高胰岛素对人类肾小球系膜细胞的影响
作者：汤锋 陈源根 廖立生
单位：汤锋(解放军452医院肾病科 成都，610061) ；陈源根(解放军452医院肾病科 成都，610061)；廖立生(第三军医大学新桥医院)
关键词：胰岛素；系膜细胞；纤维连接蛋白
肾脏病与透析肾移植杂志000117
有报道胰岛素可以导致大鼠肾小球系膜中纤维连接蛋白(Fn)堆积[1]，提示高胰岛素血症可能在糖尿病肾病(DN)发生发展中有其作用。本研究拟建立人类肾小球系膜细胞(GMC)培养，观察高胰岛素对人类GMC增生及Fn生成，GMC内游离Ca2+([Ca2+]i)水平的影响，以探讨DN发病机制及其防治的实验依据。
1 材料和方法[2]
, 百拇医药
1.1 GMC培养及鉴定 取人类肾移植废弃肾的肾皮质，筛网法分离肾小球；含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养，消化传代及细胞鉴定。实验中使用第4～8代细胞。
1.2 实验分组 按培养液中胰岛素浓度不同，分为三组：A组(实验对照组)：10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养液，预实验中测定其葡萄糖浓度为5 mmol/L，胰岛素浓度为5 mU/L(放免法)(A液)；B组：胰岛素浓度为200 mU/L；C组：胰岛素浓度为400 mU/L。
1.3 3H-TdR掺入 96孔板中，培养细胞按上述分组加入各培养液，每组24孔，培养液2天换液1次，培养第3及第7天时加入用A液稀释的3H-TdR，每孔1 μCi/10 μl，各组各时相点加8孔，孵育12h后测定其放射强度(min-1值)，各组各时相点中其余4孔用于细胞计数。
, 百拇医药 1.4 培养上清及细胞收集 15 ml细胞培养瓶中，培养细胞按上述分组加入各自的培养液，每组18瓶，2天换液1次。第4天及第8天收集培养上清及细胞，细胞经胰酶消化后立即测定[Ca2+]i，并将各组各时相点其余3瓶用于细胞计数。
1.5 [Ca2+]i浓度测定 荧光检测仪测定，按以下公式计算：[Ca2+]i＝kd*(F-Fmin)/(Fmax-F)，kd常数224，单位nmol/L。
1.6 培养上清中Fn测定 按Nahman的方法，通过Fn标准曲线测定，按下述公式计算：Fn值＝标本中Fn含量×106/细胞数，单位ng/106。
1.7 统计学处理 实验结果以(
±s)表示，组间及组内行方差分析及t检验，以P<0.05为统计学差异。
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2 结 果
如附表所示，胰岛素对3H-TdR掺入有促进作用，随着胰岛素浓度的升高及作用时间的延长，该作用增强(P<0.05)。胰岛素浓度上升，[Ca2+]i水平上升(P<0.05)，但与其作用时间的长短无关。胰岛素对Fn的生成亦有促进作用，胰岛素浓度越高，该作用越强(P<0.05)，但与其作用时间无关。
附表 高胰岛素对GMC的影响 4天
8天
3H-TdR(n＝8)
[Ca2+]i(n＝6)
Fn(n＝6)
, 百拇医药
3H-TdR(n＝8)
[Ca2+]i(n＝6)
Fn(n＝6)
A组
1138±119
131±15
249±12
1077±171
132±14
239±13
B组
, 百拇医药 1236±125
229±19*
264±10*
3219±207*＃
235±15*
270±14*
C组
1671±97*
353±22**
277±13**
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3752±172**＃
359±29**
284±15**
*与A组同期相比，P<0.05；**与B组同期相比，P<0.05；＃同组前后相比，P<0.05 单位：3H-TdR为min-1值：[Ca2+]i为nmol/L；Fn为ng/1063 讨 论
高胰岛素血症常见于使用磺脲类药物显著提高内源性胰岛素分泌或使用大剂量外源性胰岛素，以获得接近正常血糖浓度的糖尿病患者[3]。GMC不同于胰岛素作用的经典靶细胞，它对外周葡萄糖的转运和利用不依赖于外周胰岛素浓度，其表面的葡萄糖转运蛋白表达亦不受胰岛素调控，即它是一种胰岛素非依赖性细胞[4]，但这并不意味着胰岛素对其无影响，尤其在上述的病理性或医源性高胰岛素状态下。
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本实验发现高胰岛素可升高GMC内[Ca2+]i水平，随着胰岛素浓度的升高，[Ca2+]i水平亦随之上升。由于正常培养的鼠GMC可表达少量的胰岛素受体和相当数量的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)受体，糖尿病鼠(db/db)与其对照鼠(db/m)相比，其GMC中胰岛素受体及IGF-1受体mRNA表达增高[5]，且高浓度的胰岛素可以较低的亲和性结合并激活IGF-1受体[6]，因而推测高胰岛素可能通过糖尿病状态下GMC上表达增高的胰岛素受体或IGF-1受体影响GMC。胰岛素受体活化后的信号传递是通过刺激磷脂酶C，使IP3释放，后者引起[Ca2+]i水平的上升，同时引起二酰基甘油(DAG)生成增加及蛋白酶C(PKC)激活[7]。文献报道，胰岛素可提高大鼠GMC中[Ca2+]i水平，且GMC细胞膜上电压依赖性钙通道的开放依赖于胰岛素的存在[8～10]。这与本实验中观察到的结果相吻合，因此笔者认为高胰岛素影响GMC的机制可能与其升高[Ca2+]i有关。
