丙型肝炎肝细胞凋亡的电镜和免疫组化研究*
作者：陈佩兰 陈乃玲 刘超英 李琳 陈良标
单位：北京军区总医院解放军肝病研究所，北京，100700
关键词：电子显微镜检查；免疫组化；丙型肝炎；凋亡
丙型肝炎肝细胞凋亡的电镜和免疫组化研究 摘要：目的 探讨丙型肝炎肝细胞凋亡与Fas抗原表达及病理损伤的关系。方法 应用电镜和免疫组化方法检测了23例慢性丙型肝炎患者的肝组织。结果 凋亡肝细胞呈多种形态学改变； Fas抗原中，强度表达及组织炎症活动度积分高者, 细胞凋亡指数增高。结论 肝细胞凋亡是一系列超微病理改变过程，Fas系统在介导细胞凋亡中起重要作用，细胞凋亡是慢性丙型肝炎肝组织的重要病理变化。
中图分类号：R512.603
TEM and immunochemical study of apoptotic hepatocytes in liver tissues of patients with chronic hepatitis C
, 百拇医药
Chen Peilan, Chen Nailing, Liu Chaoying, Li Ling, Chen Liangbiao
Institute of Liver Disease, Beijing Army General Hospital of PLA, Beijing, 100700
Abstract: Objective and Methods To study the relationship with apoptosis with hepatocytes to histological activity indexes (HAI) and Fas antigen expression in viral hepatitis C. Transmission electron microscopy and immuohistochemical method were used to study of hepatocyte apoptosis in the liver tissues of 23 cases of patients with chronic hepatitis C. Results There are a variety of morphologic changes in apoptotic cells. The apoptosis index was higher in patients with high HAI and with the medium to heavy degree of Fas antigen expression. Conclusion A series of ultrasmicropathologic changes happened in the apoptotic cells. The interaction of Fas antigen and Fas ligand on hepatocytes may induce the apoptosis of liver cells. Hepatocellular apoptosis might make result in liver tissue damage.
, 百拇医药
Key words: transmission electron microscopy; immunochemistry; hepatitis C; apoptosis
应用电镜和免疫组化方法对慢性丙型肝炎肝细胞凋亡进行了观察，以探讨细胞凋亡与肝组织 Fas抗原表达及组织病理损伤的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 慢性丙型肝炎23例，男15例，女8例。其中慢性活动性肝炎(CAH)10例，慢性迁延性肝炎(CPH)13例，均为血清抗HCV或(和)HCV RNA 阳性。平均年龄(30.9± 10.5)岁。肝组织均经肝脏穿刺获得。
1.2 方法
1.2.1 每例肝标本分成两份,一份用3%戊二醛和1%锇酸双固定,EPON812包埋。半薄切片光镜定位肝小叶及周边炎症浸润区、坏死区，并分别做超薄切片,国产电镜观察。以所见凋亡细胞与观察肝细胞总数百分比(平均)为凋亡指数，再与肝细胞 Fas抗原表达状况及组织活动度积分(HAI)进行比较分析。
, 百拇医药
1.2.2 另一份标本经10%福尔马林固定做石蜡包埋,制成4 μm厚连续切片,常规H.E.染色,进行病理诊断,并按Knodell方法[1]计算HAI前三项。另一张切片做免疫组化检测Fas抗原。试剂购自 北京中山生物试剂公司，操作按试剂盒说明书进行。Fas抗原半定量判断根据Kiyoshi等[2]报道的方法进行统计学处理，t检验。
2 结果
