北京地区汉族人群线粒体DNA 9bp序列缺失频率检测
作者：李琦 谷志远 赵亚力
单位：李琦(100853 北京，解放军总医院分子生物学室)；谷志远(100853 北京，解放军总医院分子生物学室)；赵亚力(100853 北京，解放军总医院分子生物学室)
关键词：
中华医学遗传学杂志000223 依据mtDNA剑桥序列[1]为相对标准序列，mtDNA COⅡ/tRNALys基因间的小非编码区V含有2个9bp串联重复序列(CCCCCTCTA)。1983年，Cann和Wilson[2]应用RFLP分析，首次发现该区域有长度变化；随后Wrischnik等[3]以序列分析证实该区域长度变化是由于9bp重复序列缺失一个拷贝而产生。早期研究认为，该缺失为起源于亚洲的人种所特有。近年来的研究表明，它具有多重起源性[4-6]，不同人种群9bp缺失频率及分布不同[7-10]使其成为研究人种遗传分化的重要靶点。我们运用PCR直接测序方法，检测了北京地区汉族人mtDNA 9bp序列多态频率，并与文献报道的其它地域人种mtDNA 9bp序列多态性进行了比较分析。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 研究对象 随机选取101名北京地区汉族健康妊娠妇女正常分娩时的新鲜胎盘组织。所选对象各个体家族内均为三代汉族通婚，无遗传病家族史。
1.2 方法 mtDNA的提取参照文献[11]。依据Hertzberg等[7]的报道设计并合成引物，实施PCR扩增反应。扩增产物经纯化采用PE公司测序试剂盒直接测序。结果经计算机收集处理。
2 结果
2.1 PCR检测mtDNA 9bp缺失频率 PCR检测中未见非特异扩增(图1)。正常mtDNA扩增片段为121bp，缺失者扩增片段为112bp。扩增结果表明 ，在101名受检个体中有19名(18.8%)存在9bp缺失，其余82名(81.2%)无9bp缺失。
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图1 北京地区汉族人群mtDNA正常和缺失9bp片段的PCR产物凝胶电泳图
1:pBR322/BstN Ⅰ;2、3:有9bp缺失mtDNA扩增产物；4、5为正常mtDNA扩增产物
2.2 序列测定结果 对19名呈现112bp的PCR扩增产物及随机选择2名121bp的扩增产物进行序列测定，参照剑桥序列分析测定。结果表明，2名121bp的PCR扩增产物的核酸序列与该区域剑桥序列一致，存在两个拷贝同向重复9bp序列，系正常mtDNA序列；而19名112bp的PCR扩增产物有一个拷贝9bp缺失。测序结果见图2。
图2 序列测定结果 a：无9bp缺失mtDNAV区核苷酸序列，b：有一个拷贝9bp缺失mtDNAV区核苷酸序列
3 讨论
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人mtDNA COⅡ/tRNALys基因间小非编码区V存在的两个串联重复9bp序列(CCCCCTCTA)，位于第8272～8280和第8281～8289核苷酸。Wrischnik等[3]的研究表明，该区域发生的一个拷贝9bp缺失，可以随机发生于两个拷贝中的任意一个。我们用PCR方法扩增了101名北京地区汉族人mtDNA
该区域片段，经测序证实，19名产生112bp的扩增产物在COⅡ/tRNALys基因间出现1个拷贝9bp缺失。
不同人种mtDNA 9bp缺失频率不同。有学者提出，mtDNA COⅡ/tRNALys基因间9bp缺失是亚洲人及发源于亚洲的人种(玻利尼西亚人，土著美洲人)的特征，在亚洲人祖先的谱系中曾出现过一次缺失事件[9]，而近年来在非洲人种中也发现有mtDNA 9bp缺失，主要分布于中非洲的俾格米人(Pygmy)、马拉维人(Malawi)和南非班图语系人(Bantu-spekers)[4,5]。Soodyall等[4]在研究非洲人种mtDNA 9bp缺失时，平行检测了mtDNA控制区中两个高可变区片段多态性。综合分析发现，非洲人出现9bp缺失的mtDNA独特型与亚洲人不同，从系统发生和错配分布分析显示，人mtDNA 9bp缺失在非洲和亚洲是独立发生的，而且在非洲人祖先谱系中不只发生过一次缺失事件。
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关于中国大陆人群mtDNA 9bp缺失率，尚未见国内学者的直接研究报告。Melton等[8]曾报告移居新加坡的南中国汉族人mtDNA 9bp缺失率为22.3%，日本学者Horai等[9]报告居住在台湾非台湾本土的中国人(作者未说明是否纯系汉族人)mtDNA 9bp缺失率为20%。我们研究了北京地区汉族人mtDNA 9bp缺失，缺失率为18.8%。
