T-2四醇的研制
作者：周宏博，杨秋慧，孙殿军
单位：哈尔滨医科大学大骨节病研究所，150001
关键词：T-2毒素；T-2四醇；气谱法
中国地方病学杂志990106 【摘要】 目的 旨在合成T-2四醇，为进一步研究T-2毒素的代谢机制奠定基础。方法 运用水解、提取、纯化等化学手段将T-2转化为T-2四醇，使用气谱法检测T-2四醇。结果 按Bamburg的方法合成T-2四醇，10mg T-2毒素生成0.8364mg T-2四醇。用气谱法检测表明，合成物与标准品一致。结论 方法简便、易行，为进一步研究打下了基础。
分类号 S852.44 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)01-0016-18
Preparation of T-2 tetraol
, http://www.100md.com
ZHOU Hongbo,YANG Qiuhui,SUN Dianjun
Institute od Kashin-Beck Disease,Harbin Medical University,Harbin 150001
【Abstract】 Objective The purpose of this article is to synthesize T-2 tetraol.It lays a foundation for the study of T-2 toxin.Methods T-2 toxin was turned into T-2 tetaol by means of hydrolysis,extraction and purification.T-2 tetraol was measured by gas chromatography.Results According to Bamburg's method,we turned T-2 toxin into T-2 tetraol.Conclusions This method is simple and lays a foundation for further study of T-2 toxin.
, http://www.100md.com
【Key words】 T-2 toxin T-2 tetraol GC
单端孢霉烯族真菌毒素(Trichothecene mycotoxin)是天然存在的最危险的食品污染物。这类毒素对人、畜危害甚大[1，2]。在数十种单端孢霉烯族毒素中，T-2毒素毒性最强。文献报告：T-2毒素是大骨节病的致病因子[3]。T-2毒素及其代谢物的研究已逐渐成为人们关注的课题。T-2四醇是T-2毒素在机体内的代谢产物之一，有报道T-2四醇的毒性小于T-2毒素约100倍[4]。T-2四醇的合成在国内还是个空白，每当需求，只能从国外高价购入。作者按Bamburg方法合成了T-2四醇[5]，为今后大骨节病发病机制研究提供了流行病学的实验方法，该法简便、易行，节约经费也是很值得注重的。
1 材料与方法
1.1 试剂 T-2毒素购于军事医学科学院毒物药物研究所；三甲基硅基咪唑(T)，三甲基硅基乙酰胺(B)，三甲基氯硅烷(T)均购自美国Sigma公司；其它试剂均为国产分析纯试剂。
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1.2 水解[5] 取T-2毒素10.0mg,溶解于含90%乙醇的1mol/L NaOH 50ml中，30℃恒温72小时。
1.3 提取 水解后溶液减压蒸馏，用少量双蒸水洗涤蒸馏瓶，同时用1mol/L HCl将溶液的pH调至1，再用乙酸乙酯反复萃取，萃取液减压蒸馏，再用少量乙酸乙酯洗涤蒸馏物，过滤，再次减压蒸馏，生成黄色油状物。
1.4 纯化[5] 用少量乙酸乙酯溶解黄色油状物，过100～200目硅胶G柱子(1×20cm),流动相为乙醇：乙酸乙酯：丙酮(1∶4∶4)，洗脱速度宜慢，以1ml为单位收集洗脱液共30ml。
气谱法检测T-2及T-2四醇，含有T-2四醇的洗脱液合并，60℃水溶蒸干，变成淡黄色腊状物。
1.5 检测[6]
, 百拇医药
1.5.1 衍生：(1)标准品：取T-2四醇标准品10μl(相当于10μg)，40℃ N2吹干，加入20μl TBT(5∶5∶1)，60℃保温30min，加入20μl正己烷，20μl双蒸水，振荡分层，取上层1μl N2吹干后定容，上机。
(2)样品：用500μl乙酸乙酯溶解淡黄色腊状物，取10μl 40℃ N2吹干，加入20μl TBT(5∶5∶1)，60℃保温30min，加入20μl正己烷，20μl双蒸水，振荡分层，取上层1μl N2吹干后定容，上机。
1.5.2 仪器：日本岛津产GC-9A
1.5.3 色谱柱：SE-54毛细管交联柱(美国Supelco公司)。