2.1 电镜观察凋亡肝细胞呈多种形态特征 (1)胞体增大,电子密度高；胞核小, 核、浆比例明显降低；多见核染色质颗粒块状凝聚,边集于核膜下,常染色质区空亮或染色质溶解,核呈均质无结构状态。与邻近细胞相比,此类凋亡细胞线粒体增生显著(图1)。(2)萎缩型细胞在炎症区和坏死灶旁较多见,其胞体皱缩,常常脱离肝细胞索,胞核大,核/浆比例上升,染色质呈块状散落在核内,细胞器凝集性改变,电子密度较高(图2)。(3)凋亡小体体积较小,胞核崩解或消失,细胞器结构模糊,胞膜完整。多数凋亡小体被巨噬细胞吞噬(图3)。在坏死区可同时见到凋亡和坏死肝细胞,以凋亡多见(图4)。
, 百拇医药
图1 胞体增大的凋亡肝细胞
Fig. 1 The apoptotic hepatocyte with enlarged cell body (H) × 6 000
图2 萎缩型凋亡肝细胞
Fig. 2 The apoptotic heaptocyte of atrophy type. Bile capillary(Δ)× 8 000
, 百拇医药
图3 凋亡小体(é )被巨噬细胞吞噬
Fig. 3 The apoptotic body (é )engulfed by the macrophage
图4 肝组织坏死处凋亡肝细胞
(H〕；坏死肝细胞(ê )；被巨噬细胞吞噬的凋亡小体(é )
Fig. 4 The apoptotic hepatocyte(H) in the necrosis region of liver tissues. (ê )Necrotic hepatocyte; (é )The apoptotic body engulfed by the macrophage × 8 000
, 百拇医药
2.2 免疫组化检测FAS抗原结果 肝小叶内Fas抗原阳性细胞呈弥散分布,炎症区和坏死灶周围 Fas阳性细胞可成群分布(图6)。Fas抗原表达程度与病变活动性基本一致。
图5、图6 免疫组化染色
Fig. 5 and 6 Immunohistochemistry staining. The cells positive for Fas antigen expression were stained brown × 240
, 百拇医药
2.3 电镜观察肝细胞凋亡指数与Fas表达、HAI的关系 23例患者肝细胞均检出了凋亡细胞， 但不同病例其检出数量区别很大。 Fas抗原中、强度表达及HAI高者细胞凋亡较多，与Fas表达弱及HAI低者有显著性差异。
3 讨论
电镜观察细胞凋亡具明显形态特征：核/浆比例降低,染色质重排,体积增大是细胞凋亡的早期变化,而胞体皱缩和凋亡小体形成为凋亡细胞中、晚期改变，胞膜始终保持完整。 此结果与细胞凋亡的实验研究[3]基本一致。由此可见，肝细胞凋亡是一系列超微病理改变过程。其中以核染色质结构改变为主，此改变可能是Fas系统导致的染色质断裂，DNA损伤、核功能丧失的形态学表现。
已有报导Fas/FasL介导细胞凋亡[4，5]。本研究发现,炎症区及坏死灶周围Fas阳性细胞成灶状 甚至成群分布，组织活动度积分高者Fas阳性表达率高。表1显示，CAH Fas表达水平明显高于CPH。这些结果与电镜观察组织定位切片所见凋亡细胞分布特点相似。表2表明，Fas呈中、强度表达和HAI高者细胞凋亡指数显著升高，CAH细胞凋亡重于CPH。提示Fas在肝细胞凋亡中起重要作用，细胞凋亡是丙肝肝组织重要的病理表现形式。
, 百拇医药
*北京军区重点课题
作者简介：陈佩兰，女，1943年出生；主任医师
参考文献
1 Knodell GR, Lshak KG, Bleek WC et al. Formulation and application of a numeral scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepotology, 1981,1157:431
2 Mochizuki K, Hayashi N, Hiramatsmn N et al. FAS antigen expression and apoptosis in live tissues of patients with chronic hepatitis C. Nippon Rinsho, 1995:53(Suppl):228
, 百拇医药
3 朴英杰，黄行许，霍 霞等.淋巴细胞自噬性凋亡的超微结构细胞化学研究. 第一军医大学学报, 1996,16(3):335
4 Hiramatsa N, Hagashi N, Katayama K et al. Immuohistochemical detection of Fas antigen in liver tissue of patients with chronic hepatitis C. Hepatology, 1994;19:1354
5 朱幼芙，骆抗先，何海棠等.慢性乙型肝炎肝细胞Fas表达和凋亡. 中华肝脏病学杂志, 1997，5(2): 85
(收稿日期：1998-07-15), http://www.100md.com
单位：北京军区总医院解放军肝病研究所，北京，100700
