NMDA受体与NOS在大鼠脊髓中间外侧柱的定位和生后发育
作者：魏丽春 石梅 马海昕 王志祥
单位：第四军医大学西京医院放射治疗科，陕西 西安 710033
关键词：NMDA受体；一氧化氮合酶；脊髓中间外侧柱；生后发育
第四军医大学学报001003 摘 要： 目的 探讨N-甲基-天冬氨酸受体(NMDAR1和NMDAR2A/B亚基)、一氧化氮合酶(NOS)及还原型辅酶II硫辛酰胺脱氢酶(NADPH-d)活性在大鼠脊髓中间外侧柱(IML)的定位与生后发育特征. 方法 在甲醛固定的脊髓切片上，进行ABC法免疫染色和NADPH-d组织化学反应与半定量分析. 结果 NMDAR1，NMDAR2A/B，NOSⅠ和NADPH-d反应产物丰富地分布于IML，主要定位于神经元胞体、树突和轴突样纤维终末. 在生后早期发育中它们具有明显的动态变化，生后7 d(P7)有微弱或中等的表达，随后逐渐上调，P21或P28达到高峰，然后保持于此水平于成体动物. 结论 NMDA受体-NO通路可能是脊髓交感节前神经元一条重要的细胞内信号途径，并参与神经元生后发育成熟的调控过程.
, 百拇医药
中图号：R329 文献标识码： A
文章编号：1000-2790(2000)10-1178-04
Localization and postnatal development of NMDA receptors and NOS in intermediolateral column of spinal cord of adult rats
WEI Li-Chun, SHI Mei, MA Hai-Xin， WANG Zhi-Xiang
(Department of Radiotherapy, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University，Xi'an 710033, China)
Abstract:AIM To investigate the cellular localization and early postnatal development of N-methyl-aspartate (NMDA) receptor subunits (NMDAR1 and NMDAR2A/B)， nitric oxide synthase (NOS) and NADPH-diaphorase activity in the intermediolateral column (IML) of the spinal cord in adult rats. METHODS ABC immunohistochemical staining and NADPH-d histochemistry were made in paraformaldehyde-fixed spinal cord sections. RESULTS NMDAR1-, NMDAR2A/B-, NOSI-immunoreactivity, or NADPH-diaphorase activity was abundant in IML. They were mainly located in neuronal somata, dendrites and axon terminals. Dynamic changes of NMDA receptor subunits， NOS and NADPH-d activity occurred in early postnatal developing stages. Expression of NMDA receptor subunits and NOSI was weak or moderate at postnatal 7 days (P7), went up at P14, reached maximum level at P21 or P28, then remained stable at this level until adult. CONCLUSION NMDA receptor-NO may be an important intracellular signal pathway of pre-sympathetic neurons and involved in the neuronal maturation during postnatal development of rat spinal cord.
, 百拇医药
Keywords: NMDA receptors; nitric oxide synthase; intermediolateral column of spinal cord; postnatal development
0 引言
近年来的研究[1，2]表明，在CNS内存在着N-甲基-天冬氨酸(NMDA)受体-一氧化氮(nitric oxide，NO)信号通路，是神经元兴奋性信号转导和可塑性变化的重要途径. 脊髓中间外侧柱(intermediolateral column，IML)为交感节前神经元聚集之处，含有丰富的NO及其NOS(nitric oxide synthase，NOS)[3]. 但NMDA受体在脊髓侧角内的分布特征还存在争议. 以往的受体结合实验证明脊髓侧角存在NMDA结合位点，Monaghan等[4]观察到NMDAR2A mRNA在脊髓运动神经元有丰富的定位，但Tolle等[5]没有检测到NMDAR2A mRNA的分布. NMDA受体-NO通路是否存在于脊髓交感节前神经元？该信号通路在脊髓交感节前神经元的发育特征及其意义如何？值得进一步研究. 因此，我们利用免疫组织化学等方法，对NMDA受体亚单位(NMDAR1，NMDAR2A/B)，NOS(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ)和NADPH-d活性等在大鼠脊髓IML的细胞学定位和生后发育规律进行了探讨.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 正常雄性SD幼年与成年大鼠34只，由本校实验动物中心提供，分为以下5组. Ⅰ：生后7 d(postnatal 7 days，P7；n=8)；Ⅱ： P14 (n=8)；Ⅲ：P21(n=6)；Ⅳ：P28 (n=6)；V：P70(n=6). 动物在戊巴比妥钠麻醉下, 开胸、经左心室至主动脉插管, 用生理盐水约50 mL快速冲去血液, 随即灌注含40 g*L-1多聚甲醛0.1 mol*L-1的磷酸缓冲液(pH 7.4),灌流30 min. 注毕立即取出脊髓, 4℃下后固定4 h. 然后换入30 g*L-1蔗糖溶液内，4℃下过夜. 冰冻连续冠状切片(包括C6-T1，T6-8和 T11-L3共3段)，片厚40 μm. 切片按顺序分为数套，分别作Nissl染色，NMDAR1，NMDAR2A/B，NOSⅠ，NOSⅡ，NOSⅢ，NADPH-d和对照染色.
