ELISA法测定血清Ⅳ型胶原
作者：刘向祎 寇丽筠
单位：刘向祎(北京同仁医院检验科)；寇丽筠(北京医科大学第三临床医院)
关键词：Ⅳ型胶原；双抗夹心酶联免疫吸附法
北京医学000212 摘要 目的 建立一种测定血清Ⅳ型胶原(CⅣ)的夹心ELISA法。方法 分别制备Ⅳ型胶原的多抗和单抗，正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化，用改良过碘酸钠法标记单抗。采用多抗包板，单抗标酶，建立测定血清CⅣ的双抗夹心ELISA法。结果 该法灵敏度为22.0μg/L,线性范围为31～1000μg/L。本法的批内和批间变异系数分别为5.2%和11.8%，平均回收率为96%。与进口试剂盒相比相关性良好。临床应用结果可信。结论 本法灵敏、准确、简便，便于临床推广使用。
Detection of type Ⅳ collagen by enzyme immunoassay
, 百拇医药
Liu Xiangyi，Kou Liyun
(Beijing Tong Ren Hospital, Beijing100730)
Abstract Objective To develope a sandwich enzyme-immunoassay (EIA) for human serum type Ⅳ collagen(CⅣ).Methods We produced the polyclonal antiserum and monoclonal antibody. It was purified by a simple, non-chromatographic procedure. The polyclonal antibody was used as a solid phase and a horseradish peroxidase-labeled monoclonal antibody was used as a conjugate.Results The sensitivity of the method was 22. 0 μg/L.The working range of standard curve was 31～1000μg/L.CVs of intraassay and inter-assay were 5.2% and 11.8% respectively. The average recovery was 96%. A significent correlation was found between our method and a commercial kit maded in Japan. Conclusions The ElA of CⅣ is sensitive, accurate, specific and simple.
, 百拇医药
Key Words Type Ⅳ collage Sandwish immunoassay
Ⅳ型胶原(CⅣ)是基底膜的主要成分，它的主要存在形式是含α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)链的异三聚体，分子排列成网状。近来研究表明[1]，血清CⅣ水平与肝纤维化密切相关，被认为是肝纤维化早期诊断较好的指标。测定CⅣ血清含量报道多为放免法，有一定放射污染。Obata等[2]应用单抗建立了酶免法，国内尚未有测定血清CⅣ酶免法的报道。本文用多抗包板，单抗标酶，建立了一种双抗夹心法来测定血清CⅣ水平。
材料与方法
一、材料
Ⅳ型胶原(Sigma公司提供),NUNC板(丹麦)，DEAE-纤维素(Whatman公司提供)，过碘酸钠，辣根过氧化物酶(HRP，Sigma公司提供)Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原(本室自提)，其余为国产分析纯试剂。家兔和BALB/C小鼠由北京医科大学动物室提供。
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二、临床标本
正常对照组(56例)，来自体检正常者；肝硬化患者(35例)来自住院确诊病人。
三、方法
1.单抗大量生产和纯化
杂交瘤细胞腹腔注射小鼠产生腹水。腹水用正辛酸-硫酸铵法纯化。间接ELISA法进行单抗特异性鉴定。
2.多抗的产生和纯化
免疫家兔制备抗血清。采用IgG的快速纯化法：于湿基DEAE-32纤维素加入稀释的兔血清，4℃吸附杂蛋白，充分搅拌抽干，滤液为纯化的IgG。
3.抗体纯度鉴定(SDS-PAGE)
制备12%分离胶，10%浓缩胶，样品加入等量缓冲液，沸水浴2分钟，冷却后加样，电泳(25mA)4小时，经考马斯亮蓝R-250染色。
, 百拇医药
4.HRP标记单抗：改良过碘酸钠法
取5mgHRP溶于0.2mol/L pH5.6的乙酸缓冲液0.5ml，再加入0.1mol/L 0.25ml的过碘酸钠混匀。加入单抗约5mg混匀，调pH为9.0，4℃过夜，加入硼氢化钠0.5mg混匀，透析过夜。
5.双抗夹心法的建立(EIA)
多抗用缓冲液稀释成10μg/ml，包被NUNC板，4℃过夜。洗后加入2%BSA封闭。加入系列稀释的标准CⅣ和待测血清，每孔100μl，37℃水浴1小时，洗后加入HRP-单抗(1∶500)100μl,37℃水浴1小时后，洗5次，加入OPD底物液，显色30分钟，终止后酶标仪490nm比色。计算标本CⅣ含量。
