野生型p53基因转移对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响
作者：张龙友 张宝春 刘迎秋
单位：张龙友(北京天坛医院急诊科，北京，100050)； 张宝春(北京天坛医院急诊科，北京，100050)； 刘迎秋(北京天坛医院急诊科，北京，100050)
关键词：p53基因；细胞凋亡；血管平滑肌细胞；反转录病毒载体
华西医学000122 摘 要：目的：血管平均滑肌细胞的凋亡在球囊损伤后30分钟内即已经开始，用基因转移的方法加速这一过程是控制再狭窄的途径之一。选择野生型p53作为目的基因，观察其对血管平滑肌细胞生长及凋亡的影响。方法：构建了野生型p53基因重组反转录病毒载体pLXSN-p53。重组载体转染培养的大鼠主动脉平滑肌细胞，测定转染效率和p53基因的表达，用细胞存活曲线、流式细胞仪和DNA“ladder”法检测了细胞生长和凋亡状况。结果：采用pLXSN-p53转染培养的大鼠血管平滑肌，转染效率接近100%，转染后的宿主细胞内可检测到外源性p53mRNA和外源性p53蛋白，表明基因在平滑肌细胞内获得了良好的表达。用流式细胞仪检测发现在转染后24小时，宿主细胞G1期数量明显增多，S期细胞数量减少，而且有大量的亚二倍体细胞，表现为G1期抑制和细胞凋亡。采用经典的DNA“ladder”法检测发现，宿主细胞大量凋亡。结论：以上结果说明外源性p53蛋白的表达可明显促进平滑肌细胞的凋亡。
, http://www.100md.com
分类号：R329.2+8；Q255 文献标识码：A
文章编号：1002-0179(2000)01-0044-03
The Influence of Wild-p53 Gene Transfer on Apoptosis of Cells of Vascular Smooth Muscle of Rat
ZHANG Long-you ZHANG Bao-chun LIU Yin-qiu
(Department of Emergency,Beijing Tiantan Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100050)
Abstract：Apoptotic process has been reported in ballooninjury of rat carotid arteries induced as early as 30 minutes after injury.Acceleration of the process by gene transfer may be an alternative to inhibit vascular restenosis after balloon angioplasty.The efficiency of wild-p53 gene transfer on cells of vascular smooth muscle was assessed.Recombinant wild-p53 gene retrovirus vector pLXSN-p53 was constructed and transferred into cultured vascular smooth muscle cells of rat.The expression of p53 gene was detected by RT-PCR and immunohistochemical techniques.Cell growth and apoptosis were tested by survival curve,cell counting,cytometric and DNA“ladder”.The results showed that wild-p53 gene can be effectively transferred into the VSMC by retrovirus vector.mRNA and protein of transferred wild p53 gone were detected within the transfected cells.Expression of wild p53 gene could prominently promote the apoptosis of cultured cells of vascular smooth muscle.