1.2 方法 采用免疫组织化学反应(ABC法). 切片于 10 mmol*L-1 PBS内涮洗, 再入含0.3 mL*L-1 过氧化氢溶液内处理30 min，用以灭活内源性过氧化物酶. 经PBS涮洗后，分别入第一抗体血清(用含2 mL*L-1 正常山羊血清和0.1 mL*L-1 Triton X-100的PBS稀释)内，4℃下孵育48 h. 第1抗体均为Chemicon公司产品，包括小鼠抗NMDAR1 mAb (1∶1000)、 兔抗NMDAR2A/B多克隆抗体(1∶1000，所用抗原为结合于BSA的NMDAR2A受体亚基的C末端多肽，抗体测定证明它还识别NMDAR2B)、兔抗NOSⅠ多克隆抗体(1∶2000)、兔抗NOSⅡ多克隆抗体(1∶1000)和兔抗NOSⅢ多克隆抗体(1∶1000). 入biotin标记的羊抗兔IgG (1∶200，Vector公司产品)溶液，室温下放置4 h. 入ABC复合物(1∶200, Vector公司产品)溶液，室温下孵育2 h. 每次抗体孵育后均用PBS涮洗，3×10 min. 最后入DAB/H2O2溶液 (0.05 g*L-1/0.01 g*L-1) 反应10 min. 另外，用正常血清溶液代替特异性第一抗体孵育切片，作为免疫染色对照. NADPH-d 组化反应，按作者已报道[6]的方法进行. 按Paxinos大鼠立体定位图谱划分法[7]行半定量分析，观察重点范围为脊髓胸段侧角(IML). 参照以往的定量方法[5]，对免疫染色阳性结构(胞体、纤维)的染色强度和分布密度进行半定量分析. 其中，胞体的染色分别用强()，中等()，弱(+)和阴性(-)表示； 阳性纤维的密度则分为密集()，中等()，稀疏(+)和阴性(-)4级. 免疫染色和NADPH-d阳性细胞的半定量分析，通过分别计数相邻40 μm厚切片上阳性神经元和尼氏染色胞体，比较两者比率(免疫阳性胞体/尼氏染色胞体)在生后发育中的变化.
, 百拇医药
统计学处理: 将上述5组动物的免疫阳性胞体/尼氏染色胞体比率(
±s)，反正旋转换后，相邻组别作单因素χ2检验.
2 结果
2.1 免疫反应产物的定位特征 在应用特异性第一抗体孵育的切片上，免疫反应产物呈深棕色，主要定位于神经元胞体、突起上. 在大鼠脊髓内，NMDAR1，NMDAR2A/B和NOSⅠ的免疫阳性产物，密集地分布于位于灰质ⅤⅡ层的IML. 在灰质Ⅰ至Ⅵ层、ⅤⅢ至X层内也有不同程度的分布. NMDAR1和NMDAR2A/B的免疫阳性产物还见于白质(胶质细胞)内. 在用正常血清取代特异性第一抗体进行孵育的切片上，呈阴性反应.
2.2 NMDA受体亚基在成鼠脊髓侧角内的定位 NMDAR1与NMDAR2A/B染色强度在各脊髓胸部节段相似. 免疫反应阳性结构主要为神经元胞体、树突、以及轴突样纤维终末. 位于的IML NMDAR1免疫反应(NMDAR1-immunoreactive，NMDAR1-IR)阳性胞体多为中等大小(胞体直径约20～30 μm)和小型的神经元(胞体直径小于20 μm). 大型(胞体直径大于30 μm)少见. 胞体多为椭圆形或不规则三角形. 可见NMDAR1-IR树突，有的与阳性胞体相连续. NMDAR2A/B-IR的染色较NMDAR1强，胞体上的NMDAR2A/B-IR阳性产物呈大颗粒状或小斑块状. 其阳性胞体的大小、数目和分布形式与NMDAR1-IR神经元相似. 最主要的差别是，在侧角分布有许多的NMDAR2A/B-IR轴突样纤维，密度中等. 阳性纤维带有许多膨体，呈串珠状. 形态上为轴突样纤维终末结构，它们呈环状，分叉样、线条形排列，有的纤维围绕或紧贴阳性胞体或树突分布. 可见轴突样纤维延伸于侧角灰质和白质侧束之间(Fig 1，2).