1.5.4 条件：载气(高纯氮)，压力3.0kg/cm2；载气流速30ml/min；氢气压力0.6kg/cm2；空气压力0.5kg/cm2；进样口温度280℃；检测器温度280℃；分流比1∶50；分析初始温度230℃，终止温度270℃，程序升温1.0℃/min。
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2 结果与讨论
T-2四醇标准品气谱图见图2。T-2四醇样品气谱图见图3。T-2四醇样品和标准品叠加后气谱图见图4。T-2毒素标准品气谱图见图5。经计算样品中含T-2四醇量0.8364mg。
图1 空白(正己烷溶液) 图2 T-2四醇标准品气谱图 图3 T-2四醇样品气谱图
图4 T-2四醇标准品和样品叠加气谱图 图5 T-2毒素标准品气谱图
本实验虽然生成T-2四醇，但是生成的量较少，因此还需不断改进合成与提取方法。
T-2毒素进入机体后，迅速经酯酶代谢成HT-2和T-2四醇，经微粒体代谢成3′-OH-HT-2和3′-OH-T-2等[7，8]。动物实验表明，T-2毒素的代谢峰出现在投药后的24h，投与量的75%在尿液和粪便中排出[9]。
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研究T-2四醇的意义有三点：(1)为探讨T-2毒素中毒代谢性生物标志做技术准备。目前国外已经完成了动物实验阶段的工作，尚未进入人体现场观察，国内须一切从头做起，关键步骤是研制ELISA抗原、抗体，然而作为准备阶段必须首先完成T-2四醇与“neos”的制备。T-2四醇的研制在这方面迈出可喜的一步。(2)T-2四醇的代谢毒理研究，必须以代谢物的检出作为前导，通过T-2四醇的制备，提供对该化合物深入掌握的机会，同时也为微含量测定方法打下了基础。(3)中国的研究，不能全靠国外试剂，否则很难完成真正意义上的自主与开发。试剂不仅仅是商业产品，更主要的是生化技术产品，没有技术便没有产品，没有产品便没有不间断开发的土壤。
还需说明一点是，Bamburg原法用薄层层析法检出T-2四醇，作者改用气相色谱法，用保留时间代替Rf值，用合成物与标准品色谱叠加法，代替视觉判断，证明保留时间完全一致，提高了测试结果的精确度。
作者简介：周宏博，女，1967年生，助理研究员，硕士
, http://www.100md.com
参考文献
[1] Ueno Y.Trichothecenes.In Rodriods (ed) JV et al.Mycotoxins in human and animal health.Chem-orbital,Park forest south (Ⅲ),1977,189～207
[2] 罗海波，杨景云，鲍行豪主编.细菌毒素[M].北京医科大学与协和医科大学联合出版社，1993,323～346
[3] 杨建伯.大骨节病病因研究报告[J].中国地方病学杂志，1995,14(4):201～205
[4] 彭双清，董剑英，杨进生.单端孢霉烯族T-2毒素毒性与其结构效应关系的研究[J].中华预防医学杂志，1996,5(30):141～143
[5] Bambury JR,et al.The structure of toxins from two strains of Fusarium tricinctum[J].Tetrahedroin,24;3329～3336
, 百拇医药
[6] 李群伟，李德安，孟宪清，等.气谱法测定粮食中T-2毒素方法的改进[J].中国地方病学杂志,1997,16(6):335～336
[7] Yoshizawa T.3′-Hydroxy T-2 and 3′-Hydroxy HT-2 Toxins:New metabolites of T-2 toxin,a Trichothecene mycotoxin in animals[J].Agric Biol Chem,1982,46:2613～2615
[8] Yoshizawa T.In vitro formation of 3′-Hydroxy T-2 and 3′-Hydroxy HT-2 toxin from T-2 toxin by liver homogenates from mice and monkeys[J]. Appl Environ Microbiol 1984,47:130～134
[9] Pace JG,Watts MR,et al.Fate and distribution of H-labeled T-2 mycotoxin in guinea pigs [J].Toxicol Appl Pharmacol,1985,80:377～385
(收稿日期：1998-10-22；修订日期：1998-11-30), http://www.100md.com
