反义胶原纤维酸性蛋白逆转录病毒对胶质瘢痕增生的影响
作者：黄其林 蔡文琴 张可成
单位：黄其林 张可成(重庆，第三军医大学附属新桥医院神经外科 400037)；蔡文琴(第三军医大学组胚教研室)
关键词：脑损伤，实验性；瘢痕、胶质；胶原纤维酸性蛋白；逆转录病毒科感染
中华创伤杂志000214摘 要：目的 研究抑制胶原纤维酸性蛋白(GFAP)基因表达对在体胶质瘢痕形成的影响。方法 构建反义GFAP逆转录病毒表达载体，经过病毒包装后，将获得的病毒上清液浓缩并通过微量注射的方法，引入大鼠脑穿刺损伤灶内，采用免疫组化及形态学观察的方法，研究重组反义GFAP逆转录病毒对脑损伤后胶质瘢痕形成的影响。 结果 重组反义GFAP逆转录病毒使脑穿刺损伤灶周围GFAP阳性细胞数量明显减少，反应性胶质化的典型特征消失，胶质瘢痕形成明显减少。 结论 重组反义GFAP逆转录病毒能在一定程度上减少胶质瘢痕形成，为利用基因工程技术延缓或抑制胶质瘢痕形成提供了新的实验依据。
, 百拇医药
Effect of antisense glial fibrillary acidic protein retrovirus on glial cicatrix proliferation
HUANG Qilin, CAI Wenqin, ZHANG Kecheng.
(Dept. of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University，Chongqing 400037, China)
Abstract：Objective To investigate effect of suppression glial fibrillary acidic protein(GFAP) gene expression on glial cicatrix proliferation in vivo. Methods A recombinant antisense GFAP retrovirus was developed. After packing and concentrating, the suspension of this retrovirus was injected into the sites of injured brain stab by a microinjector. The effect of recombinant antisense GFAP retrovirus on formation of glial cicatrix in the injured sites was studied through immunohischemistry and morphological observation. Results The recombinant retrovirus resulted in the number reduction of GFAP positive cells around the injured sites. The typical characteristics of reactive gliosis disappeared. The formation of the glial cicatrix was inhibited. Conclusions The recombinant antisense GFAP retrovirus can effectively inhibit the growth of glial cicatrix formation in vivo. This result provides a new way for delaying or suppressing glial cicatrix formation by the technique of gene engineering.
, 百拇医药
Key words：Brain injuries, experimental； Cicatrix, glial; Glial fibrillary acidic protein； Retroviridae infections▲
胶质瘢痕增生是阻碍神经再生与功能重建的重要原因之一。如何抑制胶质瘢痕增生，促进神经再生与功能重建，一直是神经科学研究的重点，至今未获突破性进展。研究发现，在胶质瘢痕形成过程中星形胶质细胞(astrocyte,Ast)起着重要的作用，是组成胶质瘢痕的主要胶质细胞成分[1，2]。抑制Ast生长可望抑制或延缓胶质瘢痕增生。胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是一种由Ast表达的中间丝细胞骨架蛋白,在维持Ast形态结构的稳定、参与Ast突起形成与生长等方面具有重要作用[3]。笔者利用重组反义 GFAP逆转录病毒，通过抑制GFAP基因表达及Ast生长，研究其对脑穿刺损伤后胶质瘢痕形成的影响,探讨利用基因工程技术抑制胶质瘢痕增生，促进神经再生及功能恢复的可能性与实际意义。
