白色念珠菌粘附肠上皮细胞及IgA对其作用的体外观察
作者：白晓东 肖光夏 刘贤华
单位：白晓东 肖光夏 第三军医大学附属西南医院烧伤研究所 重庆，400038；刘贤华 第三军医大学预防医学系防原医学教研室、复合伤研究所 重庆，400038
关键词：白色念珠菌；粘附；IgA
第三军医大学学报990523Study on the adhesion of candida albicans to IEC-6 and the effect of IgA on the adhesion in vitro
提 要 目的：观察特异IgA抑制白色念珠菌(白念菌)粘附的作用。方法：首先建立肠上皮细胞IEC-6在玻片表面生长模型；将特异IgA阳性肠粘液、阴性肠粘液以及抗IgA血清中和后的肠粘液分别作用白念菌，收集菌并与上述细胞共同孵育。计数粘附数，并换算出抑制率。结果：含有特异抗白念菌IgA的肠粘液抑制白念菌优于其它肠粘液。结论：特异IgA在肠粘液中起重要的抗粘附作用。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R379.4;R392.11
白色念珠菌(白念菌)是常见的条件致病菌，其肠源性感染是机会感染的主要方式[1]。本研究利用肠上皮细胞(Intestinal epithelial cell, IEC)体外培养观察不同性质的肠粘液(内含特异抗白念菌IgA或缺如)对白念菌粘附的作用，为利用IgA抗体预防其机会感染提供依据。
1 材料和方法
1.1 肠上皮细胞培养及单层玻片生长模型建立
IEC-6细胞，上海细胞所提供。常规传代后，将细胞悬液调至109/ml，取2ml入内铺有玻片的玻璃平皿内，37℃，10%CO2。培养至细胞贴壁并部分融合，取出备用。
1.2 白色念珠菌
, 百拇医药
cmcc 44102，标株，本所提供。在沙氏平板上3次转种后，洗菌并配成菌悬液，浓度见后。
1.3 白念菌粘附肠上皮细胞观察
白念菌浓度为8×109、8×108、8×107、8×106cfu/ml，各取1ml菌悬液离心收集菌，1ml细胞培养液重新悬浮后，加入上述已长满细胞的玻片平皿中，总体积5ml。37℃，2h，取出玻片。用PBS液冲洗玻片10次，洗去未粘附白念菌，干燥固定后，甲胺蓝染色，封片。计数方法：计数1000个细胞中被白念菌粘附的阳性细胞数。共计数5次，计算平均数。
1.4 不同浓度肠粘液阻止粘附观察
正常SPF小鼠(本校动物中心提供)，活杀取肠粘液，用PBS混匀，5000r/min，5min取上清，浓度调至2mg/ml，经ELISA检测，粘液未含特异抗白念菌IgA型抗体。另外10只SPF小鼠，经口喂1.5×109 cfu/ml×0.5ml白念菌，14d后活杀取肠粘液，处理同前，浓度调至2mg/ml，经ELISA检测，其内含特异抗白念菌IgA型抗体。粘液提取物样本过滤除菌后，同做1∶10、1∶100、1∶1000稀释。取1ml不同稀释度样品与4.8×108白念菌在37℃下孵育半小时，离心收集菌。同“1.3”相同方式粘附肠上皮细胞，计数粘附数。以单纯白念菌粘附为阳性对照。
, 百拇医药
取上述特异抗白念菌IgA抗体阳性(N+C)及阴性(N)粘液提取物，调蛋白浓度为4mg/ml，过滤除菌。各分为二份：A：0.5ml(特异抗白念菌IgA阳性)粘液提取物。B：0.5ml特异抗白念菌IgA阳性粘液中加入终末为1∶20的羊抗鼠IgA抗血清(Sigma公司)；C：0.5ml阴性粘液；D：0.5ml阴性粘液中加入终末为1∶20的羊抗鼠IgA抗血清(Sigma)。分别与1.18×109白念菌孵育半小时，37℃离心收集菌后，同前方式粘附肠上皮细胞。计数粘附数。以单纯白念菌粘附做为阳性对照。
1.6 统计学方法
SPLM软件处理，P<0.05为相差显著。
2 结果
2.1 光镜观察
粘附以菌体粘附为主。光镜观察示白念菌粘附后可侵入胞内，形成侵袭性感染，周围有溶解性空斑。
, 百拇医药
2.2 不同浓度白念菌粘附结果
8×109、8×108、8×107、8×106 4个浓度下粘附数分别为662±25、405±24、70±12、29±12。随着浓度下降，粘附数明显下降。
2.3 不同浓度肠粘液提取物阻止粘附结果
含有特异IgA的肠粘液抑制白念菌粘附效果优于不含特异IgA的肠粘液，见表1。
表 1 不同肠粘液阻止白念菌粘附结果
N+C
N
对照组
, 百拇医药
1∶10
1∶100
1∶1000
1∶10
1∶100
1∶1000
粘附数
57.80±17.27
68.60±12.75
97.00±19.11
88.00±26.54
66.40±18.78
, 百拇医药
92.40±34.39
312
粘附抑制率(%)
81
78
69
72
78
70
-
N+C：SPF小鼠定植白念菌14d肠粘液；N：SPF小鼠肠粘液
2.4 不同性质肠粘液提取物阻止粘附结果
, http://www.100md.com