单位：哈尔滨医科大学大骨节病研究所，150001
关键词：T-2毒素；T-2四醇；气谱法
中国地方病学杂志990106 【摘要】 目的 旨在合成T-2四醇，为进一步研究T-2毒素的代谢机制奠定基础。方法 运用水解、提取、纯化等化学手段将T-2转化为T-2四醇，使用气谱法检测T-2四醇。结果 按Bamburg的方法合成T-2四醇，10mg T-2毒素生成0.8364mg T-2四醇。用气谱法检测表明，合成物与标准品一致。结论 方法简便、易行，为进一步研究打下了基础。
分类号 S852.44 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)01-0016-18
Preparation of T-2 tetraol
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ZHOU Hongbo,YANG Qiuhui,SUN Dianjun
Institute od Kashin-Beck Disease,Harbin Medical University,Harbin 150001
【Abstract】 Objective The purpose of this article is to synthesize T-2 tetraol.It lays a foundation for the study of T-2 toxin.Methods T-2 toxin was turned into T-2 tetaol by means of hydrolysis,extraction and purification.T-2 tetraol was measured by gas chromatography.Results According to Bamburg's method,we turned T-2 toxin into T-2 tetraol.Conclusions This method is simple and lays a foundation for further study of T-2 toxin.
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【Key words】 T-2 toxin T-2 tetraol GC
单端孢霉烯族真菌毒素(Trichothecene mycotoxin)是天然存在的最危险的食品污染物。这类毒素对人、畜危害甚大[1，2]。在数十种单端孢霉烯族毒素中，T-2毒素毒性最强。文献报告：T-2毒素是大骨节病的致病因子[3]。T-2毒素及其代谢物的研究已逐渐成为人们关注的课题。T-2四醇是T-2毒素在机体内的代谢产物之一，有报道T-2四醇的毒性小于T-2毒素约100倍[4]。T-2四醇的合成在国内还是个空白，每当需求，只能从国外高价购入。作者按Bamburg方法合成了T-2四醇[5]，为今后大骨节病发病机制研究提供了流行病学的实验方法，该法简便、易行，节约经费也是很值得注重的。
1 材料与方法
1.1 试剂 T-2毒素购于军事医学科学院毒物药物研究所；三甲基硅基咪唑(T)，三甲基硅基乙酰胺(B)，三甲基氯硅烷(T)均购自美国Sigma公司；其它试剂均为国产分析纯试剂。
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1.2 水解[5] 取T-2毒素10.0mg,溶解于含90%乙醇的1mol/L NaOH 50ml中，30℃恒温72小时。
1.3 提取 水解后溶液减压蒸馏，用少量双蒸水洗涤蒸馏瓶，同时用1mol/L HCl将溶液的pH调至1，再用乙酸乙酯反复萃取，萃取液减压蒸馏，再用少量乙酸乙酯洗涤蒸馏物，过滤，再次减压蒸馏，生成黄色油状物。
1.4 纯化[5] 用少量乙酸乙酯溶解黄色油状物，过100～200目硅胶G柱子(1×20cm),流动相为乙醇：乙酸乙酯：丙酮(1∶4∶4)，洗脱速度宜慢，以1ml为单位收集洗脱液共30ml。
气谱法检测T-2及T-2四醇，含有T-2四醇的洗脱液合并，60℃水溶蒸干，变成淡黄色腊状物。
1.5 检测[6]
, 百拇医药
1.5.1 衍生：(1)标准品：取T-2四醇标准品10μl(相当于10μg)，40℃ N2吹干，加入20μl TBT(5∶5∶1)，60℃保温30min，加入20μl正己烷，20μl双蒸水，振荡分层，取上层1μl N2吹干后定容，上机。
(2)样品：用500μl乙酸乙酯溶解淡黄色腊状物，取10μl 40℃ N2吹干，加入20μl TBT(5∶5∶1)，60℃保温30min，加入20μl正己烷，20μl双蒸水，振荡分层，取上层1μl N2吹干后定容，上机。
1.5.2 仪器：日本岛津产GC-9A
