乙型病毒性肝炎血清HBV DNA定量检测
作者：严迎娣 唐锡尔 陈离伟
单位：(宁波市传染病医院 315010)
关键词：
重庆医学000334 聚合酶链反应(PCR)是检测乙型肝炎病毒血症的敏感技术，我们用定量PCR检测148例乙型病毒性肝炎(乙肝)患者血清HBV DNA，并对其中部分病例作前C区1896位变异的检测，以探讨他们的临床意义。
1 材料与方法
1.1 对象
148例均为我院1998年7月～1999年3月住院的单纯乙肝患者，男109例，女39例，年龄3～61岁，平均32.8岁，其中急性肝炎16例，慢性肝炎轻度40例，中度54例，重度17例，重症肝炎16例，静止期肝硬化5例。诊断参照1995年北京全国传染病寄生虫病学术会议修订的标准。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 血清HBV DNA定量PCR检测 采用信号引物能量转移PCR法。PCR扩增仪为Biotronics Tech Corp 产品AG-9600荧光定量PCR系统。试剂(HBV DNA定量标准品，不对称特异性引物，信号扩增引物)由深圳市百雅克泰生物技术有限公司提供。血清处理采用裂解剂和热处理后异丙醇沉淀法。检测方法为套式PCR法，先扩增HBV区中241 bp长段，经20循环后，加入信号引物，扩增该片段中的64 bp片段。每2个循环测定1次信号引物能量转换的数据，使用计算机自动分析定量。
1.2.2 HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc测定 采用放射免疫法，试剂由山东潍坊3V公司提供。
1.2.3 HBV DNA定性测定 采用斑点杂交法，试剂由上海医科大学预防医学科提供。
1.2.4 HBV前C区1896位突变的检测 应用错配PCR限制片段长度多态性分析方法[1]。
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1.3 统计方法
卡方检验
2 结果
2.1 HBV DNA定量PCR测定结果 每次试验设立5个HBV DNA标准品系列浓度，依次为108、107，……104 copies/mI。其检测灵敏度为104 copies/mI，大于该浓度者为阳性。结果148例中HBV DNA阳性者134例，阳性率90.54%。
2.2 斑点杂交法检出HBV DNA71例，阳性率为47.97%。
2.3 HBV DNA定量PCR测定148例乙肝患者高滴度(≥106 copies/mI)者80例(54.05%)，各临床类型检测结果见表。
, 百拇医药
表 148例乙肝患者血清HBV DNA定量PCR测定结果 临床类型
例数
高滴度数
%
急性肝炎
16
2
12.50
慢性轻度
40
25
62.50
慢性中度
, 百拇医药
54
33
61.11
慢性重度
17
9
52.94
重症肝炎
16
9
56.25
肝硬化
5
, http://www.100md.com
2
40.00
急性肝炎与慢性各型及重症肝炎相比，差异有显著性，P<0.05。慢性肝炎各型及重症肝炎互相比较，差异无显著性，P>0.05，肝硬化与其它各型相比，差异均无显著性，P>0.05。
2.4 HBeAg阳性组90例测得血清HBV DNA定量高滴度为60例(66.57%)，抗HBe阳性组48例高滴度为15例(31.25%)，两组相比有显著差异(X2=15.83，P<0.01)。
2.5 在本文148例患者中对63例(其中抗HBe阳性23例)进行HBV前C区1896位点突变的检测，检出变异株28例，其中完全变异8例，该8例血清HBV DNA定量高滴度为5例(62.50%)，野生株35例，高滴度为21例(60.00%)，两者相比差异无显著性(X2=0.07 P>0.05)。
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3 讨论