中和肠粘液中的IgA后，肠粘液抑制白念菌粘附的作用降低，见表2。
表 2 中和IgA后的肠粘液作用
N+C
N
对照组
A
B
C
D
粘附数
381.4±146.08
167.60±57.75△※
, http://www.100md.com
289.4±45.77
485.00±17.56
437
抑制率(%)
13
62
34
-
-
△：P<0.05与A比较；※：P<0.05与C、D比较
3 讨论
白念菌粘附肠上皮细胞的数量与上皮细胞环境中的菌量密切相关[2]，由此推论，一旦肠腔内发生菌群失调、白念菌大量增殖，必然导致粘附数量上升。肠腔表面IgA抗体能起局部抑制粘附作用，并且具有一定的特异性[3]。本实验证实：含有特异抗白念菌IgA抗体的粘液上清抑制能力高于普通粘液(未含特异IgA)上清，并且随着粘液上清稀释，普通粘液上清抑制能力无变化，而含有特异IgA的上清抑制能力下降，由此提示，特异IgA在抑制白念菌粘附方面有可能起主要作用。为证实此点，将粘液中IgA用抗血清中和，观察抗粘附能力变化，结果发现：IgA抗体的粘液上清，中和IgA后，其抑制率由62%降至13%。可见：①抗白念菌IgA抗体存在与否及稀释情况与粘液抑制白念菌粘附肠上皮能力有关，特异IgA抗体可能起关键作用；②未含特异抗白念菌IgA抗体的粘液具有抑制白念菌粘附能力，主要与非特异抗粘附因素如粘蛋白等有关；③粘附发生率与环境中白念菌数量相关。
, 百拇医药
全军“九五”战创伤感染与免疫课题资助，No.96L042
作者简介：白晓东，男，30岁，主治医师，博士研究生
参考文献
1 郭力，张雅萍，肖光夏.烫伤及应用抗生素与肠道白念菌移位的实验研究.中华创伤杂志，1991，7(3)：198
2 郭宁如，吕桂霞，吴绍熙.念珠菌体外粘附上皮细胞的观察.中国医学科学院学报，1994，16(4)：312
3 Bos N A,Bun J C,Popma S H,et al.Monoclonal immunoglobulin A derived from peritional B cells is encoded by both germ line and somatically mutated V H genes,and is reactive with commensal bacteria.Infect Immun,1996,64(2):616
(收稿：1998-07-07；修回：1999-03-18), http://www.100md.com
单位：白晓东 肖光夏 第三军医大学附属西南医院烧伤研究所 重庆，400038；刘贤华 第三军医大学预防医学系防原医学教研室、复合伤研究所 重庆，400038
关键词：白色念珠菌；粘附；IgA
第三军医大学学报990523Study on the adhesion of candida albicans to IEC-6 and the effect of IgA on the adhesion in vitro
提 要 目的：观察特异IgA抑制白色念珠菌(白念菌)粘附的作用。方法：首先建立肠上皮细胞IEC-6在玻片表面生长模型；将特异IgA阳性肠粘液、阴性肠粘液以及抗IgA血清中和后的肠粘液分别作用白念菌，收集菌并与上述细胞共同孵育。计数粘附数，并换算出抑制率。结果：含有特异抗白念菌IgA的肠粘液抑制白念菌优于其它肠粘液。结论：特异IgA在肠粘液中起重要的抗粘附作用。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R379.4;R392.11
白色念珠菌(白念菌)是常见的条件致病菌，其肠源性感染是机会感染的主要方式[1]。本研究利用肠上皮细胞(Intestinal epithelial cell, IEC)体外培养观察不同性质的肠粘液(内含特异抗白念菌IgA或缺如)对白念菌粘附的作用，为利用IgA抗体预防其机会感染提供依据。
1 材料和方法
1.1 肠上皮细胞培养及单层玻片生长模型建立
IEC-6细胞，上海细胞所提供。常规传代后，将细胞悬液调至109/ml，取2ml入内铺有玻片的玻璃平皿内，37℃，10%CO2。培养至细胞贴壁并部分融合，取出备用。
1.2 白色念珠菌
, 百拇医药
cmcc 44102，标株，本所提供。在沙氏平板上3次转种后，洗菌并配成菌悬液，浓度见后。
1.3 白念菌粘附肠上皮细胞观察
白念菌浓度为8×109、8×108、8×107、8×106cfu/ml，各取1ml菌悬液离心收集菌，1ml细胞培养液重新悬浮后，加入上述已长满细胞的玻片平皿中，总体积5ml。37℃，2h，取出玻片。用PBS液冲洗玻片10次，洗去未粘附白念菌，干燥固定后，甲胺蓝染色，封片。计数方法：计数1000个细胞中被白念菌粘附的阳性细胞数。共计数5次，计算平均数。
1.4 不同浓度肠粘液阻止粘附观察