1.5.3 色谱柱：SE-54毛细管交联柱(美国Supelco公司)。
1.5.4 条件：载气(高纯氮)，压力3.0kg/cm2；载气流速30ml/min；氢气压力0.6kg/cm2；空气压力0.5kg/cm2；进样口温度280℃；检测器温度280℃；分流比1∶50；分析初始温度230℃，终止温度270℃，程序升温1.0℃/min。
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2 结果与讨论
T-2四醇标准品气谱图见图2。T-2四醇样品气谱图见图3。T-2四醇样品和标准品叠加后气谱图见图4。T-2毒素标准品气谱图见图5。经计算样品中含T-2四醇量0.8364mg。
图1 空白(正己烷溶液) 图2 T-2四醇标准品气谱图 图3 T-2四醇样品气谱图
图4 T-2四醇标准品和样品叠加气谱图 图5 T-2毒素标准品气谱图
本实验虽然生成T-2四醇，但是生成的量较少，因此还需不断改进合成与提取方法。
T-2毒素进入机体后，迅速经酯酶代谢成HT-2和T-2四醇，经微粒体代谢成3′-OH-HT-2和3′-OH-T-2等[7，8]。动物实验表明，T-2毒素的代谢峰出现在投药后的24h，投与量的75%在尿液和粪便中排出[9]。
, http://www.100md.com
研究T-2四醇的意义有三点：(1)为探讨T-2毒素中毒代谢性生物标志做技术准备。目前国外已经完成了动物实验阶段的工作，尚未进入人体现场观察，国内须一切从头做起，关键步骤是研制ELISA抗原、抗体，然而作为准备阶段必须首先完成T-2四醇与“neos”的制备。T-2四醇的研制在这方面迈出可喜的一步。(2)T-2四醇的代谢毒理研究，必须以代谢物的检出作为前导，通过T-2四醇的制备，提供对该化合物深入掌握的机会，同时也为微含量测定方法打下了基础。(3)中国的研究，不能全靠国外试剂，否则很难完成真正意义上的自主与开发。试剂不仅仅是商业产品，更主要的是生化技术产品，没有技术便没有产品，没有产品便没有不间断开发的土壤。
还需说明一点是，Bamburg原法用薄层层析法检出T-2四醇，作者改用气相色谱法，用保留时间代替Rf值，用合成物与标准品色谱叠加法，代替视觉判断，证明保留时间完全一致，提高了测试结果的精确度。
作者简介：周宏博，女，1967年生，助理研究员，硕士
, http://www.100md.com
参考文献
[1] Ueno Y.Trichothecenes.In Rodriods (ed) JV et al.Mycotoxins in human and animal health.Chem-orbital,Park forest south (Ⅲ),1977,189～207
[2] 罗海波，杨景云，鲍行豪主编.细菌毒素[M].北京医科大学与协和医科大学联合出版社，1993,323～346
[3] 杨建伯.大骨节病病因研究报告[J].中国地方病学杂志，1995,14(4):201～205
[4] 彭双清，董剑英，杨进生.单端孢霉烯族T-2毒素毒性与其结构效应关系的研究[J].中华预防医学杂志，1996,5(30):141～143
[5] Bambury JR,et al.The structure of toxins from two strains of Fusarium tricinctum[J].Tetrahedroin,24;3329～3336
, 百拇医药
[6] 李群伟，李德安，孟宪清，等.气谱法测定粮食中T-2毒素方法的改进[J].中国地方病学杂志,1997,16(6):335～336
[7] Yoshizawa T.3′-Hydroxy T-2 and 3′-Hydroxy HT-2 Toxins:New metabolites of T-2 toxin,a Trichothecene mycotoxin in animals[J].Agric Biol Chem,1982,46:2613～2615
[8] Yoshizawa T.In vitro formation of 3′-Hydroxy T-2 and 3′-Hydroxy HT-2 toxin from T-2 toxin by liver homogenates from mice and monkeys[J]. Appl Environ Microbiol 1984,47:130～134
[9] Pace JG,Watts MR,et al.Fate and distribution of H-labeled T-2 mycotoxin in guinea pigs [J].Toxicol Appl Pharmacol,1985,80:377～385
(收稿日期：1998-10-22；修订日期：1998-11-30), http://www.100md.com