, 百拇医药
2.3 NOS和NADPH-d在成鼠脊髓侧角内的定位 NOS免疫反应(NOS-IR)阳性胞体，见于NOSⅠ抗血清孵育的切片，而NOSⅡ和NOSⅢ均呈阴性反应. 其NOSⅠ-IR阳性染色较强. 位于IML的免疫阳性胞体、树突明显. 可见NOS-IR神经元的突起伸向灰质中央管周围(Ⅹ层)、前角(ⅩⅢ和ⅠⅩ层)、以及外侧白质. 串珠状NOS-IR轴突样纤维罕见. 少数NOSⅠ-IR阳性胞体分散于其他部位，如中央管周围和后角等处(Fig 3，4). NADPH-d阳性反应胞体在IML的分布，与NOSⅠ-IR阳性神经元的相似. NADPH-d阳性神经元呈深蓝色染色，可见许多阳性反应的串珠状轴突样纤维，形态与NMDAR2A/B-IR样纤维终末相似，呈分叉样、线条形等，围绕或紧贴阳性胞体或树突分布(Fig 5，6).
2.4 NMDA受体亚单位、NOS和NADPH-d在脊髓IML内的生后发育 在生后早期(P7～P28)内，NMDAR1-IR,NMDAR2A/B-IR,NOS-IR和NADPH-d 阳性结构呈现一定的动态变化. 阳性胞体、树突等的染色强度和阳性纤维密度，在生后7 d(P7)微弱(+)，随后P14逐渐增强()，至P21达高峰水平()，并于此水平维持至成体(). NMDAR2A/B-IR轴突样纤维的密度，P7时稀疏(+)，随后P14逐渐增加()，至P21达高峰水平()，但在P28又稍下降()，然后保持此水平至成年(). 脊髓侧角的NMDAR1-IR,NMDAR2A/B-IR,NOSⅠ-IR和NADPH-d阳性神经元胞体计数后，分别除以相邻切片上尼氏染色神经元胞体数目，求得各个年龄组的百分率(Fig 7). 可见阳性细胞所占比率，在出生后4 wk内变化较大，总的趋势是阳性细胞所占比率随年龄增长逐渐增加，P21或P28时接近成体水平. 相邻不同年龄组比较发现，阳性细胞所占比率，相邻组别具有显著性差异(P<0.05)的组别详见Fig 7(星号表示与前一组有差别). P70与P28组间无显著差异. 另外，出生后的头2 wk内，NMDAR1-IR和NMDAR2A/B-IR细胞比率显著大于NOSⅠ-IR和NADPH-d阳性细胞. 而在同一年龄组内，NMDAR1-IR与NMDAR2A/B阳性细胞比率之间，以及NOSⅠ-IR和NADPH-d阳性细胞比率之间，无显著性差异.
, http://www.100md.com
图 1 NMDAR2A/B免疫反应阳性结构在成鼠脊髓(T6-8)的分布
Fig 1 Distribution of NMDAR2A/B-immunoreactive (IR) structures in middle thoracic (T6-8) spinal cord of adult rat
Scale bar=500 μm,↑: Intermediolateral column (IML).
图 2 脊髓中间外侧柱内NMDAR2A/B免疫反应阳性神经元
Fig 2 Showing NMDAR1-IR IML neurons
Scale bar=50 μm,↑: The positive neuronal soma and axon fibers.
, 百拇医药
图 3 NOSⅠ免疫反应阳性结构在脊髓(T6-8)的分布
Fig 3 Distribution of NOSⅠ-IR structures in middle thoracic spinal cord of adult rat
Scale bar=500 μm,↑: IML.
图 4 示脊髓中间外侧柱NOS免疫反应阳性神经元
Fig 4 NOSI-IR neurons in IML
Scale bar=50 μm, ↑: The positive neuronal somata.
图 5 NADPH-d阳性结构在脊髓(T6-8)的分布
, 百拇医药
Fig 5 Distribution of NADPH-d positive structures in middle thoracic spinal cord of adult rat
Scale bar = 500 μm,↑: IML.
图 6 示脊髓中间外侧柱NADPH-d阳性神经元
Fig 6 NADPH-d positive IML neurons
Scale bar = 50 μm, ↑: The positive neuronal soma and axon fibers.
3 讨论
本研究显示NMDA受体亚基蛋白(NMDAR1,NMDAR2A/B)和NOSⅠ丰富地定位于在大鼠脊髓侧角神经元的胞体、树突、以及轴突样纤维终末上. 发现生后早期(P7～P28)NMDA受体和NOSI的表达具有明显的动态变化，呈逐渐上调的趋势，高峰水平的表达在P21左右， 并且NMDAR的表达在时间顺序上先于NOS的表达. NMDA受体亚基(NMDAR1 和NMDAR2A/B)在前角神经元胞体、树突的定位情况，与Monaghan 等[4]关于NMDA受体亚基mRNAs分布相符. 在我们应用NMDAR2B和NMDAR2C抗体孵育的脊髓切片上，NMDAR2B染色呈阴性反应，NMDAR2C的免疫染色微弱(未发表资料). Tolle等[5] 还检测到微弱的NMDAR2D mRNA信号. 体内NMDA受体组成差别上的机能意义，特别是NMDAR2A-D之间的不同，目前还不十分清楚. 以往的研究[1，4]表明功能性受体是由NMDAR1和不同的NMDAR2A-D亚基组成的异聚性受体(heteromeric configuration). 而同聚性(homomeric)受体没有通道效应，如成年动物小脑的蒲氏细胞只有NMDAR1亚基，检测不到NMDA受体的通道活性. 不同的NMDAR2亚基构成的NMDA受体，其离子通道特性(通道电流)有差别，含NMDAR2A的受体具备较快的离子通道动力学特征. 视觉相关神经元的发育研究[8]说明，随着神经元的逐渐成熟，突触部位NMDAR2A亚基的数量逐渐增加. 我们认为NMDAR1和NMDAR2A可能也是脊髓侧角交感神经元功能性NMDA受体的主要组分. NMDAR2A/B-IR阳性轴突样纤维终末的存在，提示NMDA受体具有突触前定位. 这些轴突样纤维终末的来源还不清楚，NMDA受体的突触前定位的详细情况，如突触区分布或突触外分布特征、亚基构成上是否与突触后受体一样等，也有待于免疫电镜的进一步研究.