, 百拇医药
Key words：Wild-p53 gene;Apoptosis;Vascular smooth muscle cells;Retrovirus vector▲
应用基因转移的方法，使特定的凋亡相关基因在细胞中过度表达，可以通过凋亡机制达到局部调节细胞数量的作用，这已经在肿瘤基因治疗的研究中获得成功。本文应用反转录病毒载体将野生型p53基因导入培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)观察其对细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 p53基因重组反转录病毒载体的构建：用Bam H1切下质粒PC53—SN3中的p53cDNA片断，插入至反转录病毒载体pLXSN〔1〕的Bam H1克隆位点，酶切法筛选阳性克隆及鉴定插入方向。所得正向插入的重组反转录载体名为pLXSN-p53，图1是质粒pLXSN-p53的结构示意。
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图1：重组反转录病毒载体pLXSN-p53结构示意图。LTR：长末端重复序列：PA∶多聚腺苷酸信号；SV∶SV40启动子序列；p53∶插入的p53cDNA序列；Neo∶新霉素抗性基因。
1.2 重组反转录病毒载体的包装与测定〔2〕：重组pLXSN-p53用德国Boehringer MannheimGmbH公司生产的DOTAP Liposomol Transfection Reagent转染PA317细胞，G418筛选抗性克隆，3T3测定病毒滴度，选取滴度较高克隆继续培养，获取假病毒上清用于转染VSMC。
1.3 细胞培养与鉴定：①VSMC，取200—250克SD大鼠，解剖胸主动脉，刮去内皮，中层组织剪碎，贴块培养，用单克隆抗平滑肌α-actin(美国Sigma化学公司)行免疫组化证实为VSMC，传至第4—10代用于实验。②VSMC、PA317细胞、3T3细胞采用DMEM—10%FBS(标明的特殊情况下例外)、5%CO2、37℃条件进行培养。
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表1.p53基因转移后有血清培养24小时的血管平滑肌细胞周期 分组
细胞周期
G1
S
G2/M
亚二倍体及其他
VSMC
48
28
23
1
VSMC-pLXSN
, http://www.100md.com 50
26
22
1
VSMC-p53
49
27
21
2
注：VSMC，血管平滑肌细胞；VSMC-pLXSN，转入空载体后的VSMC；VSMC-p53，转入p53基因后的VSMC。表2.p53基因转移后无血清培养24小时的血管平滑肌细胞周期 分组
细胞周期
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G1
S
G2/M
亚二倍体及其他
VSMC
50
29
19
1
VSMC-pLXSN
54
31
11
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1
VSMC-p53
66
15
16
13
注：VSMC，血管平滑肌细胞；VSMC-pLXSN，转入空载体后的VSMC；VSMC-p53，转入p53基因后的VSMC。
1.4 外源性p53基因在VSMC中表达的检测：①mRNA水平，用反转录PCR(RT—PCR)法检测，方法见“1.7”。②蛋白水平，采用Triton Biosciences,CA公司生产的p53蛋白检测试剂盒(免疫组化法)检测细胞内p53蛋白的水平。
1.5 细胞存活曲线：VSMC1：4传代，分为4组，用pLXSN-p53和pLXSN假病毒各转染两组，其中两组转染后以无血清培养，另两组更换含10%FBS的DMEM培养，然后接种24孔细胞培养板，每组接种12孔，每孔105，生长至半融合，每孔分别于第0、24、36、48小时进行胎盘兰染色，每一时间段每一组计数3孔细胞，取平均值。
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1.6 流式细胞仪计数检测细胞生长周期：取约106细胞，75%冰乙醇固定，RNase A(20μg/μl)消化30分钟，碘化丙啶(PI,10μg/μl)染色45分钟，流式细胞仪计数5000个细胞。
1.7 快速RT—PCR分析：取正常VSMC和克隆细胞各约106，离心，用PBS冲洗一次，用水悬浮，在液氮中放置15分钟，取出离心，立即65℃水浴2分钟，上清9μl加入至反转录体系，37℃反应1小时，72℃水浴5分钟后，取1μl用于20μlPCR反应体系。PCR以质粒为模板作阳性对照。以用于反转录的RNA为模板作阴性对照，预变性20秒，94℃变性10秒，55℃退火10秒，72℃延伸25秒，30个循环后延伸60秒，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。所用引物由北京医科大学人民医院中心实验室合成，序列如下：