, http://www.100md.com
材料与方法
1. 反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建与鉴定：质粒BskG(含 GFAP基因第一外显子起始密码区1.1 kb DNA片断,由美国纽约大学医学中心Nicholas J. Cowen教授惠赠)用EcoRI和XhoI双酶切，获得的目的片断反向插入逆转录病毒载体 PLXSN上，重组子命名为PLBskG,酶切鉴定及序列分析。
2. 病毒包装与滴度测定：Lipofectin介导PLBskG转染PA317细胞, G418筛选抗性克隆2周后，随机挑选各4个克隆扩增培养，收集病毒上清，按常规方法进行病毒滴度测定。挑选滴度高的克隆细胞继续扩增培养，收集病毒上清，交叉感染ψ2及PA317细胞，重复两次，再次测定病毒滴度。
3. Southern 杂交鉴定 PLBskG在包装细胞中的整合：提取病毒感染的PA317细胞基因组 DNA，酶切后，凝胶电泳分离，转NC膜，32P-GFAP cDNA探针进行Southern 杂交。
, 百拇医药
4. RT-PCR检测目的基因在NIH3T3细胞中的表达：采用TriPure Reagent 试剂盒 (宝灵曼公司，德国)提取PLBskG 感染的NIH3T3细胞总RNA，经M-MLV逆转录酶反转录成cDNA后，PCR扩增，凝胶电泳分析。GFAP引物上游序列为5'-CTGAATTCTGCTGGCTTCAAGG-3',下游序列5'-CTAAGCT TGCTCTGCGTTGCGG-3'，扩增片断长 624 bp。β-actin引物上游序列为5'-GCGGGAAATCGTGCTGACATT-3', 下游序列为 5'-GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3'，扩增片断长314 bp。扩增条件：94℃，4 min, 接94℃，30 s，60℃，1 min，72℃，1 min,循环30次后，接72℃，7 min。
5. 脑穿刺损伤模型制作：Wistar大鼠，雌雄不限，随机分成脑穿刺损伤组、PLBskG感染组、PLXSN感染组，每组5只。大鼠用质量浓度为10 g/L的戊巴比妥钠腹腔注射(30 mg/kg)麻醉后，固定于立体定位架上，右顶部开颅，骨孔直径2 mm。自制刀片固定于微推进器上，经顶叶皮层插入脑组织中(深5 mm)，留针2 min后退出刀片，缝合头皮，制成脑损伤模型。PLBskG和PLXSN感染组在穿刺损伤后立即将浓缩病毒上清50～100 μl用微量注射器缓慢注入伤道，留针5 min后退出。
, 百拇医药
6. 免疫组化染色：分别于伤后1周、2周、1个月、2个月取材。麻醉动物后，用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛配成含质量浓度为300 g/L的饱和苦味酸的灌注液常规灌注固定，取全脑组织，4℃后固定4 h，用质量浓度为200 g/L的蔗糖浸泡24 h后，经伤道冰冻切片。按照本室常规方法进行免疫组化染色。
7. HE染色：常规取标固定，石蜡包埋，经伤道切片，HE染色，光镜检查。
结 果
1. 反义GFAP重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定：重组子PLBskG经酶切鉴定，1.1 kb的插入片断成功分离；序列分析表明，插入片断的序列与插入方向完全正确(图1)。
图1 重组反义GFAP逆转录病毒PLBskG酶切图谱。 a:λDNA/EorRI+Hind Ⅲ marker； b: 回收的GFAP片断； c: 重组PLBskG质粒； d: PLBskG质粒EcoRI酶切； e: PLBskG质粒XhoI+EcoRI双酶切
, http://www.100md.com
2. 病毒滴度测定：收集的第1代病毒上清液滴度：PLBskG为5.2×104 cfu/ml, PLXSN为5.6×104 cfu/ml,交叉感染ψ2及PA317细胞后，PLBskG滴度上升为4.8×105 cfu/ml, PLXSN滴度上升为3.7×105 cfu/ml。
3. Southern 杂交：获得1.1 kb阳性杂交带，表明PLBskG在包装细胞中成功整合(图2)。
图2 Southern blot鉴定PLBskG在PA317细胞中的整合。a: PA317/PLBskG克隆细胞1个月； b: PA317/PLBskG克隆细胞2个月
4. RT-PCR 获得一624 bp的阳性扩增带，表明PLBskG在NIH3T3细胞中成功表达(图3)。