, http://www.100md.com
图 7 NMDAR1,NMDAR2A/B，NOSⅠ和NADPH-d阳性IML细胞生后发育时期的动态变化
Fig 7 Dynamic change of percentages of positive IML neuron (NMDAR1-, NMDAR2A/B-, NOSⅠ-, or NADPH-d positive neurons/total Nissl's stained neurons ) during postanatal developing stages (n=6～8;±s). P<0.05 vs previous neighbouring group
NMDAR1:N-methyl-aspartate receptor subunit1; NMDAR2A/B: N-methyl-aspartate receptor subunit2A/B; NOSⅠ: Nitric oxide synthase I; NADPH-d: NADPH-diaphorase
, 百拇医药
脊髓侧角主要为中型或小型的运动神经元，构成内脏性运动传出的环路基础. 在神经组织发育成熟与神经环路的建立中，突触的发育成熟是其关键的环节，功能性谷氨酸受体的装配或表达与兴奋性突触形成密切相关[8]. 以往的研究[9]证明， NMDA受体的激活诱发脊髓交感节前神经元EPSP产生，在CNS的其他部位，外周性传入信息也可引起NMDA受体和树突棘(兴奋性突触所在部位)的快速变化. 对NOS生前发育研究[10]表明，脊髓的NOS表达出现在胚胎的13 d. 我们对生后P21或P28内的发育观察发现， NMDA受体、NOS表达和NADPH-d活性呈现明显的动态变化，可见NMDA受体的表达领先于NOS表达，在同一时间点，NMDA受体的表达水平高于NOS表达和NADPH-d活性，表明在生后3 wk或4 wk内是侧角运动神经元NMDA受体装配和NOS表达与活化的重要时期，NMDA受体可能调节NOS的表达. 这些研究提示NMDA受体-NO通路可能参与脊髓侧角交感神经元的发育成熟调节过程.
, http://www.100md.com
致 谢 本校神经科学研究所陈良为博士对我们的工作给予了热情支持和帮助.
编辑 王 睿
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30040012)
作者简介：魏丽春(1963-)，女(汉族)，山东省德州市人. 1985年山东潍坊医学院毕业，硕士，讲师，研究方向放射病理. Tel.(029)3375432 Email.lwchen@pub.xaonline.com
参考文献:
[1] 韩济生. 神经科学原理[M]. 第2版. 北京: 北京医科大学协和医科大学联合出版社，1999:524-538.
[2] Morris R, Southam E, Gittins SR et al. The NO-cGMP pathway in neonatal rat dorsal horn[J]. Eur J Neurosci, 1994; 6(5): 876-879.
, 百拇医药
[3] Vogel M, Luck G, Bachmann S et al. NOS type-1 mRNA expression and protein localization in spinal autonomic neurons[J]. Neuroreport, 1997; 8(15):3389-3393.
[4] Monaghan DT, Wenthold RJ. The ionotropic glutamate receptors[M]. New Jersey: Humana Press, 1997:149-219.
[5] Tolle TR, Berthele A, Zieglgansberger W et al. The differential expression of 16 NMDA and non-NMDA receptor subunits in the rat spinal cord and in periaqueductal gray[J]. J Neurosci, 1993;13(12): 5009-5028.
, 百拇医药
[6] 魏丽春，郭 鹞. 一氧化氮合酶在小鼠肠道壁的分布[J]. 第四军医大学学报, 1994;15(6):436-439.
[7] Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates[M]. 4th ed. San Diego：Academic Press, 1998:15-54.
[8] Fox K, Henley J, Issae J. Experience-dependent development of NMDA receptor transmission[J]. Nat Neurosci, 1999; 2(4): 297-299.
[9] Spanswick D, Renaud LP, Logan SD. Bilaterally evoked monosynaptic EPSPs, NMDA receptors and potentiation in rat sympathetic preganglionic neurons in vitro[J]. J Physiol (Lond), 1998; 509 (Pt 1): 195-209.
[10] Bruning G, Mayer B. Prenatal development of nitric oxide synthase in the mouse spinal cord[J]. Neurosci Lett, 1996; 202(3): 189-192.