p53cDNA正义引物：5’-TCTGTGACTTGCACGTACTC-3’
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p53cDNA反义引物：5’-CACGGATCTGAAGGGTGAAA-3’
1.8 细胞DNA片段化分析：采用DNA“ladder”作为凋亡指标。VSMC经pLXSN-p53假病毒转染后，分别于第24、36和48小时取5×106用细胞裂解液裂解，以10%SDS、RNase A、蛋白酶K分别处理，1%琼脂糖电泳，照相，只用pLXSN假病毒转染的VSMC同法操作作为对照。
图2：pLXSN-p53酶切图谱。M：λDNA/Hind Ⅲ Marker；1：pLXSN+Bam H1；2：pLXSN-p53+Stu Ⅰ；3：pLXSN-p53+Bam H1。
2 结果
2.1 野生型p53反转录病毒表达载体的结构：将p53 cDNA插入在pLXSN的Bam H1克隆位沸点后，用Bam H1和Stul分别酶切证实连接正确(图2)pLXSN-p53经PA317细胞包装后，所得假病毒悬液转染3T3细胞测定病毒滴度，结果显示滴度在6×104～1×105之间，选取滴度高的克隆继续扩增，获得假病毒悬液转染VSMC。用G418筛选表明转染效率接近100%。
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图3：pLXSN-p53基因转染后用RT-PCR分析VSMC中mRNA的表达。M：pBR322/Mspl Marker；2：阴性对照；3：VSMC-pLXSN-p53；4：VSMC；5：阳性对照。
2.2 外源性p53在VSMC中的表达：VSMC经pLXSN-p53假病毒转染后24小时，应用RT—PCR法检测到明显p53mRNA，对照组未检测到(图3)；应用单克隆抗体在转染的细胞中检测到p53蛋白，未转染的VSMC中没有检测到，与mRNA检测结果相同，表明转入的p53基因获得了良好表达。
2.3 外源性p53对VSMC生长的影响：与对照组相比，采用有血清培养，转染后24小时细胞计数并无明显差异。转染后采用无血清培养，在第24、36和48小时计数。VSMC—p53组死亡率明显增加(图4)。第24小时流式细胞仪检测发现，VSMC组和VSMC—pLXSN组比较，VSMC-p53组G1期细胞数明显增加，S期细胞数量减少，而且有大量亚二倍体细胞，表现为G1期抑制和部分细胞凋亡(表1，表2)。
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图4.VSMC转染p53后，培养48小时的细胞存活情况，a.有血清培养，b.无血清培养。
图5.VSMC转染p53后无血清培养24、36和48小时检测染色体DNA。1：pLXSN-p53转染24小时；2：pLXSN-p53转染36小时；3：pLXSN-p53转染24小时；1’：pLXSN转染24小时；2’：pLXSN转染36小时；3’：pLXSN转染48小时；M：pBR322/Hae Ⅲ分子量标准；S：VSMC对照；P：pLXSN-p53转染36小时，有血清培养；L：pLXSN转染36小时，有血清培养。
2.4 VSMC凋亡检测：假病毒感染VSMC以后，采用经典的DNA“ladder”法于第24、36和48小时检测，VSMC-p53组可见明显细胞凋亡(图5)。VSMC-pLXSN组未见细胞凋亡。这一结果与上述流式细胞仪检测的结果相符合。
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3 讨论
凋亡是一种生理性的细胞死亡形式，用于调节细胞的数量和许多组织的结构、清除不需要的和有潜在危险性的细胞，它的发生是通过体内特定基因(凋亡相关基因)的激活和失活而启动的。p53作为编码核磷酸化蛋白的基因是一个已经明确的在正常细胞分化和细胞致瘤性转化中起关键作用的基因。当DNA损伤时，野生型p53会被迅速诱导，使受损细胞停滞于G1期，DNA可以在细胞复制之前得以修复。
1991年，Yonish Rouash〔2〕等通过基因转染的方法将一种温度敏感型p53突变体导入骨髓瘤细胞系M1细胞，结果发现有野生型p53表达的细胞克隆发生了细胞凋亡，而突变型p53表达的细胞克隆则不发生。Ryan〔3〕等发现野生型p53只处于G1期的细胞才能触发其凋亡，如果当时细胞处于S期，则必须等待细胞进入下一个G1期才能起作用。此后又有许多实验研究证实野生型p53可以诱导肿瘤细胞的凋亡。
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正常细胞情形有所不同，Bennett〔4〕等发现，野生型p53不诱发正常培养的条件下的VSMC细胞凋亡。本实验中我们先采用正常条件培养平滑肌细胞，检测结果表明p53基因转入并不诱导平滑肌细胞凋亡，与Bennett结果相同。而转染后采用无血清培养，由于生长因子缺乏，细胞处于停滞状态，应用流式细胞仪检测和DNA“ladder”分析均显示外源p53基因的过度表达明显促进平滑肌细胞的凋亡。