结 果
一、Ⅳ型胶原纯度
, 百拇医药
经SDS电泳，以Sigma 6H分子量标准，分为5条区带，与文献报道相符。
二、单抗特异性
抗CⅣ的杂交瘤细胞分泌的单抗与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原无交叉反应，有较好的特异性。
三、单抗和多抗纯度
从SDS-PAGE结果可以看出，正辛酸纯化后的单抗和DEAE纯化后的多抗在25KD和56KD有两条带，代表免疫球蛋白的轻链和重链，说明纯度良好。
四、单抗亚型鉴定
ELISA法加入相应抗血清，单抗为IgG1型，轻链为λ型。
五、酶标单抗的鉴定
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标记率即A403nm/A280nm值，表示酶标抗体中HRP所占的比例，结果为0.4。
六、ELISA方法的评价
1.标准曲线的建立
CⅣ抗原倍比稀释，得出测定范围从31～1000μg/L呈线性关系。
2.灵敏度、重复性和准确性
本法的灵敏度为22.0μg/L。高低浓度的血清标本重复10次测定，批内和批间变异系数分别为5.2%和11.8%。用回收实验来测其准确性，平均回收率为96%。
3.与日本试剂盒比较
本法与日本第一化学药品株式会社生产的Ⅳ-C试剂盒同时测定50份血清标本，相关性良好，r=0.93,相关方程Y=0.8121X+25.4947。
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七、临床初步应用见附表。
附表 血清CⅣ含量测定结果 组别
例数
CⅣ(μg/L)
s
对照组
肝硬化组
56
35
78.5
314.5*
26.2
186.6
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与正常对照组比较*P<0.01讨 论
本研究选用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，简便易行，纯度高[3]。首先，白蛋白和其它非IgG蛋白质被正辛酸沉淀，IgG由硫酸铵沉淀。多抗采用快速纯化法[4]，即用DEAE-纤维素吸附lgG以外的蛋白而达到纯化IgG的目的。本法简便、快速，纯化的抗体经SDS-PAGE鉴定纯度良好。
本研究采用改良的过碘酸钠法标记单克隆抗体。理想的酶结合物标记率A403nm/A280nm之比在0.3～0.6之间较好。我们使用进口酶标记单抗，标记率为0.4，达到要求。
针对Ⅳ型胶原的放免测定法(EIA)采用的抗体为多抗，反应时间长，而且有一定放射污染。竞争性EIA法[5]灵敏度低，且不能保证抗原抗体沉淀完全。
本研究采用多抗包板，单抗标酶棋盘滴定法确立最适浓度，建立双抗夹心EIA法。CⅣ单抗的特异性保证了此方法的特异性，与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原无交叉反应。采用高纯度的抗体提高了反应的敏感度，拓宽线性。批内与批间变异系数分别为5.2%和11.8%，说明精密度较好。平均回收率为96%，说明此方法的准确性良好。本法与进口的CⅣ酶免测定试剂盒进行比较，两者的相关性很好。临床测定结果表明，肝硬化患者血清CⅣ水平显著性高于正常对照组。本法成本较低，操作简便，而进口试剂盒采用试管法，操作复杂，价格昂贵，所以本法在国内有良好的发展前景。
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参 考 文 献
1，Ueno T, Inuzuka S, Torimura, et al. Significance of serum type Ⅳ collagen levels in various liver diseases: measurement with a one step sandwich enzyme immunoassay using monoclonal antibodies with specificity for pepsin-solubilized type Ⅳ collagen. Scand J gastroenterol, 1992, 27:513.
2，Obata K, Iwata K, Ichida T, et al. One step sandwish enzyme immunoassay for human type Ⅳ collagen using monoclonal antibodies. Clin Chim Acta, 1989, 181:293.
, 百拇医药
3，Michella M,McKinney, Parkinson A, et al. A simple non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. J Immunol Med, 1987,96:271.
4，马连红，周 兵，田 伟，等.羊、兔血清IgG的快速纯化及其分析鉴定.免疫学杂志，1996，12：197.
5，Rennard SI, Berg R,Martin GR, et al. Enzyme-linked immunoassay (ELISA) for connective tissue components. Anal Biochem, 1980, 104:205.