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有文献报道，胰岛素与IGF-1均能提高培养的微血管内皮细胞TdR掺入率[6]。本研究亦证实，高胰岛素对GMC有促增殖作用，随着胰岛素浓度的上升，这种促增生作用加强；同时，高胰岛素还可促进GMC生成Fn增多，胰岛素浓度越高，该作用越显著；这就意味着高胰岛素促进GMC增生以增加Fn生成外，亦可同高糖作用类似，提高GMC生成Fn的能力，这可能解释了胰岛素能导致大鼠肾小球系膜Fn堆积的原因[1]。与高糖作用不同[2]，当胰岛素浓度达到一定程度后，即使延长作用时间，GMC生成Fn的能力并不进一步提高，这可能与胰岛素是通过受体起作用有关。
本实验结果提示，在存在病理性或医源性高胰岛素血症的糖尿病患者中，即使血糖能维持在正常范围，高胰岛素本身亦可促进GMC的增生及Fn等细胞外基质的生成，导致DN的发生和发展。这就要求在糖尿病的治疗过程中，即要严格控制血糖水平，同时应注意血中胰岛素水平，这样才能有效地阻止或延缓DN的发生发展。
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参考文献
1，Abrass CK，Poterson CV，Raugi GJ.Phenotypic expression of collagen types in mesangial matrix of diabetic and nondiabetic rats.Diabetes，1988，37：1695
2，汤 锋，马小平，陈源根等.高糖对人类肾小球系膜细胞的影响.中华肾脏病杂志，1998，14(3)：163
3，Poretsky L.On the paradox of insulin-induced hyperandrogenism in insulin-resistant states.Endocr Rev，1991，12：3
4，Kreisberg JI，Ayo SH.The glomerular mesangium in diabetes mellitus.Kidney Int，1993，43：109
, 百拇医药
5，Togawa M，Kikkawa R，Haneda M et al.Metabolic and mitogenic effects of insulin-like growth factor I on rat glomerular mesangial cells cultured under high concentration of glucose.(Abstract)Nippon Jinzo Gakkai Shi，1991，33(2)：131
6，Bar RS，Boes M，Dake BL et al.Insulin，insulin-like growth factos，and vascular endothelium.Am J Med，1988，85(suppl 5A)：59
7，Nishizuka Y.Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C.Science，1992，258：607
, http://www.100md.com
8，Dunlop ME，Larkins RG.Insulin-dependent contractility of glomerular mesangial cells in response to angiotensin Ⅱ.Platelet-activating factor and endothelin is attenuated by prostaglandin E2.Biochem J，1990，272(3)：561
9，Ling BN，Seal EE，Eaton DC.Regulation of mesangial cell ion channels by insulin and angiotensin Ⅱ.Possible role in diabetic glomerular hyperfiltration.J Clin Invest，1993，92(5)：2141
10，Kuriyama S，Tomonari H，Segawa H et al.Lowersed insulin sensitive Ca2+transport in cultured glomerular mesangial cells from spontaneously hypertensive rats.Nippon Jinzo Gakkai Shi，1993，35(8)：893(abstract)