事实上，动脉狭窄处经球囊扩张后30分钟即已经存在VSMS的凋亡〔5〕，但此后的一段时间内VSMC的增生速度高于凋亡速度，细胞的数量增加，血管壁增厚，这是产生再狭窄的重要机制之一。加速细胞的凋亡和/或抑制细胞的增生是有效控制再狭窄的基本途径。本实验的结果揭示可以采用基因转移的方法加速细胞的凋亡，从而达到局部调节细胞数量的目的，这为控制再狭窄提供了一种可能的选择。
应用反转录病毒载体作为基因转移的工具进行实验，是考虑到反转录病毒载体只能转染正处于有丝分裂状态的细胞〔7〕，对于介入部位周围的正常细胞无影响。本实验也显示pLXSN的转染效率很高，适合于进行深入研究。■
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参考文献：
[1] Miller AD and Rosman GJ.Improved retroviral vectors for gene transfer and expression.BioTechniques 1989;7∶980.
[2] Cepko C.Introduction of a retrovirus vector into a packaging cell line.In Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,et al.edit,A SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY.Green Publishing Associates and John Wiley & Sons,New York,1992.
[3] Yonis-rouach E,Resnitaky D.et al.Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukemic cells that is inhibited by IL-6.Nature 1991;352∶345～347.
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[4] Ryan J.J.,Damish R.,et al.Cell cycle analysis of p53-induced cell death in murine crythroleukemia cells.Mol.Cell Biol.1993;13∶711～719.
[5] M.R.Benett,G.I.Evan,S.M.Schwartz.Apoptosis of rat vascular smooth muscle cells is regulated by p53-dependent and-independent pathways.Circ Res.1995;77∶266～273.
[6] Periman H,Mailard L,Krasinski K,et al.Evidence for the rapid onset of apoptosis in medial smooth muscle cells after balloon injury.Circulation 1997;95∶981～987.
[7] Miller DG,Adam MA,Miller AD.Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection.Mol.Cell Biol.1990;10∶4239～4242.
收稿日期：1999-09-30, http://www.100md.com
单位：张龙友(北京天坛医院急诊科，北京，100050)； 张宝春(北京天坛医院急诊科，北京，100050)； 刘迎秋(北京天坛医院急诊科，北京，100050)
关键词：p53基因；细胞凋亡；血管平滑肌细胞；反转录病毒载体
华西医学000122 摘 要：目的：血管平均滑肌细胞的凋亡在球囊损伤后30分钟内即已经开始，用基因转移的方法加速这一过程是控制再狭窄的途径之一。选择野生型p53作为目的基因，观察其对血管平滑肌细胞生长及凋亡的影响。方法：构建了野生型p53基因重组反转录病毒载体pLXSN-p53。重组载体转染培养的大鼠主动脉平滑肌细胞，测定转染效率和p53基因的表达，用细胞存活曲线、流式细胞仪和DNA“ladder”法检测了细胞生长和凋亡状况。结果：采用pLXSN-p53转染培养的大鼠血管平滑肌，转染效率接近100%，转染后的宿主细胞内可检测到外源性p53mRNA和外源性p53蛋白，表明基因在平滑肌细胞内获得了良好的表达。用流式细胞仪检测发现在转染后24小时，宿主细胞G1期数量明显增多，S期细胞数量减少，而且有大量的亚二倍体细胞，表现为G1期抑制和细胞凋亡。采用经典的DNA“ladder”法检测发现，宿主细胞大量凋亡。结论：以上结果说明外源性p53蛋白的表达可明显促进平滑肌细胞的凋亡。