(收稿：1998-10-28 修回：1999-06-29), 百拇医药
单位：刘向祎(北京同仁医院检验科)；寇丽筠(北京医科大学第三临床医院)
关键词：Ⅳ型胶原；双抗夹心酶联免疫吸附法
北京医学000212 摘要 目的 建立一种测定血清Ⅳ型胶原(CⅣ)的夹心ELISA法。方法 分别制备Ⅳ型胶原的多抗和单抗，正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化，用改良过碘酸钠法标记单抗。采用多抗包板，单抗标酶，建立测定血清CⅣ的双抗夹心ELISA法。结果 该法灵敏度为22.0μg/L,线性范围为31～1000μg/L。本法的批内和批间变异系数分别为5.2%和11.8%，平均回收率为96%。与进口试剂盒相比相关性良好。临床应用结果可信。结论 本法灵敏、准确、简便，便于临床推广使用。
Detection of type Ⅳ collagen by enzyme immunoassay
, 百拇医药
Liu Xiangyi，Kou Liyun
(Beijing Tong Ren Hospital, Beijing100730)
Abstract Objective To develope a sandwich enzyme-immunoassay (EIA) for human serum type Ⅳ collagen(CⅣ).Methods We produced the polyclonal antiserum and monoclonal antibody. It was purified by a simple, non-chromatographic procedure. The polyclonal antibody was used as a solid phase and a horseradish peroxidase-labeled monoclonal antibody was used as a conjugate.Results The sensitivity of the method was 22. 0 μg/L.The working range of standard curve was 31～1000μg/L.CVs of intraassay and inter-assay were 5.2% and 11.8% respectively. The average recovery was 96%. A significent correlation was found between our method and a commercial kit maded in Japan. Conclusions The ElA of CⅣ is sensitive, accurate, specific and simple.
, 百拇医药
Key Words Type Ⅳ collage Sandwish immunoassay
Ⅳ型胶原(CⅣ)是基底膜的主要成分，它的主要存在形式是含α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)链的异三聚体，分子排列成网状。近来研究表明[1]，血清CⅣ水平与肝纤维化密切相关，被认为是肝纤维化早期诊断较好的指标。测定CⅣ血清含量报道多为放免法，有一定放射污染。Obata等[2]应用单抗建立了酶免法，国内尚未有测定血清CⅣ酶免法的报道。本文用多抗包板，单抗标酶，建立了一种双抗夹心法来测定血清CⅣ水平。
材料与方法
一、材料
Ⅳ型胶原(Sigma公司提供),NUNC板(丹麦)，DEAE-纤维素(Whatman公司提供)，过碘酸钠，辣根过氧化物酶(HRP，Sigma公司提供)Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原(本室自提)，其余为国产分析纯试剂。家兔和BALB/C小鼠由北京医科大学动物室提供。
, http://www.100md.com
二、临床标本
正常对照组(56例)，来自体检正常者；肝硬化患者(35例)来自住院确诊病人。
三、方法
1.单抗大量生产和纯化
杂交瘤细胞腹腔注射小鼠产生腹水。腹水用正辛酸-硫酸铵法纯化。间接ELISA法进行单抗特异性鉴定。
2.多抗的产生和纯化
免疫家兔制备抗血清。采用IgG的快速纯化法：于湿基DEAE-32纤维素加入稀释的兔血清，4℃吸附杂蛋白，充分搅拌抽干，滤液为纯化的IgG。
3.抗体纯度鉴定(SDS-PAGE)
制备12%分离胶，10%浓缩胶，样品加入等量缓冲液，沸水浴2分钟，冷却后加样，电泳(25mA)4小时，经考马斯亮蓝R-250染色。
, 百拇医药
4.HRP标记单抗：改良过碘酸钠法
取5mgHRP溶于0.2mol/L pH5.6的乙酸缓冲液0.5ml，再加入0.1mol/L 0.25ml的过碘酸钠混匀。加入单抗约5mg混匀，调pH为9.0，4℃过夜，加入硼氢化钠0.5mg混匀，透析过夜。
5.双抗夹心法的建立(EIA)
多抗用缓冲液稀释成10μg/ml，包被NUNC板，4℃过夜。洗后加入2%BSA封闭。加入系列稀释的标准CⅣ和待测血清，每孔100μl，37℃水浴1小时，洗后加入HRP-单抗(1∶500)100μl,37℃水浴1小时后，洗5次，加入OPD底物液，显色30分钟，终止后酶标仪490nm比色。计算标本CⅣ含量。