正常SPF小鼠(本校动物中心提供)，活杀取肠粘液，用PBS混匀，5000r/min，5min取上清，浓度调至2mg/ml，经ELISA检测，粘液未含特异抗白念菌IgA型抗体。另外10只SPF小鼠，经口喂1.5×109 cfu/ml×0.5ml白念菌，14d后活杀取肠粘液，处理同前，浓度调至2mg/ml，经ELISA检测，其内含特异抗白念菌IgA型抗体。粘液提取物样本过滤除菌后，同做1∶10、1∶100、1∶1000稀释。取1ml不同稀释度样品与4.8×108白念菌在37℃下孵育半小时，离心收集菌。同“1.3”相同方式粘附肠上皮细胞，计数粘附数。以单纯白念菌粘附为阳性对照。
, 百拇医药
取上述特异抗白念菌IgA抗体阳性(N+C)及阴性(N)粘液提取物，调蛋白浓度为4mg/ml，过滤除菌。各分为二份：A：0.5ml(特异抗白念菌IgA阳性)粘液提取物。B：0.5ml特异抗白念菌IgA阳性粘液中加入终末为1∶20的羊抗鼠IgA抗血清(Sigma公司)；C：0.5ml阴性粘液；D：0.5ml阴性粘液中加入终末为1∶20的羊抗鼠IgA抗血清(Sigma)。分别与1.18×109白念菌孵育半小时，37℃离心收集菌后，同前方式粘附肠上皮细胞。计数粘附数。以单纯白念菌粘附做为阳性对照。
1.6 统计学方法
SPLM软件处理，P<0.05为相差显著。
2 结果
2.1 光镜观察
粘附以菌体粘附为主。光镜观察示白念菌粘附后可侵入胞内，形成侵袭性感染，周围有溶解性空斑。
, 百拇医药
2.2 不同浓度白念菌粘附结果
8×109、8×108、8×107、8×106 4个浓度下粘附数分别为662±25、405±24、70±12、29±12。随着浓度下降，粘附数明显下降。
2.3 不同浓度肠粘液提取物阻止粘附结果
含有特异IgA的肠粘液抑制白念菌粘附效果优于不含特异IgA的肠粘液，见表1。
表 1 不同肠粘液阻止白念菌粘附结果
N+C
N
对照组
, 百拇医药
1∶10
1∶100
1∶1000
1∶10
1∶100
1∶1000
粘附数
57.80±17.27
68.60±12.75
97.00±19.11
88.00±26.54
66.40±18.78
, 百拇医药
92.40±34.39
312
粘附抑制率(%)
81
78
69
72
78
70
-
N+C：SPF小鼠定植白念菌14d肠粘液；N：SPF小鼠肠粘液
2.4 不同性质肠粘液提取物阻止粘附结果
, http://www.100md.com
中和肠粘液中的IgA后，肠粘液抑制白念菌粘附的作用降低，见表2。
表 2 中和IgA后的肠粘液作用
N+C
N
对照组
A
B
C
D
粘附数
381.4±146.08
167.60±57.75△※
, http://www.100md.com
289.4±45.77
485.00±17.56
437
抑制率(%)
13
62
34
-
-
△：P<0.05与A比较；※：P<0.05与C、D比较
3 讨论
白念菌粘附肠上皮细胞的数量与上皮细胞环境中的菌量密切相关[2]，由此推论，一旦肠腔内发生菌群失调、白念菌大量增殖，必然导致粘附数量上升。肠腔表面IgA抗体能起局部抑制粘附作用，并且具有一定的特异性[3]。本实验证实：含有特异抗白念菌IgA抗体的粘液上清抑制能力高于普通粘液(未含特异IgA)上清，并且随着粘液上清稀释，普通粘液上清抑制能力无变化，而含有特异IgA的上清抑制能力下降，由此提示，特异IgA在抑制白念菌粘附方面有可能起主要作用。为证实此点，将粘液中IgA用抗血清中和，观察抗粘附能力变化，结果发现：IgA抗体的粘液上清，中和IgA后，其抑制率由62%降至13%。可见：①抗白念菌IgA抗体存在与否及稀释情况与粘液抑制白念菌粘附肠上皮能力有关，特异IgA抗体可能起关键作用；②未含特异抗白念菌IgA抗体的粘液具有抑制白念菌粘附能力，主要与非特异抗粘附因素如粘蛋白等有关；③粘附发生率与环境中白念菌数量相关。
, 百拇医药
全军“九五”战创伤感染与免疫课题资助，No.96L042
作者简介：白晓东，男，30岁，主治医师，博士研究生
参考文献
1 郭力，张雅萍，肖光夏.烫伤及应用抗生素与肠道白念菌移位的实验研究.中华创伤杂志，1991，7(3)：198
2 郭宁如，吕桂霞，吴绍熙.念珠菌体外粘附上皮细胞的观察.中国医学科学院学报，1994，16(4)：312
3 Bos N A,Bun J C,Popma S H,et al.Monoclonal immunoglobulin A derived from peritional B cells is encoded by both germ line and somatically mutated V H genes,and is reactive with commensal bacteria.Infect Immun,1996,64(2):616
(收稿：1998-07-07；修回：1999-03-18), http://www.100md.com