我们对148例乙肝患者检测了血清HBV DNA，定量PCR法阳性率为90.54%，HBV DNA高滴度率为54.05%，而斑点杂交法阳性率仅为47.97%，显然定量HBV DNA技术优于斑点杂交法，有助于对乙肝的临床诊断，抗病毒药物疗效考核及流行病学调查。在临床各类型的患者中血清HBV DNA定量高滴度比例中，急性肝炎明显低于慢性肝炎及重症肝炎(P<0.05)，这可解释为急性肝炎患者免疫功能正常，病毒得以清除。而慢性肝炎各型及重症肝炎之间均无显著差异，表明慢性乙肝患者随着病情的加重，血清HBV DNA水平并无变化，显示血清HBV DNA含量与肝细胞损害程度无相关关系，肝脏炎症活动程度主要取决于机体的免疫状态[2、3]。
有报道慢性肝炎及肝硬化患者中HBeAg阳性组和抗HBe阳性组HBV DNA复制水平并无差异[4]，然而本文比较该两组患者差异具有显著性(P<0.01)，表明HBV复制抗HBe阳性组远不如HBeAg阳性组活跃，但仍有部分患者具有相当的复制能力和传染性。本资料未发现HBV前C区1896位完全变异株和野生株病人血清HBV DNAP定量高滴度率存在显著差异(P>0.05)，变异株具有与野生株同样活跃的复制能力，因此感染前C区变异株患者同样有必要作抗病毒治疗。在检测前C区变异的23例抗HBe阳性者中，完全变异者仅占34.78%(3/23)，因此HBV前C区变异并不是抗HBe阳性患者HBV复制水平低下的主要因素。
, 百拇医药
参考文献
1，杨洁，梁治森，骆抗先.错配PCR限制片段长度多态性分析：检测HBV前C区A83点突变.第一军医大学学报，1994，14(2)：95～97
2，张复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997，15：24～27
3，焦平华，杨伟，马光.乙型肝炎患者肝活动指数与血清HBV DNA含量关系初探.实用肝脏病杂志，1998，3：198～199
4，齐文杰，黄德庄，张建成，等.定量PCR对乙型肝炎患者血清HBV-DNA的测定与分析.中西医结合肝病杂志，1998，8：81～83, 百拇医药
单位：(宁波市传染病医院 315010)
关键词：
重庆医学000334 聚合酶链反应(PCR)是检测乙型肝炎病毒血症的敏感技术，我们用定量PCR检测148例乙型病毒性肝炎(乙肝)患者血清HBV DNA，并对其中部分病例作前C区1896位变异的检测，以探讨他们的临床意义。
1 材料与方法
1.1 对象
148例均为我院1998年7月～1999年3月住院的单纯乙肝患者，男109例，女39例，年龄3～61岁，平均32.8岁，其中急性肝炎16例，慢性肝炎轻度40例，中度54例，重度17例，重症肝炎16例，静止期肝硬化5例。诊断参照1995年北京全国传染病寄生虫病学术会议修订的标准。
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1.2 方法
1.2.1 血清HBV DNA定量PCR检测 采用信号引物能量转移PCR法。PCR扩增仪为Biotronics Tech Corp 产品AG-9600荧光定量PCR系统。试剂(HBV DNA定量标准品，不对称特异性引物，信号扩增引物)由深圳市百雅克泰生物技术有限公司提供。血清处理采用裂解剂和热处理后异丙醇沉淀法。检测方法为套式PCR法，先扩增HBV区中241 bp长段，经20循环后，加入信号引物，扩增该片段中的64 bp片段。每2个循环测定1次信号引物能量转换的数据，使用计算机自动分析定量。
1.2.2 HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc测定 采用放射免疫法，试剂由山东潍坊3V公司提供。
1.2.3 HBV DNA定性测定 采用斑点杂交法，试剂由上海医科大学预防医学科提供。
1.2.4 HBV前C区1896位突变的检测 应用错配PCR限制片段长度多态性分析方法[1]。
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1.3 统计方法
卡方检验
2 结果
2.1 HBV DNA定量PCR测定结果 每次试验设立5个HBV DNA标准品系列浓度，依次为108、107，……104 copies/mI。其检测灵敏度为104 copies/mI，大于该浓度者为阳性。结果148例中HBV DNA阳性者134例，阳性率90.54%。