表1汇集了文献报道的亚洲及太平洋地域人群mtDNA 9bp缺失率[8-10]。从表1可以看出不同人种群的mtDNA 9bp缺失率有差别，就是东亚地域的本土日本人、北海道阿伊努人、韩国人也有很大差别。北海地区汉族人群9bp缺失率与毗邻的本土日本人群相似，而与地理位置相近的韩国人差别较大。
表2 亚洲及太平洋地域人群mtDNA 9-bp 缺失率 人群
9bp缺失频率(%)
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北京汉族人
18.8
新疆维族人
2.0
本土日本人
18.0
北海道阿伊努人
2.0
韩国汉城人
7.8
爪哇人
25.5
马来人
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25.9
东印度尼西亚人
21.0
巴基斯坦人
0
孟加拉人
0
参考文献
[1]Anderson S, Bankier AT, Barrell BG， et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature, 1981, 290(9)∶457-465.
[2]Cann RL, Wilson AC. Length mutations in human mitochondrial DNA. Genetics, 1983, 104∶699-711.
, 百拇医药
[3]Wrischnik LA, Higuchi RG, Stoneking M, et al. Length mutations in human mitochondrial DNA: direct sequencing of enzymatically amplified DNA. Nucleic Acids Res, 1987, 15(2)∶529-542.
[4]Soodyall H, Vigilant L, Hill AV, et al. mtDNA control-region sequence variation suggests multiple independent origins of an“Asian-Specific” 9-bp deletion in Sub-Saharan Africans. Am J Hum Genet, 1996, 58∶595-608.
[5]Chen YS, Torroni A, Excoffier L, et al. Analysis of mtDNA variation in African populations reveals the most ancient of all human continent-specific halogroups. Am J Hum Genet, 1995, 57:133-149.
, http://www.100md.com
[6]Torroni A, Petrozzi M, Santolamazza P, et al. About the “Asian”-specific 9-bp deletion of mtDNA…[letter]. Am J Hum, 1995, 57(2)∶507-508.
[7]Hertzberg M, Mickleson KNP, Serjeantson SW, et al.An Asian-specific 9-bp deletion of mitochondrial DNA is frequently found in Polynesians. Am J Hum Genet, 1989, 44:504-510.
[8]Melton T, Peterson R, Redd AJ, et al. Polynesian genetic affinities with southeast Asian populations as identified by mtDNA analysis. Am J Hum Genet, 1995, 57∶403-414.
, http://www.100md.com
[9]Horai S, Murayama K, Hayasaka K, et al. mtDNA polymorphism in east Asian popultions, with special reference to the peoling of Japan. Am J Hum Genet, 1996, 59∶579-590.
[10]Harihara S, Hirai M, Suutou Y, et al. Frequence of a 9-bp deletion in the mitochondrial DNA among Asian population. Hum Biology, 1992, 64(2)∶161-166.
[11]俞民澍.人胎盘线粒体DNA快速制备新方法.遗传与疾病，1987，4(1)∶39-40.
