变形链球菌耐氟菌株脱矿能力的体外研究*
作者：盛江筠 刘正
单位：盛江筠(第二医科大学附属第九人民医院， 上海 200011)；刘正(第二医科大学附属第九人民医院， 上海 200011)
关键词：变形链球菌；耐氟菌株；脱矿；氟化物
牙体牙髓牙周病学杂志000105 摘 要：目的：探讨变形链球菌耐氟突变后，其致釉质片脱矿能力的改变。方法：采用原子吸收分光光度计，测定不同氟浓度条件下变形链球菌耐氟菌株培养物上清液中钙离子浓度，并与亲代菌株进行比较。结果：耐氟菌株脱矿量在无氟化物存在时，小于亲代菌株；而当0.5mmol/L氟离子存在情况下，其脱矿量大于亲代菌株。差异具显著性。结论：耐氟菌株的产生将增加变形链球菌的致龋力。
分类号：R780.2 文献标识码：A
文章编号：1005-2593(2000)01-0013-03
, http://www.100md.com
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000，10(1)：13]
A study on demineralization of enamel by fluoride-resistant
strains of streptococcus mutans in vitro
SHENG Jiang-yun, LIU Zheng
(The Ninth Affiliated Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011)
Abstract：AIM：To find out the enamel demineralization of S. mutans after fluoride-resistant mutation in vitro. METHODS：The calcium and phosphorus in the supernate of F-resistant and F-sensitive S.mutans media were measured by atomic absorbance spectrophotometer in the presence of 0, 0.05,or 0.5mmol/L NaF。 RESULTS： The fluoride-resistant strains demineralized enamel less than did their parent, wild-type strains when on fluoride existed; whereas the result was opposite in the presence of 0.5mmol/L F. CONCLUSION：The emergence of fluorid-resistant strains will enhance the cariogenicity of S. mutans
, 百拇医药
Key words：streptococcus mutans; fluoride-resistant strain; demineralization; fluoride
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(1):13]▲
变形链球菌(以下简称变链菌)为人类龋齿主要致病菌，其高致龋力与自身具有很强的产酸力和脱矿力有关。局部高浓度氟化物的广泛应用可导致变链菌耐氟菌株的产生。国外学者已在体内及体外获得变链菌耐氟菌株，并对其致龋毒力进行研究[1，2]。为探讨国人变链菌耐氟菌株脱矿能力的改变，本实验在体外通过测定变链菌耐氟菌株及亲代菌株致釉质脱矿量，以推测其致龋能力的改变。
1 材料和方法
1.1 细菌和培养基
, http://www.100md.com
变链菌亲代野生菌株为国际参考株S.mutans Ingbritt和本实验室临床分离株SSMU-M1；耐氟菌株为上述亲代菌株体外经逐步诱导法获得[3]，分别命名为Ingbritt-FR和M1-FR。
培养基为含40g/L葡萄糖的乳酪消化大豆胨肉汤TSB。
1.2 菌悬液及培养基配制
按常规将4种待测菌株活化后，于TSB培养基中37℃微需氧培养18h。离心收集细菌。生理盐水调吸光度ABS为1.0，备用。
在含40g/L葡萄糖TSB培养基中加入20g/L NaF液使终度分别为0、0.05和0.5mmol/L，用以细菌脱矿实验。
1.3 釉质片的制作
选择临床上因正畸需要而拔除的上颌前磨牙，体视显微镜下观察无龋，无裂痕，无斑釉症及四环素牙等疾患。彻底洗刷干净，切去牙根，取冠部釉质冷水冲洗下磨制成4mm×4mm×1mm大小釉质片，超声清洗5min，750ml/L乙醇消毒72h，备用。
, 百拇医药
1.4 细菌脱矿实验