2.2 斑点杂交法检出HBV DNA71例，阳性率为47.97%。
2.3 HBV DNA定量PCR测定148例乙肝患者高滴度(≥106 copies/mI)者80例(54.05%)，各临床类型检测结果见表。
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表 148例乙肝患者血清HBV DNA定量PCR测定结果 临床类型
例数
高滴度数
%
急性肝炎
16
2
12.50
慢性轻度
40
25
62.50
慢性中度
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54
33
61.11
慢性重度
17
9
52.94
重症肝炎
16
9
56.25
肝硬化
5
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2
40.00
急性肝炎与慢性各型及重症肝炎相比，差异有显著性，P<0.05。慢性肝炎各型及重症肝炎互相比较，差异无显著性，P>0.05，肝硬化与其它各型相比，差异均无显著性，P>0.05。
2.4 HBeAg阳性组90例测得血清HBV DNA定量高滴度为60例(66.57%)，抗HBe阳性组48例高滴度为15例(31.25%)，两组相比有显著差异(X2=15.83，P<0.01)。
2.5 在本文148例患者中对63例(其中抗HBe阳性23例)进行HBV前C区1896位点突变的检测，检出变异株28例，其中完全变异8例，该8例血清HBV DNA定量高滴度为5例(62.50%)，野生株35例，高滴度为21例(60.00%)，两者相比差异无显著性(X2=0.07 P>0.05)。
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3 讨论
我们对148例乙肝患者检测了血清HBV DNA，定量PCR法阳性率为90.54%，HBV DNA高滴度率为54.05%，而斑点杂交法阳性率仅为47.97%，显然定量HBV DNA技术优于斑点杂交法，有助于对乙肝的临床诊断，抗病毒药物疗效考核及流行病学调查。在临床各类型的患者中血清HBV DNA定量高滴度比例中，急性肝炎明显低于慢性肝炎及重症肝炎(P<0.05)，这可解释为急性肝炎患者免疫功能正常，病毒得以清除。而慢性肝炎各型及重症肝炎之间均无显著差异，表明慢性乙肝患者随着病情的加重，血清HBV DNA水平并无变化，显示血清HBV DNA含量与肝细胞损害程度无相关关系，肝脏炎症活动程度主要取决于机体的免疫状态[2、3]。
有报道慢性肝炎及肝硬化患者中HBeAg阳性组和抗HBe阳性组HBV DNA复制水平并无差异[4]，然而本文比较该两组患者差异具有显著性(P<0.01)，表明HBV复制抗HBe阳性组远不如HBeAg阳性组活跃，但仍有部分患者具有相当的复制能力和传染性。本资料未发现HBV前C区1896位完全变异株和野生株病人血清HBV DNAP定量高滴度率存在显著差异(P>0.05)，变异株具有与野生株同样活跃的复制能力，因此感染前C区变异株患者同样有必要作抗病毒治疗。在检测前C区变异的23例抗HBe阳性者中，完全变异者仅占34.78%(3/23)，因此HBV前C区变异并不是抗HBe阳性患者HBV复制水平低下的主要因素。
, 百拇医药
参考文献
1，杨洁，梁治森，骆抗先.错配PCR限制片段长度多态性分析：检测HBV前C区A83点突变.第一军医大学学报，1994，14(2)：95～97
2，张复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中HBV DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997，15：24～27
3，焦平华，杨伟，马光.乙型肝炎患者肝活动指数与血清HBV DNA含量关系初探.实用肝脏病杂志，1998，3：198～199
4，齐文杰，黄德庄，张建成，等.定量PCR对乙型肝炎患者血清HBV-DNA的测定与分析.中西医结合肝病杂志，1998，8：81～83, 百拇医药