收稿日期：1999-06-17, 百拇医药
单位：李琦(100853 北京，解放军总医院分子生物学室)；谷志远(100853 北京，解放军总医院分子生物学室)；赵亚力(100853 北京，解放军总医院分子生物学室)
关键词：
中华医学遗传学杂志000223 依据mtDNA剑桥序列[1]为相对标准序列，mtDNA COⅡ/tRNALys基因间的小非编码区V含有2个9bp串联重复序列(CCCCCTCTA)。1983年，Cann和Wilson[2]应用RFLP分析，首次发现该区域有长度变化；随后Wrischnik等[3]以序列分析证实该区域长度变化是由于9bp重复序列缺失一个拷贝而产生。早期研究认为，该缺失为起源于亚洲的人种所特有。近年来的研究表明，它具有多重起源性[4-6]，不同人种群9bp缺失频率及分布不同[7-10]使其成为研究人种遗传分化的重要靶点。我们运用PCR直接测序方法，检测了北京地区汉族人mtDNA 9bp序列多态频率，并与文献报道的其它地域人种mtDNA 9bp序列多态性进行了比较分析。
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1 材料和方法
1.1 研究对象 随机选取101名北京地区汉族健康妊娠妇女正常分娩时的新鲜胎盘组织。所选对象各个体家族内均为三代汉族通婚，无遗传病家族史。
1.2 方法 mtDNA的提取参照文献[11]。依据Hertzberg等[7]的报道设计并合成引物，实施PCR扩增反应。扩增产物经纯化采用PE公司测序试剂盒直接测序。结果经计算机收集处理。
2 结果
2.1 PCR检测mtDNA 9bp缺失频率 PCR检测中未见非特异扩增(图1)。正常mtDNA扩增片段为121bp，缺失者扩增片段为112bp。扩增结果表明 ，在101名受检个体中有19名(18.8%)存在9bp缺失，其余82名(81.2%)无9bp缺失。
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图1 北京地区汉族人群mtDNA正常和缺失9bp片段的PCR产物凝胶电泳图
1:pBR322/BstN Ⅰ;2、3:有9bp缺失mtDNA扩增产物；4、5为正常mtDNA扩增产物
2.2 序列测定结果 对19名呈现112bp的PCR扩增产物及随机选择2名121bp的扩增产物进行序列测定，参照剑桥序列分析测定。结果表明，2名121bp的PCR扩增产物的核酸序列与该区域剑桥序列一致，存在两个拷贝同向重复9bp序列，系正常mtDNA序列；而19名112bp的PCR扩增产物有一个拷贝9bp缺失。测序结果见图2。
图2 序列测定结果 a：无9bp缺失mtDNAV区核苷酸序列，b：有一个拷贝9bp缺失mtDNAV区核苷酸序列
3 讨论
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人mtDNA COⅡ/tRNALys基因间小非编码区V存在的两个串联重复9bp序列(CCCCCTCTA)，位于第8272～8280和第8281～8289核苷酸。Wrischnik等[3]的研究表明，该区域发生的一个拷贝9bp缺失，可以随机发生于两个拷贝中的任意一个。我们用PCR方法扩增了101名北京地区汉族人mtDNA
该区域片段，经测序证实，19名产生112bp的扩增产物在COⅡ/tRNALys基因间出现1个拷贝9bp缺失。
不同人种mtDNA 9bp缺失频率不同。有学者提出，mtDNA COⅡ/tRNALys基因间9bp缺失是亚洲人及发源于亚洲的人种(玻利尼西亚人，土著美洲人)的特征，在亚洲人祖先的谱系中曾出现过一次缺失事件[9]，而近年来在非洲人种中也发现有mtDNA 9bp缺失，主要分布于中非洲的俾格米人(Pygmy)、马拉维人(Malawi)和南非班图语系人(Bantu-spekers)[4,5]。Soodyall等[4]在研究非洲人种mtDNA 9bp缺失时，平行检测了mtDNA控制区中两个高可变区片段多态性。综合分析发现，非洲人出现9bp缺失的mtDNA独特型与亚洲人不同，从系统发生和错配分布分析显示，人mtDNA 9bp缺失在非洲和亚洲是独立发生的，而且在非洲人祖先谱系中不只发生过一次缺失事件。
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关于中国大陆人群mtDNA 9bp缺失率，尚未见国内学者的直接研究报告。Melton等[8]曾报告移居新加坡的南中国汉族人mtDNA 9bp缺失率为22.3%，日本学者Horai等[9]报告居住在台湾非台湾本土的中国人(作者未说明是否纯系汉族人)mtDNA 9bp缺失率为20%。我们研究了北京地区汉族人mtDNA 9bp缺失，缺失率为18.8%。