将消毒好的釉质片用无菌生理盐水冲洗3次后，置于含有不同氟浓度的TSB培养基中，每个试管置4片，再按菌液：培养基为1：10(v/v)比例接种细菌，37℃微需氧培养72h(950ml/L N2，50ml/L CO2)。以不接种细菌但含有釉质片的TSB培养基作阴性对照。
1.5 培养基中钙、磷浓度测定
将含有釉质片的72h细菌培养物，经3?000r/min离心15min，取2ml上清液，用2g/L LaCl3溶液稀释后，在原子吸收分光光度计(VIDEO22型，美国实验仪器公司)上，以灯电流5mA，波长422.7nm，狭缝宽度1.0nm以下，用火焰原子吸收法进行检测。
2 结果
, 百拇医药
各菌株在不同氟离子浓度下对釉质片的脱矿情况(表1)。
表1 变链菌及耐氟菌株在不同氟浓度下的脱矿量 (n=4) 菌株
F- mmol/L
Ca2+mg/L
P3+mg/L
Ingbritt
0
158.69±17.39
2.33±0.59
0.05
, 百拇医药
44.10±14.79
0.93±0.21
0.5
8.91±0.82
0.74±0.04
SSMU-M1
0
161.91±19.41
1.43±0.08
0.05
48.50±20.40
1.16±0.11
, 百拇医药
0.5
9.80±0.80
0.99±0.05
Ingbritt-FR△
0
80.02±51.07*
0.89±0.11*
0.05
42.73±1.13
0.88±0.07
0.5
, 百拇医药
15.53±3.20*
0.90±0.01*
M1-FR△
0
75.65±37.19*
1.02±0.08**
0.05
62.69±36.64
1.19±0.07
0.5
14.76±1.67*
, 百拇医药
1.54±0.36*
△表示耐氟菌株； 与亲代菌株相比， *P<0.05，**P<0.01，有显著性差异
经Student t检验：F=0mmol/L时，亲代菌株Ingbritt和SSMU-M1致釉质脱出的钙、磷离子量多于耐氟菌株Ingbritt-FR 和M1-FR(P<0.05)；F=0.05mmol/L(相当于2mg/L)时，二者脱矿量相近；F=0.5mmol/L时，耐氟菌株脱矿量大于亲代菌株(P<0.05)。临床分离株与国际参考株表现相同(表1)。
3 讨论
釉质内含有大量无机物，按重量计算占95%，其中绝大部分为含有磷酸钙的羟基磷灰石晶体。所以，釉质中含有最多的无机组份是钙，其次为磷，钙与磷呈平行分布，且釉质内Ca/P比值保持恒定，一般为1.60±0.08。龋齿是由于菌斑细菌酵解碳水化合物产生酸，酸积累达到一定数量和时间，牙齿中的矿物质发生溶解，钙和磷等无机离子由牙齿中脱出，发生脱矿而开始。
, 百拇医药
本实验发现，变链菌亲代菌株和耐氟菌株产生的乳酸量皆可导致釉质片脱矿。在无氟条件下，脱矿量很大，最大钙离子浓度为161.91mg/L(SSMU-M1)。氟的加入，可减少钙和磷的溶出量，至0.5mmol/L氟离子浓度时，脱矿量有大幅度下降，但仍有部分钙磷溶出，且钙与磷的溶出量基本呈平行关系。本实验室所做的产酸实验发现，变链菌亲代株及耐氟株皆可使培养基终末pH值降至4.0左右，且在0.5mmol/L氟离子浓度下，仍可使pH值降至5.0以下。虽然细菌产酸使环境pH值降低的数值在有无釉质存在下是不同的[3]，但该结果仍可说明耐氟菌株产酸量与脱矿量相吻合，即有无氟化物存在，耐氟菌皆可导致釉质片的脱矿。表明耐氟菌株具有致龋潜力。这与van Loveren等学者的研究结果相吻合[4]。
从表1还可看出，无氟条件下，亲代菌株Ingbritt和SSMU-M1的脱矿量大于相应耐氟菌株Ingbritt-FR和M1-FR，这与pH7.0时两种菌株产酸能力相符。实验中还发现：在低浓度氟离子0.05mmol/L存在时，亲代菌株与耐氟菌株钙磷溶出量无显著性差异。当釉质存在时，氟化物有两方面作用：一是降低细菌产酸量，二是减慢釉质溶解速度。这两个作用对环境pH值可产生相反影响。产酸的抑制可升高终末pH值，而降低牙釉质的溶解速度，因为减少了由于釉质溶解而产生的缓冲作用，最终导致pH值的下降。研究发现，在0.5mmol/L 氟离子浓度时，氟化物抑制变链菌C180-2的产酸作用要占总作用的75%，而0.05mmol/L氟离子浓度时，氟对细菌产酸和釉质脱矿的两个作用达到平衡，终末pH值无变化[5]。本实验结果显示，0.05mmol/L氟离子浓度时，细菌脱矿受到抑制，但耐氟菌株与亲代菌株钙、磷离子释出量无明显差异；而0.5mmol/L氟离子浓度时，细菌产酸脱矿过程受到明显抑制，上清液中钙、磷离子浓度明显下降。但耐氟菌株受抑制程度较轻，其脱矿量明显大于亲代菌株脱矿量。说明氟化物的存在，特别是0.5mmol/L左右氟化物的存在，不能很好抑制耐氟菌株的生长和代谢。
, 百拇医药