关键词：电子显微镜检查；免疫组化；丙型肝炎；凋亡
丙型肝炎肝细胞凋亡的电镜和免疫组化研究 摘要：目的 探讨丙型肝炎肝细胞凋亡与Fas抗原表达及病理损伤的关系。方法 应用电镜和免疫组化方法检测了23例慢性丙型肝炎患者的肝组织。结果 凋亡肝细胞呈多种形态学改变； Fas抗原中，强度表达及组织炎症活动度积分高者, 细胞凋亡指数增高。结论 肝细胞凋亡是一系列超微病理改变过程，Fas系统在介导细胞凋亡中起重要作用，细胞凋亡是慢性丙型肝炎肝组织的重要病理变化。
中图分类号：R512.603
TEM and immunochemical study of apoptotic hepatocytes in liver tissues of patients with chronic hepatitis C
, 百拇医药
Chen Peilan, Chen Nailing, Liu Chaoying, Li Ling, Chen Liangbiao
Institute of Liver Disease, Beijing Army General Hospital of PLA, Beijing, 100700
Abstract: Objective and Methods To study the relationship with apoptosis with hepatocytes to histological activity indexes (HAI) and Fas antigen expression in viral hepatitis C. Transmission electron microscopy and immuohistochemical method were used to study of hepatocyte apoptosis in the liver tissues of 23 cases of patients with chronic hepatitis C. Results There are a variety of morphologic changes in apoptotic cells. The apoptosis index was higher in patients with high HAI and with the medium to heavy degree of Fas antigen expression. Conclusion A series of ultrasmicropathologic changes happened in the apoptotic cells. The interaction of Fas antigen and Fas ligand on hepatocytes may induce the apoptosis of liver cells. Hepatocellular apoptosis might make result in liver tissue damage.
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Key words: transmission electron microscopy; immunochemistry; hepatitis C; apoptosis
应用电镜和免疫组化方法对慢性丙型肝炎肝细胞凋亡进行了观察，以探讨细胞凋亡与肝组织 Fas抗原表达及组织病理损伤的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 慢性丙型肝炎23例，男15例，女8例。其中慢性活动性肝炎(CAH)10例，慢性迁延性肝炎(CPH)13例，均为血清抗HCV或(和)HCV RNA 阳性。平均年龄(30.9± 10.5)岁。肝组织均经肝脏穿刺获得。
1.2 方法
1.2.1 每例肝标本分成两份,一份用3%戊二醛和1%锇酸双固定,EPON812包埋。半薄切片光镜定位肝小叶及周边炎症浸润区、坏死区，并分别做超薄切片,国产电镜观察。以所见凋亡细胞与观察肝细胞总数百分比(平均)为凋亡指数，再与肝细胞 Fas抗原表达状况及组织活动度积分(HAI)进行比较分析。
, 百拇医药
1.2.2 另一份标本经10%福尔马林固定做石蜡包埋,制成4 μm厚连续切片,常规H.E.染色,进行病理诊断,并按Knodell方法[1]计算HAI前三项。另一张切片做免疫组化检测Fas抗原。试剂购自 北京中山生物试剂公司，操作按试剂盒说明书进行。Fas抗原半定量判断根据Kiyoshi等[2]报道的方法进行统计学处理，t检验。
2 结果