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分类号：R329.2+8；Q255 文献标识码：A
文章编号：1002-0179(2000)01-0044-03
The Influence of Wild-p53 Gene Transfer on Apoptosis of Cells of Vascular Smooth Muscle of Rat
ZHANG Long-you ZHANG Bao-chun LIU Yin-qiu
(Department of Emergency,Beijing Tiantan Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100050)
Abstract：Apoptotic process has been reported in ballooninjury of rat carotid arteries induced as early as 30 minutes after injury.Acceleration of the process by gene transfer may be an alternative to inhibit vascular restenosis after balloon angioplasty.The efficiency of wild-p53 gene transfer on cells of vascular smooth muscle was assessed.Recombinant wild-p53 gene retrovirus vector pLXSN-p53 was constructed and transferred into cultured vascular smooth muscle cells of rat.The expression of p53 gene was detected by RT-PCR and immunohistochemical techniques.Cell growth and apoptosis were tested by survival curve,cell counting,cytometric and DNA“ladder”.The results showed that wild-p53 gene can be effectively transferred into the VSMC by retrovirus vector.mRNA and protein of transferred wild p53 gone were detected within the transfected cells.Expression of wild p53 gene could prominently promote the apoptosis of cultured cells of vascular smooth muscle.
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Key words：Wild-p53 gene;Apoptosis;Vascular smooth muscle cells;Retrovirus vector▲
应用基因转移的方法，使特定的凋亡相关基因在细胞中过度表达，可以通过凋亡机制达到局部调节细胞数量的作用，这已经在肿瘤基因治疗的研究中获得成功。本文应用反转录病毒载体将野生型p53基因导入培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)观察其对细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 p53基因重组反转录病毒载体的构建：用Bam H1切下质粒PC53—SN3中的p53cDNA片断，插入至反转录病毒载体pLXSN〔1〕的Bam H1克隆位点，酶切法筛选阳性克隆及鉴定插入方向。所得正向插入的重组反转录载体名为pLXSN-p53，图1是质粒pLXSN-p53的结构示意。
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图1：重组反转录病毒载体pLXSN-p53结构示意图。LTR：长末端重复序列：PA∶多聚腺苷酸信号；SV∶SV40启动子序列；p53∶插入的p53cDNA序列；Neo∶新霉素抗性基因。
1.2 重组反转录病毒载体的包装与测定〔2〕：重组pLXSN-p53用德国Boehringer MannheimGmbH公司生产的DOTAP Liposomol Transfection Reagent转染PA317细胞，G418筛选抗性克隆，3T3测定病毒滴度，选取滴度较高克隆继续培养，获取假病毒上清用于转染VSMC。