收稿日期:1999-12-03; 修回日期:2000-01-17, 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院放射治疗科，陕西 西安 710033
关键词：NMDA受体；一氧化氮合酶；脊髓中间外侧柱；生后发育
第四军医大学学报001003 摘 要： 目的 探讨N-甲基-天冬氨酸受体(NMDAR1和NMDAR2A/B亚基)、一氧化氮合酶(NOS)及还原型辅酶II硫辛酰胺脱氢酶(NADPH-d)活性在大鼠脊髓中间外侧柱(IML)的定位与生后发育特征. 方法 在甲醛固定的脊髓切片上，进行ABC法免疫染色和NADPH-d组织化学反应与半定量分析. 结果 NMDAR1，NMDAR2A/B，NOSⅠ和NADPH-d反应产物丰富地分布于IML，主要定位于神经元胞体、树突和轴突样纤维终末. 在生后早期发育中它们具有明显的动态变化，生后7 d(P7)有微弱或中等的表达，随后逐渐上调，P21或P28达到高峰，然后保持于此水平于成体动物. 结论 NMDA受体-NO通路可能是脊髓交感节前神经元一条重要的细胞内信号途径，并参与神经元生后发育成熟的调控过程.
, 百拇医药
中图号：R329 文献标识码： A
文章编号：1000-2790(2000)10-1178-04
Localization and postnatal development of NMDA receptors and NOS in intermediolateral column of spinal cord of adult rats
WEI Li-Chun, SHI Mei, MA Hai-Xin， WANG Zhi-Xiang
(Department of Radiotherapy, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University，Xi'an 710033, China)
Abstract:AIM To investigate the cellular localization and early postnatal development of N-methyl-aspartate (NMDA) receptor subunits (NMDAR1 and NMDAR2A/B)， nitric oxide synthase (NOS) and NADPH-diaphorase activity in the intermediolateral column (IML) of the spinal cord in adult rats. METHODS ABC immunohistochemical staining and NADPH-d histochemistry were made in paraformaldehyde-fixed spinal cord sections. RESULTS NMDAR1-, NMDAR2A/B-, NOSI-immunoreactivity, or NADPH-diaphorase activity was abundant in IML. They were mainly located in neuronal somata, dendrites and axon terminals. Dynamic changes of NMDA receptor subunits， NOS and NADPH-d activity occurred in early postnatal developing stages. Expression of NMDA receptor subunits and NOSI was weak or moderate at postnatal 7 days (P7), went up at P14, reached maximum level at P21 or P28, then remained stable at this level until adult. CONCLUSION NMDA receptor-NO may be an important intracellular signal pathway of pre-sympathetic neurons and involved in the neuronal maturation during postnatal development of rat spinal cord.
, 百拇医药
Keywords: NMDA receptors; nitric oxide synthase; intermediolateral column of spinal cord; postnatal development
0 引言
近年来的研究[1，2]表明，在CNS内存在着N-甲基-天冬氨酸(NMDA)受体-一氧化氮(nitric oxide，NO)信号通路，是神经元兴奋性信号转导和可塑性变化的重要途径. 脊髓中间外侧柱(intermediolateral column，IML)为交感节前神经元聚集之处，含有丰富的NO及其NOS(nitric oxide synthase，NOS)[3]. 但NMDA受体在脊髓侧角内的分布特征还存在争议. 以往的受体结合实验证明脊髓侧角存在NMDA结合位点，Monaghan等[4]观察到NMDAR2A mRNA在脊髓运动神经元有丰富的定位，但Tolle等[5]没有检测到NMDAR2A mRNA的分布. NMDA受体-NO通路是否存在于脊髓交感节前神经元？该信号通路在脊髓交感节前神经元的发育特征及其意义如何？值得进一步研究. 因此，我们利用免疫组织化学等方法，对NMDA受体亚单位(NMDAR1，NMDAR2A/B)，NOS(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ)和NADPH-d活性等在大鼠脊髓IML的细胞学定位和生后发育规律进行了探讨.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 正常雄性SD幼年与成年大鼠34只，由本校实验动物中心提供，分为以下5组. Ⅰ：生后7 d(postnatal 7 days，P7；n=8)；Ⅱ： P14 (n=8)；Ⅲ：P21(n=6)；Ⅳ：P28 (n=6)；V：P70(n=6). 动物在戊巴比妥钠麻醉下, 开胸、经左心室至主动脉插管, 用生理盐水约50 mL快速冲去血液, 随即灌注含40 g*L-1多聚甲醛0.1 mol*L-1的磷酸缓冲液(pH 7.4),灌流30 min. 注毕立即取出脊髓, 4℃下后固定4 h. 然后换入30 g*L-1蔗糖溶液内，4℃下过夜. 冰冻连续冠状切片(包括C6-T1，T6-8和 T11-L3共3段)，片厚40 μm. 切片按顺序分为数套，分别作Nissl染色，NMDAR1，NMDAR2A/B，NOSⅠ，NOSⅡ，NOSⅢ，NADPH-d和对照染色.