牙菌斑有吸收氟和蓄积氟的能力，正常情况下菌斑氟离子浓度为0.5mmol/L左右[5]。该结果提示，在正常菌斑氟离子浓度条件下，耐氟菌株的致龋潜力将大于亲代变链菌株。说明氟化物的应用存在一定局限性。在临床防龋过程中，应寻找其它药物与之联合使用，以达到同样甚至更好的防龋效果，而又可防止耐氟现象的发生。■
*国家自然科学基金资助课题 (39870780)
参考文献：
[1]Brown IR, White JO, Horton IM, et al. Effect of continuous fluoride gel use on plaque flouride retention and microbial activity. J Dent Res, 1983,62(6):746
[2]Hoelcher GL, Hudson MC. Characterization of an unusual fluoride-resistant Streptococcus mutans isolate. Curr Microbiol, 1996,32:156
, 百拇医药
[3]Van Loveren C, Spitz LM, Buijs JF, et al. In vitro demineralization of enamel by F-sensitive and F-resistant Mutans Streptococci in the presence of 0, 0.05, or 0.5mmol/L NaF. J Dent Res, 1991,70(12):1491
[4]van Loveren C, Fielmich AM, Ten Brink B. Comparison of the effects of fluoride and the ionophore nigericin on acid production by Streptococcus mutans and the resultant in vitro enamel demineralization. J Dent Res, 1987,66:1658
[5]Marquis RE. Antiomicrobial actins of fluoide for oral bacteria. Can J Microbiol, 1995,41:995
收稿日期：1999-07-07, 百拇医药
单位：盛江筠(第二医科大学附属第九人民医院， 上海 200011)；刘正(第二医科大学附属第九人民医院， 上海 200011)
关键词：变形链球菌；耐氟菌株；脱矿；氟化物
牙体牙髓牙周病学杂志000105 摘 要：目的：探讨变形链球菌耐氟突变后，其致釉质片脱矿能力的改变。方法：采用原子吸收分光光度计，测定不同氟浓度条件下变形链球菌耐氟菌株培养物上清液中钙离子浓度，并与亲代菌株进行比较。结果：耐氟菌株脱矿量在无氟化物存在时，小于亲代菌株；而当0.5mmol/L氟离子存在情况下，其脱矿量大于亲代菌株。差异具显著性。结论：耐氟菌株的产生将增加变形链球菌的致龋力。
分类号：R780.2 文献标识码：A
文章编号：1005-2593(2000)01-0013-03
, http://www.100md.com
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000，10(1)：13]
A study on demineralization of enamel by fluoride-resistant
strains of streptococcus mutans in vitro
SHENG Jiang-yun, LIU Zheng
(The Ninth Affiliated Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011)
Abstract：AIM：To find out the enamel demineralization of S. mutans after fluoride-resistant mutation in vitro. METHODS：The calcium and phosphorus in the supernate of F-resistant and F-sensitive S.mutans media were measured by atomic absorbance spectrophotometer in the presence of 0, 0.05,or 0.5mmol/L NaF。 RESULTS： The fluoride-resistant strains demineralized enamel less than did their parent, wild-type strains when on fluoride existed; whereas the result was opposite in the presence of 0.5mmol/L F. CONCLUSION：The emergence of fluorid-resistant strains will enhance the cariogenicity of S. mutans