2.1 电镜观察凋亡肝细胞呈多种形态特征 (1)胞体增大,电子密度高；胞核小, 核、浆比例明显降低；多见核染色质颗粒块状凝聚,边集于核膜下,常染色质区空亮或染色质溶解,核呈均质无结构状态。与邻近细胞相比,此类凋亡细胞线粒体增生显著(图1)。(2)萎缩型细胞在炎症区和坏死灶旁较多见,其胞体皱缩,常常脱离肝细胞索,胞核大,核/浆比例上升,染色质呈块状散落在核内,细胞器凝集性改变,电子密度较高(图2)。(3)凋亡小体体积较小,胞核崩解或消失,细胞器结构模糊,胞膜完整。多数凋亡小体被巨噬细胞吞噬(图3)。在坏死区可同时见到凋亡和坏死肝细胞,以凋亡多见(图4)。
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图1 胞体增大的凋亡肝细胞
Fig. 1 The apoptotic hepatocyte with enlarged cell body (H) × 6 000
图2 萎缩型凋亡肝细胞
Fig. 2 The apoptotic heaptocyte of atrophy type. Bile capillary(Δ)× 8 000
, 百拇医药
图3 凋亡小体(é )被巨噬细胞吞噬
Fig. 3 The apoptotic body (é )engulfed by the macrophage
图4 肝组织坏死处凋亡肝细胞
(H〕；坏死肝细胞(ê )；被巨噬细胞吞噬的凋亡小体(é )
Fig. 4 The apoptotic hepatocyte(H) in the necrosis region of liver tissues. (ê )Necrotic hepatocyte; (é )The apoptotic body engulfed by the macrophage × 8 000
, 百拇医药
2.2 免疫组化检测FAS抗原结果 肝小叶内Fas抗原阳性细胞呈弥散分布,炎症区和坏死灶周围 Fas阳性细胞可成群分布(图6)。Fas抗原表达程度与病变活动性基本一致。
图5、图6 免疫组化染色
Fig. 5 and 6 Immunohistochemistry staining. The cells positive for Fas antigen expression were stained brown × 240
, 百拇医药
2.3 电镜观察肝细胞凋亡指数与Fas表达、HAI的关系 23例患者肝细胞均检出了凋亡细胞， 但不同病例其检出数量区别很大。 Fas抗原中、强度表达及HAI高者细胞凋亡较多，与Fas表达弱及HAI低者有显著性差异。
3 讨论
电镜观察细胞凋亡具明显形态特征：核/浆比例降低,染色质重排,体积增大是细胞凋亡的早期变化,而胞体皱缩和凋亡小体形成为凋亡细胞中、晚期改变，胞膜始终保持完整。 此结果与细胞凋亡的实验研究[3]基本一致。由此可见，肝细胞凋亡是一系列超微病理改变过程。其中以核染色质结构改变为主，此改变可能是Fas系统导致的染色质断裂，DNA损伤、核功能丧失的形态学表现。
已有报导Fas/FasL介导细胞凋亡[4，5]。本研究发现,炎症区及坏死灶周围Fas阳性细胞成灶状 甚至成群分布，组织活动度积分高者Fas阳性表达率高。表1显示，CAH Fas表达水平明显高于CPH。这些结果与电镜观察组织定位切片所见凋亡细胞分布特点相似。表2表明，Fas呈中、强度表达和HAI高者细胞凋亡指数显著升高，CAH细胞凋亡重于CPH。提示Fas在肝细胞凋亡中起重要作用，细胞凋亡是丙肝肝组织重要的病理表现形式。
, 百拇医药
*北京军区重点课题
作者简介：陈佩兰，女，1943年出生；主任医师
参考文献
1 Knodell GR, Lshak KG, Bleek WC et al. Formulation and application of a numeral scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepotology, 1981,1157:431
2 Mochizuki K, Hayashi N, Hiramatsmn N et al. FAS antigen expression and apoptosis in live tissues of patients with chronic hepatitis C. Nippon Rinsho, 1995:53(Suppl):228
, 百拇医药
3 朴英杰，黄行许，霍 霞等.淋巴细胞自噬性凋亡的超微结构细胞化学研究. 第一军医大学学报, 1996,16(3):335
4 Hiramatsa N, Hagashi N, Katayama K et al. Immuohistochemical detection of Fas antigen in liver tissue of patients with chronic hepatitis C. Hepatology, 1994;19:1354
5 朱幼芙，骆抗先，何海棠等.慢性乙型肝炎肝细胞Fas表达和凋亡. 中华肝脏病学杂志, 1997，5(2): 85
(收稿日期：1998-07-15), http://www.100md.com