1.2 方法 采用免疫组织化学反应(ABC法). 切片于 10 mmol*L-1 PBS内涮洗, 再入含0.3 mL*L-1 过氧化氢溶液内处理30 min，用以灭活内源性过氧化物酶. 经PBS涮洗后，分别入第一抗体血清(用含2 mL*L-1 正常山羊血清和0.1 mL*L-1 Triton X-100的PBS稀释)内，4℃下孵育48 h. 第1抗体均为Chemicon公司产品，包括小鼠抗NMDAR1 mAb (1∶1000)、 兔抗NMDAR2A/B多克隆抗体(1∶1000，所用抗原为结合于BSA的NMDAR2A受体亚基的C末端多肽，抗体测定证明它还识别NMDAR2B)、兔抗NOSⅠ多克隆抗体(1∶2000)、兔抗NOSⅡ多克隆抗体(1∶1000)和兔抗NOSⅢ多克隆抗体(1∶1000). 入biotin标记的羊抗兔IgG (1∶200，Vector公司产品)溶液，室温下放置4 h. 入ABC复合物(1∶200, Vector公司产品)溶液，室温下孵育2 h. 每次抗体孵育后均用PBS涮洗，3×10 min. 最后入DAB/H2O2溶液 (0.05 g*L-1/0.01 g*L-1) 反应10 min. 另外，用正常血清溶液代替特异性第一抗体孵育切片，作为免疫染色对照. NADPH-d 组化反应，按作者已报道[6]的方法进行. 按Paxinos大鼠立体定位图谱划分法[7]行半定量分析，观察重点范围为脊髓胸段侧角(IML). 参照以往的定量方法[5]，对免疫染色阳性结构(胞体、纤维)的染色强度和分布密度进行半定量分析. 其中，胞体的染色分别用强()，中等()，弱(+)和阴性(-)表示； 阳性纤维的密度则分为密集()，中等()，稀疏(+)和阴性(-)4级. 免疫染色和NADPH-d阳性细胞的半定量分析，通过分别计数相邻40 μm厚切片上阳性神经元和尼氏染色胞体，比较两者比率(免疫阳性胞体/尼氏染色胞体)在生后发育中的变化.
, 百拇医药
统计学处理: 将上述5组动物的免疫阳性胞体/尼氏染色胞体比率(
±s)，反正旋转换后，相邻组别作单因素χ2检验.2 结果
2.1 免疫反应产物的定位特征 在应用特异性第一抗体孵育的切片上，免疫反应产物呈深棕色，主要定位于神经元胞体、突起上. 在大鼠脊髓内，NMDAR1，NMDAR2A/B和NOSⅠ的免疫阳性产物，密集地分布于位于灰质ⅤⅡ层的IML. 在灰质Ⅰ至Ⅵ层、ⅤⅢ至X层内也有不同程度的分布. NMDAR1和NMDAR2A/B的免疫阳性产物还见于白质(胶质细胞)内. 在用正常血清取代特异性第一抗体进行孵育的切片上，呈阴性反应.
2.2 NMDA受体亚基在成鼠脊髓侧角内的定位 NMDAR1与NMDAR2A/B染色强度在各脊髓胸部节段相似. 免疫反应阳性结构主要为神经元胞体、树突、以及轴突样纤维终末. 位于的IML NMDAR1免疫反应(NMDAR1-immunoreactive，NMDAR1-IR)阳性胞体多为中等大小(胞体直径约20～30 μm)和小型的神经元(胞体直径小于20 μm). 大型(胞体直径大于30 μm)少见. 胞体多为椭圆形或不规则三角形. 可见NMDAR1-IR树突，有的与阳性胞体相连续. NMDAR2A/B-IR的染色较NMDAR1强，胞体上的NMDAR2A/B-IR阳性产物呈大颗粒状或小斑块状. 其阳性胞体的大小、数目和分布形式与NMDAR1-IR神经元相似. 最主要的差别是，在侧角分布有许多的NMDAR2A/B-IR轴突样纤维，密度中等. 阳性纤维带有许多膨体，呈串珠状. 形态上为轴突样纤维终末结构，它们呈环状，分叉样、线条形排列，有的纤维围绕或紧贴阳性胞体或树突分布. 可见轴突样纤维延伸于侧角灰质和白质侧束之间(Fig 1，2).
, 百拇医药
2.3 NOS和NADPH-d在成鼠脊髓侧角内的定位 NOS免疫反应(NOS-IR)阳性胞体，见于NOSⅠ抗血清孵育的切片，而NOSⅡ和NOSⅢ均呈阴性反应. 其NOSⅠ-IR阳性染色较强. 位于IML的免疫阳性胞体、树突明显. 可见NOS-IR神经元的突起伸向灰质中央管周围(Ⅹ层)、前角(ⅩⅢ和ⅠⅩ层)、以及外侧白质. 串珠状NOS-IR轴突样纤维罕见. 少数NOSⅠ-IR阳性胞体分散于其他部位，如中央管周围和后角等处(Fig 3，4). NADPH-d阳性反应胞体在IML的分布，与NOSⅠ-IR阳性神经元的相似. NADPH-d阳性神经元呈深蓝色染色，可见许多阳性反应的串珠状轴突样纤维，形态与NMDAR2A/B-IR样纤维终末相似，呈分叉样、线条形等，围绕或紧贴阳性胞体或树突分布(Fig 5，6).