收稿1999-11-22
修回1999-12-14, 百拇医药
单位：汤锋(解放军452医院肾病科 成都，610061) ；陈源根(解放军452医院肾病科 成都，610061)；廖立生(第三军医大学新桥医院)
关键词：胰岛素；系膜细胞；纤维连接蛋白
肾脏病与透析肾移植杂志000117
有报道胰岛素可以导致大鼠肾小球系膜中纤维连接蛋白(Fn)堆积[1]，提示高胰岛素血症可能在糖尿病肾病(DN)发生发展中有其作用。本研究拟建立人类肾小球系膜细胞(GMC)培养，观察高胰岛素对人类GMC增生及Fn生成，GMC内游离Ca2+([Ca2+]i)水平的影响，以探讨DN发病机制及其防治的实验依据。
1 材料和方法[2]
, 百拇医药
1.1 GMC培养及鉴定 取人类肾移植废弃肾的肾皮质，筛网法分离肾小球；含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养，消化传代及细胞鉴定。实验中使用第4～8代细胞。
1.2 实验分组 按培养液中胰岛素浓度不同，分为三组：A组(实验对照组)：10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养液，预实验中测定其葡萄糖浓度为5 mmol/L，胰岛素浓度为5 mU/L(放免法)(A液)；B组：胰岛素浓度为200 mU/L；C组：胰岛素浓度为400 mU/L。
1.3 3H-TdR掺入 96孔板中，培养细胞按上述分组加入各培养液，每组24孔，培养液2天换液1次，培养第3及第7天时加入用A液稀释的3H-TdR，每孔1 μCi/10 μl，各组各时相点加8孔，孵育12h后测定其放射强度(min-1值)，各组各时相点中其余4孔用于细胞计数。
, 百拇医药 1.4 培养上清及细胞收集 15 ml细胞培养瓶中，培养细胞按上述分组加入各自的培养液，每组18瓶，2天换液1次。第4天及第8天收集培养上清及细胞，细胞经胰酶消化后立即测定[Ca2+]i，并将各组各时相点其余3瓶用于细胞计数。
1.5 [Ca2+]i浓度测定 荧光检测仪测定，按以下公式计算：[Ca2+]i＝kd*(F-Fmin)/(Fmax-F)，kd常数224，单位nmol/L。
1.6 培养上清中Fn测定 按Nahman的方法，通过Fn标准曲线测定，按下述公式计算：Fn值＝标本中Fn含量×106/细胞数，单位ng/106。
1.7 统计学处理 实验结果以(
±s)表示，组间及组内行方差分析及t检验，以P<0.05为统计学差异。, http://www.100md.com
2 结 果
如附表所示，胰岛素对3H-TdR掺入有促进作用，随着胰岛素浓度的升高及作用时间的延长，该作用增强(P<0.05)。胰岛素浓度上升，[Ca2+]i水平上升(P<0.05)，但与其作用时间的长短无关。胰岛素对Fn的生成亦有促进作用，胰岛素浓度越高，该作用越强(P<0.05)，但与其作用时间无关。
附表 高胰岛素对GMC的影响 4天
8天
3H-TdR(n＝8)
[Ca2+]i(n＝6)
Fn(n＝6)
, 百拇医药
3H-TdR(n＝8)
[Ca2+]i(n＝6)
Fn(n＝6)
A组
1138±119
131±15
249±12
1077±171
132±14
239±13
B组
, 百拇医药 1236±125
229±19*
264±10*
3219±207*＃
235±15*
270±14*
C组
1671±97*
353±22**
277±13**
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3752±172**＃
359±29**
284±15**
*与A组同期相比，P<0.05；**与B组同期相比，P<0.05；＃同组前后相比，P<0.05 单位：3H-TdR为min-1值：[Ca2+]i为nmol/L；Fn为ng/1063 讨 论
高胰岛素血症常见于使用磺脲类药物显著提高内源性胰岛素分泌或使用大剂量外源性胰岛素，以获得接近正常血糖浓度的糖尿病患者[3]。GMC不同于胰岛素作用的经典靶细胞，它对外周葡萄糖的转运和利用不依赖于外周胰岛素浓度，其表面的葡萄糖转运蛋白表达亦不受胰岛素调控，即它是一种胰岛素非依赖性细胞[4]，但这并不意味着胰岛素对其无影响，尤其在上述的病理性或医源性高胰岛素状态下。
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本实验发现高胰岛素可升高GMC内[Ca2+]i水平，随着胰岛素浓度的升高，[Ca2+]i水平亦随之上升。由于正常培养的鼠GMC可表达少量的胰岛素受体和相当数量的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)受体，糖尿病鼠(db/db)与其对照鼠(db/m)相比，其GMC中胰岛素受体及IGF-1受体mRNA表达增高[5]，且高浓度的胰岛素可以较低的亲和性结合并激活IGF-1受体[6]，因而推测高胰岛素可能通过糖尿病状态下GMC上表达增高的胰岛素受体或IGF-1受体影响GMC。胰岛素受体活化后的信号传递是通过刺激磷脂酶C，使IP3释放，后者引起[Ca2+]i水平的上升，同时引起二酰基甘油(DAG)生成增加及蛋白酶C(PKC)激活[7]。文献报道，胰岛素可提高大鼠GMC中[Ca2+]i水平，且GMC细胞膜上电压依赖性钙通道的开放依赖于胰岛素的存在[8～10]。这与本实验中观察到的结果相吻合，因此笔者认为高胰岛素影响GMC的机制可能与其升高[Ca2+]i有关。
