
参考文献：
[1]Liebrich W,Schlag P,Manasterski M,et al.Invitro and clinical characterisation of a NDV-modified autologous tumor cell vaccine for treatment of collorectal cancer patients[J].Eur J Cancer,1991,27(6):703.
, 百拇医药
[2]乔健，等.新城鸡瘟病毒瘤苗对小鼠宫颈癌U14主动免疫防治效应的研究[J].中国免疫学杂志，1993，11(9)：65.
[3]Von Hoegen P,et al.Modification of Tumor cells by a low dose of NDV.Febmentation of the tumor-specific T cell response[J].Eur J Immunol,1988,18:1159.
[4]Kazunori S,et al.A new morphologically characterized cell wall preparation (whole peptidoglycan) from bifidobacterium infantis with a higher efficacy on the regressin of an established tumor in mice[J].Cancer Res,1985,45:1300.
, 百拇医药
[5]Rutten VP,Klein WR,De Jeng WA,et al.Immunotherapy of bovine ocular squamous cell carcinoma by repeated intralesional injections of live bacillus calmette-cuerin (BCG) or BCG cell walls[J].Cancer Immunol Immunother,1991,34(3):186.
[6]Heicappell R,et al.Prevention of metastatic spread by Postoperative immunotherapy with virally modified autologous tumor cells.I.parameters for optimal therapeutic effects[J].Int J Cancer,1986,37:569.
收稿日期：1999-06-22, 百拇医药