, http://www.100md.com
图3 RT-PCR鉴定PLBskG在NIH/3T3细胞中的表达。a: xФ174 /Hae Marker； b: NIH/3T3/PLBskG 克隆细胞； c: PLBskG质粒
5. 免疫组化染色：PLBskG感染组伤后，伤灶周围组织Ast反应性胶质化呈明显抑制状态，伤灶周围GFAP阳性细胞数量明显减少，呈散在分布，与远离伤道的GFAP阳性细胞比较，其胞体缩小，突起减少、变细。而PLXSN对伤灶周围GFAP阳性细胞的数量、形态无显著影响。
6. HE染色发现，伤后1个月，PLBskG感染组胶质瘢痕形成较PLXSN组明显减少。
讨 论
中枢神经系统(CNS)损伤修复的形态学表现为胶质瘢痕形成。一方面，胶质瘢痕填充了损伤局部的组织缺损，恢复了组织结构的连续性；另一方面，从神经再生的角度看，正是胶质瘢痕增生形成的致密屏障，阻碍了神经再生和功能重建，成为影响神经再生与功能重建的重要原因之一[4]。研究发现，新生大鼠在CNS损伤后表现出良好的神经再生和功能重建的能力,而成年大鼠却很难实现神经再生与功能重建。究其原因，认为前者在损伤后不形成或很少形成胶质瘢痕,从而有许多再生的轴突通过损伤区,重建神经功能；而成年动物胶质瘢痕的形成却很明显。这些结果提示，胶质瘢痕与神经再生、功能重建具有密切的关系。在胶质瘢痕形成过程中，Ast是一个重要的成分。笔者曾对大胶质细胞在胶质瘢痕形成中的作用进行研究，结果证实Ast是组成胶质瘢痕的主要胶质细胞成分[5]。那么，抑制Ast的生长是否会影响胶质瘢痕的形成？这是笔者在本实验中希望阐明的核心问题。
, http://www.100md.com
Ast对CNS损伤表现出迅速而活跃的反应，其特征为反应性胶质化，即损伤局部的Ast胞体肥大，突起增多、延长，GFAP表达上调。大量 GFAP的堆积不仅是造成反应性Ast胞体肥大，突起增粗、延长的主要原因，而且是Ast参与胶质瘢痕形成的重要物质基础[6]。因此，抑制 GFAP基因表达，将有可能抑制Ast的生长及其对损伤的反应。反义核酸技术的应用为解决这一难题带来了希望。笔者利用反义核酸技术，针对GFAP基因结构特点，将含GFAP基因第1外显子起始密码区的一段长约1.1 kb的cDNA片断反向插入逆转录病毒载体中，通过病毒DNA整合到Ast细胞基因组中，合成反义RNA, 特异性封闭GFAP基因表达。在离体实验中，笔者将这种重组逆转录病毒转染培养正常及损伤的Ast，证实其对Ast的生长和GFAP基因的表达，以及Ast对损伤的反应等均有明显的抑制作用[7]，为进行体内实验奠定了良好的基础。
逆转录病毒在应用中的一个重要缺陷就是其感染效率较低[8]。如何解决病毒效价低的问题是一个棘手的问题。为了提高病毒效价，有人甚至将病毒包装细胞直接注射到靶区，期望通过在靶区存活的包装细胞不断分泌病毒颗粒而起作用。然而，包装细胞在注射部位受营养、内环境、吞噬细胞等的影响，其分泌病毒的能力会受到限制，在CNS内，注射大量的包装细胞还有造成局部占位的危险。因此，这种方法是否可取尚待深入研究。本研究中通过病毒上清交叉感染不同包装细胞以提高病毒滴度，同时，将收获病毒时的温度降至 32℃，收获时间缩短至20 h，使病毒滴度显著提高后，直接将病毒悬液微量注射到损伤灶局部。如何在损伤部位尽可能多地注射病毒上清液，最大限度地增加病毒转染效率，同时又不引起占位效应，也是一个十分重要的问题。笔者在经过多次实验后发现，在穿刺部位注射50～100 μl病毒上清，动物未因为局部占位引起死亡，病毒介导的基因转移效果满意。笔者认为，注射病毒上清引起的占位效应是一过性的反应，随着上清液中水分的逐渐吸收，占位作用也随之消失。此外，CNS虽非免疫特异器官，但受免疫系统监视的程度远低于外周，对病毒的抵抗能力也很有限。因此，在CNS中采用直接注射病毒上清的方法是可行的，效果也应优于外周。本实验结果也说明了此点。
, 百拇医药
结果表明，PLBskG感染组其损伤灶局部 GFAP阳性细胞数量明显减少，与单纯损伤组及空载体对照组比较，Ast的反应性胶质化程度明显减轻，胞体缩小，突起减少、回缩；HE染色发现损伤局部胶质瘢痕的形成也明显减少，效果令人鼓舞。由于反应性胶质化的抑制，以及胶质瘢痕形成的减少，为神经再生与功能重建创造了良好的条件，对促进CNS再生具有积极意义。
志谢 感谢军事医学科学院贺福初研究员、杨小明副研究员在质粒重组上给予的大力支持与帮助
参考文献：
[1]Frisen J,Egerotrand AH, Risling M.Spinal axons in central nervous system scar tissue are closely related to laminin-immunoreactive astrocytes.Neurosci, 1995, 65:293-304.