2.4 NMDA受体亚单位、NOS和NADPH-d在脊髓IML内的生后发育 在生后早期(P7～P28)内，NMDAR1-IR,NMDAR2A/B-IR,NOS-IR和NADPH-d 阳性结构呈现一定的动态变化. 阳性胞体、树突等的染色强度和阳性纤维密度，在生后7 d(P7)微弱(+)，随后P14逐渐增强()，至P21达高峰水平()，并于此水平维持至成体(). NMDAR2A/B-IR轴突样纤维的密度，P7时稀疏(+)，随后P14逐渐增加()，至P21达高峰水平()，但在P28又稍下降()，然后保持此水平至成年(). 脊髓侧角的NMDAR1-IR,NMDAR2A/B-IR,NOSⅠ-IR和NADPH-d阳性神经元胞体计数后，分别除以相邻切片上尼氏染色神经元胞体数目，求得各个年龄组的百分率(Fig 7). 可见阳性细胞所占比率，在出生后4 wk内变化较大，总的趋势是阳性细胞所占比率随年龄增长逐渐增加，P21或P28时接近成体水平. 相邻不同年龄组比较发现，阳性细胞所占比率，相邻组别具有显著性差异(P<0.05)的组别详见Fig 7(星号表示与前一组有差别). P70与P28组间无显著差异. 另外，出生后的头2 wk内，NMDAR1-IR和NMDAR2A/B-IR细胞比率显著大于NOSⅠ-IR和NADPH-d阳性细胞. 而在同一年龄组内，NMDAR1-IR与NMDAR2A/B阳性细胞比率之间，以及NOSⅠ-IR和NADPH-d阳性细胞比率之间，无显著性差异.
, http://www.100md.com
图 1 NMDAR2A/B免疫反应阳性结构在成鼠脊髓(T6-8)的分布
Fig 1 Distribution of NMDAR2A/B-immunoreactive (IR) structures in middle thoracic (T6-8) spinal cord of adult rat
Scale bar=500 μm,↑: Intermediolateral column (IML).
图 2 脊髓中间外侧柱内NMDAR2A/B免疫反应阳性神经元
Fig 2 Showing NMDAR1-IR IML neurons
Scale bar=50 μm,↑: The positive neuronal soma and axon fibers.
, 百拇医药
图 3 NOSⅠ免疫反应阳性结构在脊髓(T6-8)的分布
Fig 3 Distribution of NOSⅠ-IR structures in middle thoracic spinal cord of adult rat
Scale bar=500 μm,↑: IML.
图 4 示脊髓中间外侧柱NOS免疫反应阳性神经元
Fig 4 NOSI-IR neurons in IML
Scale bar=50 μm, ↑: The positive neuronal somata.
图 5 NADPH-d阳性结构在脊髓(T6-8)的分布
, 百拇医药
Fig 5 Distribution of NADPH-d positive structures in middle thoracic spinal cord of adult rat
Scale bar = 500 μm,↑: IML.
图 6 示脊髓中间外侧柱NADPH-d阳性神经元
Fig 6 NADPH-d positive IML neurons
Scale bar = 50 μm, ↑: The positive neuronal soma and axon fibers.
3 讨论
本研究显示NMDA受体亚基蛋白(NMDAR1,NMDAR2A/B)和NOSⅠ丰富地定位于在大鼠脊髓侧角神经元的胞体、树突、以及轴突样纤维终末上. 发现生后早期(P7～P28)NMDA受体和NOSI的表达具有明显的动态变化，呈逐渐上调的趋势，高峰水平的表达在P21左右， 并且NMDAR的表达在时间顺序上先于NOS的表达. NMDA受体亚基(NMDAR1 和NMDAR2A/B)在前角神经元胞体、树突的定位情况，与Monaghan 等[4]关于NMDA受体亚基mRNAs分布相符. 在我们应用NMDAR2B和NMDAR2C抗体孵育的脊髓切片上，NMDAR2B染色呈阴性反应，NMDAR2C的免疫染色微弱(未发表资料). Tolle等[5] 还检测到微弱的NMDAR2D mRNA信号. 体内NMDA受体组成差别上的机能意义，特别是NMDAR2A-D之间的不同，目前还不十分清楚. 以往的研究[1，4]表明功能性受体是由NMDAR1和不同的NMDAR2A-D亚基组成的异聚性受体(heteromeric configuration). 而同聚性(homomeric)受体没有通道效应，如成年动物小脑的蒲氏细胞只有NMDAR1亚基，检测不到NMDA受体的通道活性. 不同的NMDAR2亚基构成的NMDA受体，其离子通道特性(通道电流)有差别，含NMDAR2A的受体具备较快的离子通道动力学特征. 视觉相关神经元的发育研究[8]说明，随着神经元的逐渐成熟，突触部位NMDAR2A亚基的数量逐渐增加. 我们认为NMDAR1和NMDAR2A可能也是脊髓侧角交感神经元功能性NMDA受体的主要组分. NMDAR2A/B-IR阳性轴突样纤维终末的存在，提示NMDA受体具有突触前定位. 这些轴突样纤维终末的来源还不清楚，NMDA受体的突触前定位的详细情况，如突触区分布或突触外分布特征、亚基构成上是否与突触后受体一样等，也有待于免疫电镜的进一步研究.