1.3 细胞培养与鉴定：①VSMC，取200—250克SD大鼠，解剖胸主动脉，刮去内皮，中层组织剪碎，贴块培养，用单克隆抗平滑肌α-actin(美国Sigma化学公司)行免疫组化证实为VSMC，传至第4—10代用于实验。②VSMC、PA317细胞、3T3细胞采用DMEM—10%FBS(标明的特殊情况下例外)、5%CO2、37℃条件进行培养。
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表1.p53基因转移后有血清培养24小时的血管平滑肌细胞周期 分组
细胞周期
G1
S
G2/M
亚二倍体及其他
VSMC
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28
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1
VSMC-pLXSN
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VSMC-p53
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注：VSMC，血管平滑肌细胞；VSMC-pLXSN，转入空载体后的VSMC；VSMC-p53，转入p53基因后的VSMC。表2.p53基因转移后无血清培养24小时的血管平滑肌细胞周期 分组
细胞周期
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亚二倍体及其他
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VSMC-p53
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注：VSMC，血管平滑肌细胞；VSMC-pLXSN，转入空载体后的VSMC；VSMC-p53，转入p53基因后的VSMC。
1.4 外源性p53基因在VSMC中表达的检测：①mRNA水平，用反转录PCR(RT—PCR)法检测，方法见“1.7”。②蛋白水平，采用Triton Biosciences,CA公司生产的p53蛋白检测试剂盒(免疫组化法)检测细胞内p53蛋白的水平。
1.5 细胞存活曲线：VSMC1：4传代，分为4组，用pLXSN-p53和pLXSN假病毒各转染两组，其中两组转染后以无血清培养，另两组更换含10%FBS的DMEM培养，然后接种24孔细胞培养板，每组接种12孔，每孔105，生长至半融合，每孔分别于第0、24、36、48小时进行胎盘兰染色，每一时间段每一组计数3孔细胞，取平均值。
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1.6 流式细胞仪计数检测细胞生长周期：取约106细胞，75%冰乙醇固定，RNase A(20μg/μl)消化30分钟，碘化丙啶(PI,10μg/μl)染色45分钟，流式细胞仪计数5000个细胞。
1.7 快速RT—PCR分析：取正常VSMC和克隆细胞各约106，离心，用PBS冲洗一次，用水悬浮，在液氮中放置15分钟，取出离心，立即65℃水浴2分钟，上清9μl加入至反转录体系，37℃反应1小时，72℃水浴5分钟后，取1μl用于20μlPCR反应体系。PCR以质粒为模板作阳性对照。以用于反转录的RNA为模板作阴性对照，预变性20秒，94℃变性10秒，55℃退火10秒，72℃延伸25秒，30个循环后延伸60秒，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。所用引物由北京医科大学人民医院中心实验室合成，序列如下：
p53cDNA正义引物：5’-TCTGTGACTTGCACGTACTC-3’
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p53cDNA反义引物：5’-CACGGATCTGAAGGGTGAAA-3’
1.8 细胞DNA片段化分析：采用DNA“ladder”作为凋亡指标。VSMC经pLXSN-p53假病毒转染后，分别于第24、36和48小时取5×106用细胞裂解液裂解，以10%SDS、RNase A、蛋白酶K分别处理，1%琼脂糖电泳，照相，只用pLXSN假病毒转染的VSMC同法操作作为对照。
图2：pLXSN-p53酶切图谱。M：λDNA/Hind Ⅲ Marker；1：pLXSN+Bam H1；2：pLXSN-p53+Stu Ⅰ；3：pLXSN-p53+Bam H1。
2 结果
2.1 野生型p53反转录病毒表达载体的结构：将p53 cDNA插入在pLXSN的Bam H1克隆位沸点后，用Bam H1和Stul分别酶切证实连接正确(图2)pLXSN-p53经PA317细胞包装后，所得假病毒悬液转染3T3细胞测定病毒滴度，结果显示滴度在6×104～1×105之间，选取滴度高的克隆继续扩增，获得假病毒悬液转染VSMC。用G418筛选表明转染效率接近100%。