, http://www.100md.com
[2]Eng LF, Chirnikar RS. GFAP and astrogliosis. Brain Pathol， 1994, 4:229-237.
[3]Liedtke W, Edelmann W, Bieri PL, et al. GFAP in necessary forth the integrity of CNS white matter architecture and long-term maintenance of myelination. Neuron， 1996, 17:607-615.
[4]Anders JJ, Hurlock JA. Transplanted glial scar impedes olfactory bulb reinnervation. Exp Neuro, 1996, 142:144-150.
[5]黄其林, 蔡文琴，张可成. 重组反义GFAP逆转录病毒对星形胶质细胞在胶质瘢痕增生中作用的研究. 生理科学进展，1999，30:133-136.
, 百拇医药
[6]Eddleston M, Muche L. Molecular profile of reactive astrocytes-implications for their role in neurologic disease. Neurosci, 1993, 54:15-36.
[7]黄其林,蔡文琴，张可成. 抑制GFAP基因表达对星形胶质细胞形态及胶质瘢痕形成影响的体内、外实验研究. 科学通报, 1999，44:1851-1856.
[8]Vile RG, Russell SJ. Retroviruses as vectors. Bri Med Bull, 1995, 51:12-30.
收稿：1998-11-30, 百拇医药
单位：黄其林 张可成(重庆，第三军医大学附属新桥医院神经外科 400037)；蔡文琴(第三军医大学组胚教研室)
关键词：脑损伤，实验性；瘢痕、胶质；胶原纤维酸性蛋白；逆转录病毒科感染
中华创伤杂志000214摘 要：目的 研究抑制胶原纤维酸性蛋白(GFAP)基因表达对在体胶质瘢痕形成的影响。方法 构建反义GFAP逆转录病毒表达载体，经过病毒包装后，将获得的病毒上清液浓缩并通过微量注射的方法，引入大鼠脑穿刺损伤灶内，采用免疫组化及形态学观察的方法，研究重组反义GFAP逆转录病毒对脑损伤后胶质瘢痕形成的影响。 结果 重组反义GFAP逆转录病毒使脑穿刺损伤灶周围GFAP阳性细胞数量明显减少，反应性胶质化的典型特征消失，胶质瘢痕形成明显减少。 结论 重组反义GFAP逆转录病毒能在一定程度上减少胶质瘢痕形成，为利用基因工程技术延缓或抑制胶质瘢痕形成提供了新的实验依据。
, 百拇医药
Effect of antisense glial fibrillary acidic protein retrovirus on glial cicatrix proliferation
HUANG Qilin, CAI Wenqin, ZHANG Kecheng.
(Dept. of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University，Chongqing 400037, China)
Abstract：Objective To investigate effect of suppression glial fibrillary acidic protein(GFAP) gene expression on glial cicatrix proliferation in vivo. Methods A recombinant antisense GFAP retrovirus was developed. After packing and concentrating, the suspension of this retrovirus was injected into the sites of injured brain stab by a microinjector. The effect of recombinant antisense GFAP retrovirus on formation of glial cicatrix in the injured sites was studied through immunohischemistry and morphological observation. Results The recombinant retrovirus resulted in the number reduction of GFAP positive cells around the injured sites. The typical characteristics of reactive gliosis disappeared. The formation of the glial cicatrix was inhibited. Conclusions The recombinant antisense GFAP retrovirus can effectively inhibit the growth of glial cicatrix formation in vivo. This result provides a new way for delaying or suppressing glial cicatrix formation by the technique of gene engineering.