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有文献报道，胰岛素与IGF-1均能提高培养的微血管内皮细胞TdR掺入率[6]。本研究亦证实，高胰岛素对GMC有促增殖作用，随着胰岛素浓度的上升，这种促增生作用加强；同时，高胰岛素还可促进GMC生成Fn增多，胰岛素浓度越高，该作用越显著；这就意味着高胰岛素促进GMC增生以增加Fn生成外，亦可同高糖作用类似，提高GMC生成Fn的能力，这可能解释了胰岛素能导致大鼠肾小球系膜Fn堆积的原因[1]。与高糖作用不同[2]，当胰岛素浓度达到一定程度后，即使延长作用时间，GMC生成Fn的能力并不进一步提高，这可能与胰岛素是通过受体起作用有关。
本实验结果提示，在存在病理性或医源性高胰岛素血症的糖尿病患者中，即使血糖能维持在正常范围，高胰岛素本身亦可促进GMC的增生及Fn等细胞外基质的生成，导致DN的发生和发展。这就要求在糖尿病的治疗过程中，即要严格控制血糖水平，同时应注意血中胰岛素水平，这样才能有效地阻止或延缓DN的发生发展。
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参考文献
1，Abrass CK，Poterson CV，Raugi GJ.Phenotypic expression of collagen types in mesangial matrix of diabetic and nondiabetic rats.Diabetes，1988，37：1695
2，汤 锋，马小平，陈源根等.高糖对人类肾小球系膜细胞的影响.中华肾脏病杂志，1998，14(3)：163
3，Poretsky L.On the paradox of insulin-induced hyperandrogenism in insulin-resistant states.Endocr Rev，1991，12：3
4，Kreisberg JI，Ayo SH.The glomerular mesangium in diabetes mellitus.Kidney Int，1993，43：109
, 百拇医药
5，Togawa M，Kikkawa R，Haneda M et al.Metabolic and mitogenic effects of insulin-like growth factor I on rat glomerular mesangial cells cultured under high concentration of glucose.(Abstract)Nippon Jinzo Gakkai Shi，1991，33(2)：131
6，Bar RS，Boes M，Dake BL et al.Insulin，insulin-like growth factos，and vascular endothelium.Am J Med，1988，85(suppl 5A)：59
7，Nishizuka Y.Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C.Science，1992，258：607
, http://www.100md.com
8，Dunlop ME，Larkins RG.Insulin-dependent contractility of glomerular mesangial cells in response to angiotensin Ⅱ.Platelet-activating factor and endothelin is attenuated by prostaglandin E2.Biochem J，1990，272(3)：561
9，Ling BN，Seal EE，Eaton DC.Regulation of mesangial cell ion channels by insulin and angiotensin Ⅱ.Possible role in diabetic glomerular hyperfiltration.J Clin Invest，1993，92(5)：2141
10，Kuriyama S，Tomonari H，Segawa H et al.Lowersed insulin sensitive Ca2+transport in cultured glomerular mesangial cells from spontaneously hypertensive rats.Nippon Jinzo Gakkai Shi，1993，35(8)：893(abstract)
收稿1999-11-22
修回1999-12-14, 百拇医药