, 百拇医药
Key words：streptococcus mutans; fluoride-resistant strain; demineralization; fluoride
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(1):13]▲
变形链球菌(以下简称变链菌)为人类龋齿主要致病菌，其高致龋力与自身具有很强的产酸力和脱矿力有关。局部高浓度氟化物的广泛应用可导致变链菌耐氟菌株的产生。国外学者已在体内及体外获得变链菌耐氟菌株，并对其致龋毒力进行研究[1，2]。为探讨国人变链菌耐氟菌株脱矿能力的改变，本实验在体外通过测定变链菌耐氟菌株及亲代菌株致釉质脱矿量，以推测其致龋能力的改变。
1 材料和方法
1.1 细菌和培养基
, http://www.100md.com
变链菌亲代野生菌株为国际参考株S.mutans Ingbritt和本实验室临床分离株SSMU-M1；耐氟菌株为上述亲代菌株体外经逐步诱导法获得[3]，分别命名为Ingbritt-FR和M1-FR。
培养基为含40g/L葡萄糖的乳酪消化大豆胨肉汤TSB。
1.2 菌悬液及培养基配制
按常规将4种待测菌株活化后，于TSB培养基中37℃微需氧培养18h。离心收集细菌。生理盐水调吸光度ABS为1.0，备用。
在含40g/L葡萄糖TSB培养基中加入20g/L NaF液使终度分别为0、0.05和0.5mmol/L，用以细菌脱矿实验。
1.3 釉质片的制作
选择临床上因正畸需要而拔除的上颌前磨牙，体视显微镜下观察无龋，无裂痕，无斑釉症及四环素牙等疾患。彻底洗刷干净，切去牙根，取冠部釉质冷水冲洗下磨制成4mm×4mm×1mm大小釉质片，超声清洗5min，750ml/L乙醇消毒72h，备用。
, 百拇医药
1.4 细菌脱矿实验
将消毒好的釉质片用无菌生理盐水冲洗3次后，置于含有不同氟浓度的TSB培养基中，每个试管置4片，再按菌液：培养基为1：10(v/v)比例接种细菌，37℃微需氧培养72h(950ml/L N2，50ml/L CO2)。以不接种细菌但含有釉质片的TSB培养基作阴性对照。
1.5 培养基中钙、磷浓度测定
将含有釉质片的72h细菌培养物，经3?000r/min离心15min，取2ml上清液，用2g/L LaCl3溶液稀释后，在原子吸收分光光度计(VIDEO22型，美国实验仪器公司)上，以灯电流5mA，波长422.7nm，狭缝宽度1.0nm以下，用火焰原子吸收法进行检测。
2 结果
, 百拇医药
各菌株在不同氟离子浓度下对釉质片的脱矿情况(表1)。
表1 变链菌及耐氟菌株在不同氟浓度下的脱矿量 (n=4) 菌株
F- mmol/L
Ca2+mg/L
P3+mg/L
Ingbritt
0
158.69±17.39
2.33±0.59
0.05
, 百拇医药
44.10±14.79
0.93±0.21
0.5
8.91±0.82
0.74±0.04
SSMU-M1
0
161.91±19.41
1.43±0.08
0.05
48.50±20.40
1.16±0.11
, 百拇医药
0.5
9.80±0.80
0.99±0.05
Ingbritt-FR△
0
80.02±51.07*
0.89±0.11*
0.05
42.73±1.13
0.88±0.07
0.5
, 百拇医药
15.53±3.20*
0.90±0.01*
M1-FR△
0
75.65±37.19*
1.02±0.08**
0.05
62.69±36.64
1.19±0.07
0.5
14.76±1.67*
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1.54±0.36*
△表示耐氟菌株； 与亲代菌株相比， *P<0.05，**P<0.01，有显著性差异
经Student t检验：F=0mmol/L时，亲代菌株Ingbritt和SSMU-M1致釉质脱出的钙、磷离子量多于耐氟菌株Ingbritt-FR 和M1-FR(P<0.05)；F=0.05mmol/L(相当于2mg/L)时，二者脱矿量相近；F=0.5mmol/L时，耐氟菌株脱矿量大于亲代菌株(P<0.05)。临床分离株与国际参考株表现相同(表1)。
3 讨论