, 百拇医药
Key words：Brain injuries, experimental； Cicatrix, glial; Glial fibrillary acidic protein； Retroviridae infections▲
胶质瘢痕增生是阻碍神经再生与功能重建的重要原因之一。如何抑制胶质瘢痕增生，促进神经再生与功能重建，一直是神经科学研究的重点，至今未获突破性进展。研究发现，在胶质瘢痕形成过程中星形胶质细胞(astrocyte,Ast)起着重要的作用，是组成胶质瘢痕的主要胶质细胞成分[1，2]。抑制Ast生长可望抑制或延缓胶质瘢痕增生。胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是一种由Ast表达的中间丝细胞骨架蛋白,在维持Ast形态结构的稳定、参与Ast突起形成与生长等方面具有重要作用[3]。笔者利用重组反义 GFAP逆转录病毒，通过抑制GFAP基因表达及Ast生长，研究其对脑穿刺损伤后胶质瘢痕形成的影响,探讨利用基因工程技术抑制胶质瘢痕增生，促进神经再生及功能恢复的可能性与实际意义。
, http://www.100md.com
材料与方法
1. 反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建与鉴定：质粒BskG(含 GFAP基因第一外显子起始密码区1.1 kb DNA片断,由美国纽约大学医学中心Nicholas J. Cowen教授惠赠)用EcoRI和XhoI双酶切，获得的目的片断反向插入逆转录病毒载体 PLXSN上，重组子命名为PLBskG,酶切鉴定及序列分析。
2. 病毒包装与滴度测定：Lipofectin介导PLBskG转染PA317细胞, G418筛选抗性克隆2周后，随机挑选各4个克隆扩增培养，收集病毒上清，按常规方法进行病毒滴度测定。挑选滴度高的克隆细胞继续扩增培养，收集病毒上清，交叉感染ψ2及PA317细胞，重复两次，再次测定病毒滴度。
3. Southern 杂交鉴定 PLBskG在包装细胞中的整合：提取病毒感染的PA317细胞基因组 DNA，酶切后，凝胶电泳分离，转NC膜，32P-GFAP cDNA探针进行Southern 杂交。
, 百拇医药
4. RT-PCR检测目的基因在NIH3T3细胞中的表达：采用TriPure Reagent 试剂盒 (宝灵曼公司，德国)提取PLBskG 感染的NIH3T3细胞总RNA，经M-MLV逆转录酶反转录成cDNA后，PCR扩增，凝胶电泳分析。GFAP引物上游序列为5'-CTGAATTCTGCTGGCTTCAAGG-3',下游序列5'-CTAAGCT TGCTCTGCGTTGCGG-3'，扩增片断长 624 bp。β-actin引物上游序列为5'-GCGGGAAATCGTGCTGACATT-3', 下游序列为 5'-GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3'，扩增片断长314 bp。扩增条件：94℃，4 min, 接94℃，30 s，60℃，1 min，72℃，1 min,循环30次后，接72℃，7 min。
5. 脑穿刺损伤模型制作：Wistar大鼠，雌雄不限，随机分成脑穿刺损伤组、PLBskG感染组、PLXSN感染组，每组5只。大鼠用质量浓度为10 g/L的戊巴比妥钠腹腔注射(30 mg/kg)麻醉后，固定于立体定位架上，右顶部开颅，骨孔直径2 mm。自制刀片固定于微推进器上，经顶叶皮层插入脑组织中(深5 mm)，留针2 min后退出刀片，缝合头皮，制成脑损伤模型。PLBskG和PLXSN感染组在穿刺损伤后立即将浓缩病毒上清50～100 μl用微量注射器缓慢注入伤道，留针5 min后退出。
, 百拇医药
6. 免疫组化染色：分别于伤后1周、2周、1个月、2个月取材。麻醉动物后，用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛配成含质量浓度为300 g/L的饱和苦味酸的灌注液常规灌注固定，取全脑组织，4℃后固定4 h，用质量浓度为200 g/L的蔗糖浸泡24 h后，经伤道冰冻切片。按照本室常规方法进行免疫组化染色。