, http://www.100md.com
图 7 NMDAR1,NMDAR2A/B，NOSⅠ和NADPH-d阳性IML细胞生后发育时期的动态变化
Fig 7 Dynamic change of percentages of positive IML neuron (NMDAR1-, NMDAR2A/B-, NOSⅠ-, or NADPH-d positive neurons/total Nissl's stained neurons ) during postanatal developing stages (n=6～8;
±s). P<0.05 vs previous neighbouring groupNMDAR1:N-methyl-aspartate receptor subunit1; NMDAR2A/B: N-methyl-aspartate receptor subunit2A/B; NOSⅠ: Nitric oxide synthase I; NADPH-d: NADPH-diaphorase
, 百拇医药
脊髓侧角主要为中型或小型的运动神经元，构成内脏性运动传出的环路基础. 在神经组织发育成熟与神经环路的建立中，突触的发育成熟是其关键的环节，功能性谷氨酸受体的装配或表达与兴奋性突触形成密切相关[8]. 以往的研究[9]证明， NMDA受体的激活诱发脊髓交感节前神经元EPSP产生，在CNS的其他部位，外周性传入信息也可引起NMDA受体和树突棘(兴奋性突触所在部位)的快速变化. 对NOS生前发育研究[10]表明，脊髓的NOS表达出现在胚胎的13 d. 我们对生后P21或P28内的发育观察发现， NMDA受体、NOS表达和NADPH-d活性呈现明显的动态变化，可见NMDA受体的表达领先于NOS表达，在同一时间点，NMDA受体的表达水平高于NOS表达和NADPH-d活性，表明在生后3 wk或4 wk内是侧角运动神经元NMDA受体装配和NOS表达与活化的重要时期，NMDA受体可能调节NOS的表达. 这些研究提示NMDA受体-NO通路可能参与脊髓侧角交感神经元的发育成熟调节过程.
, http://www.100md.com
致 谢 本校神经科学研究所陈良为博士对我们的工作给予了热情支持和帮助.
编辑 王 睿
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30040012)
作者简介：魏丽春(1963-)，女(汉族)，山东省德州市人. 1985年山东潍坊医学院毕业，硕士，讲师，研究方向放射病理. Tel.(029)3375432 Email.lwchen@pub.xaonline.com
参考文献:
[1] 韩济生. 神经科学原理[M]. 第2版. 北京: 北京医科大学协和医科大学联合出版社，1999:524-538.
[2] Morris R, Southam E, Gittins SR et al. The NO-cGMP pathway in neonatal rat dorsal horn[J]. Eur J Neurosci, 1994; 6(5): 876-879.
, 百拇医药
[3] Vogel M, Luck G, Bachmann S et al. NOS type-1 mRNA expression and protein localization in spinal autonomic neurons[J]. Neuroreport, 1997; 8(15):3389-3393.
[4] Monaghan DT, Wenthold RJ. The ionotropic glutamate receptors[M]. New Jersey: Humana Press, 1997:149-219.
[5] Tolle TR, Berthele A, Zieglgansberger W et al. The differential expression of 16 NMDA and non-NMDA receptor subunits in the rat spinal cord and in periaqueductal gray[J]. J Neurosci, 1993;13(12): 5009-5028.
, 百拇医药
[6] 魏丽春，郭 鹞. 一氧化氮合酶在小鼠肠道壁的分布[J]. 第四军医大学学报, 1994;15(6):436-439.
[7] Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates[M]. 4th ed. San Diego：Academic Press, 1998:15-54.
[8] Fox K, Henley J, Issae J. Experience-dependent development of NMDA receptor transmission[J]. Nat Neurosci, 1999; 2(4): 297-299.
[9] Spanswick D, Renaud LP, Logan SD. Bilaterally evoked monosynaptic EPSPs, NMDA receptors and potentiation in rat sympathetic preganglionic neurons in vitro[J]. J Physiol (Lond), 1998; 509 (Pt 1): 195-209.
[10] Bruning G, Mayer B. Prenatal development of nitric oxide synthase in the mouse spinal cord[J]. Neurosci Lett, 1996; 202(3): 189-192.
收稿日期:1999-12-03; 修回日期:2000-01-17, 百拇医药