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图3：pLXSN-p53基因转染后用RT-PCR分析VSMC中mRNA的表达。M：pBR322/Mspl Marker；2：阴性对照；3：VSMC-pLXSN-p53；4：VSMC；5：阳性对照。
2.2 外源性p53在VSMC中的表达：VSMC经pLXSN-p53假病毒转染后24小时，应用RT—PCR法检测到明显p53mRNA，对照组未检测到(图3)；应用单克隆抗体在转染的细胞中检测到p53蛋白，未转染的VSMC中没有检测到，与mRNA检测结果相同，表明转入的p53基因获得了良好表达。
2.3 外源性p53对VSMC生长的影响：与对照组相比，采用有血清培养，转染后24小时细胞计数并无明显差异。转染后采用无血清培养，在第24、36和48小时计数。VSMC—p53组死亡率明显增加(图4)。第24小时流式细胞仪检测发现，VSMC组和VSMC—pLXSN组比较，VSMC-p53组G1期细胞数明显增加，S期细胞数量减少，而且有大量亚二倍体细胞，表现为G1期抑制和部分细胞凋亡(表1，表2)。
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图4.VSMC转染p53后，培养48小时的细胞存活情况，a.有血清培养，b.无血清培养。
图5.VSMC转染p53后无血清培养24、36和48小时检测染色体DNA。1：pLXSN-p53转染24小时；2：pLXSN-p53转染36小时；3：pLXSN-p53转染24小时；1’：pLXSN转染24小时；2’：pLXSN转染36小时；3’：pLXSN转染48小时；M：pBR322/Hae Ⅲ分子量标准；S：VSMC对照；P：pLXSN-p53转染36小时，有血清培养；L：pLXSN转染36小时，有血清培养。
2.4 VSMC凋亡检测：假病毒感染VSMC以后，采用经典的DNA“ladder”法于第24、36和48小时检测，VSMC-p53组可见明显细胞凋亡(图5)。VSMC-pLXSN组未见细胞凋亡。这一结果与上述流式细胞仪检测的结果相符合。
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3 讨论
凋亡是一种生理性的细胞死亡形式，用于调节细胞的数量和许多组织的结构、清除不需要的和有潜在危险性的细胞，它的发生是通过体内特定基因(凋亡相关基因)的激活和失活而启动的。p53作为编码核磷酸化蛋白的基因是一个已经明确的在正常细胞分化和细胞致瘤性转化中起关键作用的基因。当DNA损伤时，野生型p53会被迅速诱导，使受损细胞停滞于G1期，DNA可以在细胞复制之前得以修复。
1991年，Yonish Rouash〔2〕等通过基因转染的方法将一种温度敏感型p53突变体导入骨髓瘤细胞系M1细胞，结果发现有野生型p53表达的细胞克隆发生了细胞凋亡，而突变型p53表达的细胞克隆则不发生。Ryan〔3〕等发现野生型p53只处于G1期的细胞才能触发其凋亡，如果当时细胞处于S期，则必须等待细胞进入下一个G1期才能起作用。此后又有许多实验研究证实野生型p53可以诱导肿瘤细胞的凋亡。
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正常细胞情形有所不同，Bennett〔4〕等发现，野生型p53不诱发正常培养的条件下的VSMC细胞凋亡。本实验中我们先采用正常条件培养平滑肌细胞，检测结果表明p53基因转入并不诱导平滑肌细胞凋亡，与Bennett结果相同。而转染后采用无血清培养，由于生长因子缺乏，细胞处于停滞状态，应用流式细胞仪检测和DNA“ladder”分析均显示外源p53基因的过度表达明显促进平滑肌细胞的凋亡。
事实上，动脉狭窄处经球囊扩张后30分钟即已经存在VSMS的凋亡〔5〕，但此后的一段时间内VSMC的增生速度高于凋亡速度，细胞的数量增加，血管壁增厚，这是产生再狭窄的重要机制之一。加速细胞的凋亡和/或抑制细胞的增生是有效控制再狭窄的基本途径。本实验的结果揭示可以采用基因转移的方法加速细胞的凋亡，从而达到局部调节细胞数量的目的，这为控制再狭窄提供了一种可能的选择。
应用反转录病毒载体作为基因转移的工具进行实验，是考虑到反转录病毒载体只能转染正处于有丝分裂状态的细胞〔7〕，对于介入部位周围的正常细胞无影响。本实验也显示pLXSN的转染效率很高，适合于进行深入研究。■
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参考文献：
[1] Miller AD and Rosman GJ.Improved retroviral vectors for gene transfer and expression.BioTechniques 1989;7∶980.
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收稿日期：1999-09-30, http://www.100md.com