结 果
一、Ⅳ型胶原纯度
, 百拇医药
经SDS电泳，以Sigma 6H分子量标准，分为5条区带，与文献报道相符。
二、单抗特异性
抗CⅣ的杂交瘤细胞分泌的单抗与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原无交叉反应，有较好的特异性。
三、单抗和多抗纯度
从SDS-PAGE结果可以看出，正辛酸纯化后的单抗和DEAE纯化后的多抗在25KD和56KD有两条带，代表免疫球蛋白的轻链和重链，说明纯度良好。
四、单抗亚型鉴定
ELISA法加入相应抗血清，单抗为IgG1型，轻链为λ型。
五、酶标单抗的鉴定
, http://www.100md.com
标记率即A403nm/A280nm值，表示酶标抗体中HRP所占的比例，结果为0.4。
六、ELISA方法的评价
1.标准曲线的建立
CⅣ抗原倍比稀释，得出测定范围从31～1000μg/L呈线性关系。
2.灵敏度、重复性和准确性
本法的灵敏度为22.0μg/L。高低浓度的血清标本重复10次测定，批内和批间变异系数分别为5.2%和11.8%。用回收实验来测其准确性，平均回收率为96%。
3.与日本试剂盒比较
本法与日本第一化学药品株式会社生产的Ⅳ-C试剂盒同时测定50份血清标本，相关性良好，r=0.93,相关方程Y=0.8121X+25.4947。
, http://www.100md.com
七、临床初步应用见附表。
附表 血清CⅣ含量测定结果 组别
例数
CⅣ(μg/L)
s
对照组
肝硬化组
56
35
78.5
314.5*
26.2
186.6
, http://www.100md.com
与正常对照组比较*P<0.01讨 论
本研究选用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，简便易行，纯度高[3]。首先，白蛋白和其它非IgG蛋白质被正辛酸沉淀，IgG由硫酸铵沉淀。多抗采用快速纯化法[4]，即用DEAE-纤维素吸附lgG以外的蛋白而达到纯化IgG的目的。本法简便、快速，纯化的抗体经SDS-PAGE鉴定纯度良好。
本研究采用改良的过碘酸钠法标记单克隆抗体。理想的酶结合物标记率A403nm/A280nm之比在0.3～0.6之间较好。我们使用进口酶标记单抗，标记率为0.4，达到要求。
针对Ⅳ型胶原的放免测定法(EIA)采用的抗体为多抗，反应时间长，而且有一定放射污染。竞争性EIA法[5]灵敏度低，且不能保证抗原抗体沉淀完全。
本研究采用多抗包板，单抗标酶棋盘滴定法确立最适浓度，建立双抗夹心EIA法。CⅣ单抗的特异性保证了此方法的特异性，与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原无交叉反应。采用高纯度的抗体提高了反应的敏感度，拓宽线性。批内与批间变异系数分别为5.2%和11.8%，说明精密度较好。平均回收率为96%，说明此方法的准确性良好。本法与进口的CⅣ酶免测定试剂盒进行比较，两者的相关性很好。临床测定结果表明，肝硬化患者血清CⅣ水平显著性高于正常对照组。本法成本较低，操作简便，而进口试剂盒采用试管法，操作复杂，价格昂贵，所以本法在国内有良好的发展前景。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1，Ueno T, Inuzuka S, Torimura, et al. Significance of serum type Ⅳ collagen levels in various liver diseases: measurement with a one step sandwich enzyme immunoassay using monoclonal antibodies with specificity for pepsin-solubilized type Ⅳ collagen. Scand J gastroenterol, 1992, 27:513.
2，Obata K, Iwata K, Ichida T, et al. One step sandwish enzyme immunoassay for human type Ⅳ collagen using monoclonal antibodies. Clin Chim Acta, 1989, 181:293.
, 百拇医药
3，Michella M,McKinney, Parkinson A, et al. A simple non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. J Immunol Med, 1987,96:271.
4，马连红，周 兵，田 伟，等.羊、兔血清IgG的快速纯化及其分析鉴定.免疫学杂志，1996，12：197.
5，Rennard SI, Berg R,Martin GR, et al. Enzyme-linked immunoassay (ELISA) for connective tissue components. Anal Biochem, 1980, 104:205.
(收稿：1998-10-28 修回：1999-06-29), 百拇医药