7. HE染色：常规取标固定，石蜡包埋，经伤道切片，HE染色，光镜检查。
结 果
1. 反义GFAP重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定：重组子PLBskG经酶切鉴定，1.1 kb的插入片断成功分离；序列分析表明，插入片断的序列与插入方向完全正确(图1)。
图1 重组反义GFAP逆转录病毒PLBskG酶切图谱。 a:λDNA/EorRI+Hind Ⅲ marker； b: 回收的GFAP片断； c: 重组PLBskG质粒； d: PLBskG质粒EcoRI酶切； e: PLBskG质粒XhoI+EcoRI双酶切
, http://www.100md.com
2. 病毒滴度测定：收集的第1代病毒上清液滴度：PLBskG为5.2×104 cfu/ml, PLXSN为5.6×104 cfu/ml,交叉感染ψ2及PA317细胞后，PLBskG滴度上升为4.8×105 cfu/ml, PLXSN滴度上升为3.7×105 cfu/ml。
3. Southern 杂交：获得1.1 kb阳性杂交带，表明PLBskG在包装细胞中成功整合(图2)。
图2 Southern blot鉴定PLBskG在PA317细胞中的整合。a: PA317/PLBskG克隆细胞1个月； b: PA317/PLBskG克隆细胞2个月
4. RT-PCR 获得一624 bp的阳性扩增带，表明PLBskG在NIH3T3细胞中成功表达(图3)。
, http://www.100md.com
图3 RT-PCR鉴定PLBskG在NIH/3T3细胞中的表达。a: xФ174 /Hae Marker； b: NIH/3T3/PLBskG 克隆细胞； c: PLBskG质粒
5. 免疫组化染色：PLBskG感染组伤后，伤灶周围组织Ast反应性胶质化呈明显抑制状态，伤灶周围GFAP阳性细胞数量明显减少，呈散在分布，与远离伤道的GFAP阳性细胞比较，其胞体缩小，突起减少、变细。而PLXSN对伤灶周围GFAP阳性细胞的数量、形态无显著影响。
6. HE染色发现，伤后1个月，PLBskG感染组胶质瘢痕形成较PLXSN组明显减少。
讨 论
中枢神经系统(CNS)损伤修复的形态学表现为胶质瘢痕形成。一方面，胶质瘢痕填充了损伤局部的组织缺损，恢复了组织结构的连续性；另一方面，从神经再生的角度看，正是胶质瘢痕增生形成的致密屏障，阻碍了神经再生和功能重建，成为影响神经再生与功能重建的重要原因之一[4]。研究发现，新生大鼠在CNS损伤后表现出良好的神经再生和功能重建的能力,而成年大鼠却很难实现神经再生与功能重建。究其原因，认为前者在损伤后不形成或很少形成胶质瘢痕,从而有许多再生的轴突通过损伤区,重建神经功能；而成年动物胶质瘢痕的形成却很明显。这些结果提示，胶质瘢痕与神经再生、功能重建具有密切的关系。在胶质瘢痕形成过程中，Ast是一个重要的成分。笔者曾对大胶质细胞在胶质瘢痕形成中的作用进行研究，结果证实Ast是组成胶质瘢痕的主要胶质细胞成分[5]。那么，抑制Ast的生长是否会影响胶质瘢痕的形成？这是笔者在本实验中希望阐明的核心问题。
, http://www.100md.com
Ast对CNS损伤表现出迅速而活跃的反应，其特征为反应性胶质化，即损伤局部的Ast胞体肥大，突起增多、延长，GFAP表达上调。大量 GFAP的堆积不仅是造成反应性Ast胞体肥大，突起增粗、延长的主要原因，而且是Ast参与胶质瘢痕形成的重要物质基础[6]。因此，抑制 GFAP基因表达，将有可能抑制Ast的生长及其对损伤的反应。反义核酸技术的应用为解决这一难题带来了希望。笔者利用反义核酸技术，针对GFAP基因结构特点，将含GFAP基因第1外显子起始密码区的一段长约1.1 kb的cDNA片断反向插入逆转录病毒载体中，通过病毒DNA整合到Ast细胞基因组中，合成反义RNA, 特异性封闭GFAP基因表达。在离体实验中，笔者将这种重组逆转录病毒转染培养正常及损伤的Ast，证实其对Ast的生长和GFAP基因的表达，以及Ast对损伤的反应等均有明显的抑制作用[7]，为进行体内实验奠定了良好的基础。