釉质内含有大量无机物，按重量计算占95%，其中绝大部分为含有磷酸钙的羟基磷灰石晶体。所以，釉质中含有最多的无机组份是钙，其次为磷，钙与磷呈平行分布，且釉质内Ca/P比值保持恒定，一般为1.60±0.08。龋齿是由于菌斑细菌酵解碳水化合物产生酸，酸积累达到一定数量和时间，牙齿中的矿物质发生溶解，钙和磷等无机离子由牙齿中脱出，发生脱矿而开始。
, 百拇医药
本实验发现，变链菌亲代菌株和耐氟菌株产生的乳酸量皆可导致釉质片脱矿。在无氟条件下，脱矿量很大，最大钙离子浓度为161.91mg/L(SSMU-M1)。氟的加入，可减少钙和磷的溶出量，至0.5mmol/L氟离子浓度时，脱矿量有大幅度下降，但仍有部分钙磷溶出，且钙与磷的溶出量基本呈平行关系。本实验室所做的产酸实验发现，变链菌亲代株及耐氟株皆可使培养基终末pH值降至4.0左右，且在0.5mmol/L氟离子浓度下，仍可使pH值降至5.0以下。虽然细菌产酸使环境pH值降低的数值在有无釉质存在下是不同的[3]，但该结果仍可说明耐氟菌株产酸量与脱矿量相吻合，即有无氟化物存在，耐氟菌皆可导致釉质片的脱矿。表明耐氟菌株具有致龋潜力。这与van Loveren等学者的研究结果相吻合[4]。
从表1还可看出，无氟条件下，亲代菌株Ingbritt和SSMU-M1的脱矿量大于相应耐氟菌株Ingbritt-FR和M1-FR，这与pH7.0时两种菌株产酸能力相符。实验中还发现：在低浓度氟离子0.05mmol/L存在时，亲代菌株与耐氟菌株钙磷溶出量无显著性差异。当釉质存在时，氟化物有两方面作用：一是降低细菌产酸量，二是减慢釉质溶解速度。这两个作用对环境pH值可产生相反影响。产酸的抑制可升高终末pH值，而降低牙釉质的溶解速度，因为减少了由于釉质溶解而产生的缓冲作用，最终导致pH值的下降。研究发现，在0.5mmol/L 氟离子浓度时，氟化物抑制变链菌C180-2的产酸作用要占总作用的75%，而0.05mmol/L氟离子浓度时，氟对细菌产酸和釉质脱矿的两个作用达到平衡，终末pH值无变化[5]。本实验结果显示，0.05mmol/L氟离子浓度时，细菌脱矿受到抑制，但耐氟菌株与亲代菌株钙、磷离子释出量无明显差异；而0.5mmol/L氟离子浓度时，细菌产酸脱矿过程受到明显抑制，上清液中钙、磷离子浓度明显下降。但耐氟菌株受抑制程度较轻，其脱矿量明显大于亲代菌株脱矿量。说明氟化物的存在，特别是0.5mmol/L左右氟化物的存在，不能很好抑制耐氟菌株的生长和代谢。
, 百拇医药
牙菌斑有吸收氟和蓄积氟的能力，正常情况下菌斑氟离子浓度为0.5mmol/L左右[5]。该结果提示，在正常菌斑氟离子浓度条件下，耐氟菌株的致龋潜力将大于亲代变链菌株。说明氟化物的应用存在一定局限性。在临床防龋过程中，应寻找其它药物与之联合使用，以达到同样甚至更好的防龋效果，而又可防止耐氟现象的发生。■
*国家自然科学基金资助课题 (39870780)
参考文献：
[1]Brown IR, White JO, Horton IM, et al. Effect of continuous fluoride gel use on plaque flouride retention and microbial activity. J Dent Res, 1983,62(6):746
[2]Hoelcher GL, Hudson MC. Characterization of an unusual fluoride-resistant Streptococcus mutans isolate. Curr Microbiol, 1996,32:156
, 百拇医药
[3]Van Loveren C, Spitz LM, Buijs JF, et al. In vitro demineralization of enamel by F-sensitive and F-resistant Mutans Streptococci in the presence of 0, 0.05, or 0.5mmol/L NaF. J Dent Res, 1991,70(12):1491
[4]van Loveren C, Fielmich AM, Ten Brink B. Comparison of the effects of fluoride and the ionophore nigericin on acid production by Streptococcus mutans and the resultant in vitro enamel demineralization. J Dent Res, 1987,66:1658
[5]Marquis RE. Antiomicrobial actins of fluoide for oral bacteria. Can J Microbiol, 1995,41:995
收稿日期：1999-07-07, 百拇医药