表1汇集了文献报道的亚洲及太平洋地域人群mtDNA 9bp缺失率[8-10]。从表1可以看出不同人种群的mtDNA 9bp缺失率有差别，就是东亚地域的本土日本人、北海道阿伊努人、韩国人也有很大差别。北海地区汉族人群9bp缺失率与毗邻的本土日本人群相似，而与地理位置相近的韩国人差别较大。
表2 亚洲及太平洋地域人群mtDNA 9-bp 缺失率 人群
9bp缺失频率(%)
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北京汉族人
18.8
新疆维族人
2.0
本土日本人
18.0
北海道阿伊努人
2.0
韩国汉城人
7.8
爪哇人
25.5
马来人
, 百拇医药
25.9
东印度尼西亚人
21.0
巴基斯坦人
0
孟加拉人
0
参考文献
[1]Anderson S, Bankier AT, Barrell BG， et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature, 1981, 290(9)∶457-465.
[2]Cann RL, Wilson AC. Length mutations in human mitochondrial DNA. Genetics, 1983, 104∶699-711.
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[3]Wrischnik LA, Higuchi RG, Stoneking M, et al. Length mutations in human mitochondrial DNA: direct sequencing of enzymatically amplified DNA. Nucleic Acids Res, 1987, 15(2)∶529-542.
[4]Soodyall H, Vigilant L, Hill AV, et al. mtDNA control-region sequence variation suggests multiple independent origins of an“Asian-Specific” 9-bp deletion in Sub-Saharan Africans. Am J Hum Genet, 1996, 58∶595-608.
[5]Chen YS, Torroni A, Excoffier L, et al. Analysis of mtDNA variation in African populations reveals the most ancient of all human continent-specific halogroups. Am J Hum Genet, 1995, 57:133-149.
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[6]Torroni A, Petrozzi M, Santolamazza P, et al. About the “Asian”-specific 9-bp deletion of mtDNA…[letter]. Am J Hum, 1995, 57(2)∶507-508.
[7]Hertzberg M, Mickleson KNP, Serjeantson SW, et al.An Asian-specific 9-bp deletion of mitochondrial DNA is frequently found in Polynesians. Am J Hum Genet, 1989, 44:504-510.
[8]Melton T, Peterson R, Redd AJ, et al. Polynesian genetic affinities with southeast Asian populations as identified by mtDNA analysis. Am J Hum Genet, 1995, 57∶403-414.
, http://www.100md.com
[9]Horai S, Murayama K, Hayasaka K, et al. mtDNA polymorphism in east Asian popultions, with special reference to the peoling of Japan. Am J Hum Genet, 1996, 59∶579-590.
[10]Harihara S, Hirai M, Suutou Y, et al. Frequence of a 9-bp deletion in the mitochondrial DNA among Asian population. Hum Biology, 1992, 64(2)∶161-166.
[11]俞民澍.人胎盘线粒体DNA快速制备新方法.遗传与疾病，1987，4(1)∶39-40.
收稿日期：1999-06-17, 百拇医药