逆转录病毒在应用中的一个重要缺陷就是其感染效率较低[8]。如何解决病毒效价低的问题是一个棘手的问题。为了提高病毒效价，有人甚至将病毒包装细胞直接注射到靶区，期望通过在靶区存活的包装细胞不断分泌病毒颗粒而起作用。然而，包装细胞在注射部位受营养、内环境、吞噬细胞等的影响，其分泌病毒的能力会受到限制，在CNS内，注射大量的包装细胞还有造成局部占位的危险。因此，这种方法是否可取尚待深入研究。本研究中通过病毒上清交叉感染不同包装细胞以提高病毒滴度，同时，将收获病毒时的温度降至 32℃，收获时间缩短至20 h，使病毒滴度显著提高后，直接将病毒悬液微量注射到损伤灶局部。如何在损伤部位尽可能多地注射病毒上清液，最大限度地增加病毒转染效率，同时又不引起占位效应，也是一个十分重要的问题。笔者在经过多次实验后发现，在穿刺部位注射50～100 μl病毒上清，动物未因为局部占位引起死亡，病毒介导的基因转移效果满意。笔者认为，注射病毒上清引起的占位效应是一过性的反应，随着上清液中水分的逐渐吸收，占位作用也随之消失。此外，CNS虽非免疫特异器官，但受免疫系统监视的程度远低于外周，对病毒的抵抗能力也很有限。因此，在CNS中采用直接注射病毒上清的方法是可行的，效果也应优于外周。本实验结果也说明了此点。
, 百拇医药
结果表明，PLBskG感染组其损伤灶局部 GFAP阳性细胞数量明显减少，与单纯损伤组及空载体对照组比较，Ast的反应性胶质化程度明显减轻，胞体缩小，突起减少、回缩；HE染色发现损伤局部胶质瘢痕的形成也明显减少，效果令人鼓舞。由于反应性胶质化的抑制，以及胶质瘢痕形成的减少，为神经再生与功能重建创造了良好的条件，对促进CNS再生具有积极意义。
志谢 感谢军事医学科学院贺福初研究员、杨小明副研究员在质粒重组上给予的大力支持与帮助
参考文献：
[1]Frisen J,Egerotrand AH, Risling M.Spinal axons in central nervous system scar tissue are closely related to laminin-immunoreactive astrocytes.Neurosci, 1995, 65:293-304.
, http://www.100md.com
[2]Eng LF, Chirnikar RS. GFAP and astrogliosis. Brain Pathol， 1994, 4:229-237.
[3]Liedtke W, Edelmann W, Bieri PL, et al. GFAP in necessary forth the integrity of CNS white matter architecture and long-term maintenance of myelination. Neuron， 1996, 17:607-615.
[4]Anders JJ, Hurlock JA. Transplanted glial scar impedes olfactory bulb reinnervation. Exp Neuro, 1996, 142:144-150.
[5]黄其林, 蔡文琴，张可成. 重组反义GFAP逆转录病毒对星形胶质细胞在胶质瘢痕增生中作用的研究. 生理科学进展，1999，30:133-136.
, 百拇医药
[6]Eddleston M, Muche L. Molecular profile of reactive astrocytes-implications for their role in neurologic disease. Neurosci, 1993, 54:15-36.
[7]黄其林,蔡文琴，张可成. 抑制GFAP基因表达对星形胶质细胞形态及胶质瘢痕形成影响的体内、外实验研究. 科学通报, 1999，44:1851-1856.
[8]Vile RG, Russell SJ. Retroviruses as vectors. Bri Med Bull, 1995, 51:12-30.
收稿：1998-11-30, 百拇医药