PCR在单纯疱疹性角膜炎病原学诊断中的应用
作者：张慧茹 韩晓丽 侯丽枫 林发森
单位：张慧茹 韩晓丽 福建医科大学附属第一医院眼科(福州 350005)； 侯丽枫 林发森 福建省眼科研究所
关键词：单纯疱疹病毒；角膜炎；聚合酶链反应
福建医科大学学报990138 单纯疱疹性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)主要由I型单纯疱疹病毒(HSV-I)引起，是主要的致盲性眼病之一。其临床诊断主要依靠典型眼症及特征性角膜病变，经典的病原学诊断主要依靠病毒分离培养及显微镜检查，虽然特异性强, 但费时费力、敏感性较低, 对临床即时诊断不利。笔者采用PCR方法检测患者的泪液抽提物，以期能对HSK作出早期、快速的特异性诊断。
1 材料与方法
1.1 标本采集 52例各种类型角膜炎，其中树枝状 4例，地图状6例，盘状5例，霉菌性角膜溃疡及细菌性角膜溃疡(金葡菌2例，肺炎球菌3例)各5例，临床无典型症状或未定型角膜炎27例，另取10名正常人为对照。以高压灭菌的1 ml吸管在内眦吸取泪液约0.1 ml，置无菌1.5 ml Eppendorf管，-80℃保存。临床诊断按HSK参考文献[1]。
, http://www.100md.com
Taq DNA聚合酶及缓冲液购自美国PE公司，dNTP、蛋白酶K、100 bp PCR Ladder Marker购自德国宝灵曼公司，SDS、Tris碱饱和酚(pH 8.0)购自上海Sangon公司，其余为国产分析纯试剂。
PCR引物参考文献[2],由Sangon公司合成，PAGE纯化。序列为：Primer 1:5'-CATCACCGACCCGGAGAAGGAGC-3' Primer 2: 5'-GGGCCAG-GCGCTTGTTGGTGTA-3'。该对引物可特异性扩增HSV(Ⅰ型或Ⅱ型)片段为92 bp。
1.2 方法
1.2.1 PCR模板的制备 泪液0.1 ml于4000 r/min离心10 min，吸取上清弃沉淀，加入0.4 ml细胞裂解液(10 mmol/L Tris.Cl pH 8.0, 1 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl),混匀，再加入SDS(终浓度为2 mg/ml)及蛋白酶K(终浓度为0.5 mg/ml)55℃作用1 h。上述反应体系按顺序分别以等体积 Tris碱饱和酚(pH 8.0)、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。吸上清约0.4 ml，加入3 mol/L乙酸钠(pH 4.8)40 μl及无水乙醇0.8 ml,-20℃ 1 h，12000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀物以双蒸水10 μl溶解，此即为模板DNA。
, 百拇医药
1.2.2 PCR扩增 在50 μl反应体系中，加入模板DNA 10 μl，上下游引物各10 pmol，10.缓冲液5 μl，Taq DNA聚合酶1U。置PE2400型DNA扩增仪扩增。PCR扩增条件为：先以94℃变性5 min，然后按94℃变性30 s，58℃退火30 s， 72℃延伸30 s,扩增25个循环，最后以72℃充分延伸7 min。取反应产物2 μl在2%琼脂糖凝胶电泳以观测结果。
2 结 果
受检测的52例各种类型角膜炎泪液中，19例出现特异性的92 bp扩增带。其中，4例树枝状及6例地图状角膜炎PCR结果全部为阳性，5例盘状角膜炎全部为阴性，在5例霉菌性及5例细菌性角膜溃疡中各有1例阳性，27例临床无典型症状或未定型角膜炎共有7例阳性,阳性率为26.3% 。PCR阳性结果见附图。
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附图 泪液标本PCR扩增结果
1：100 bp PCR Ladder 2：无模板之阴性对照 3：无Taq酶之阴性对照 4～6：阳性PCR产物 7: 正常对照
3 讨 论
单纯疱疹性角膜炎分为上皮型、深基质层型及晚期病变[3]。上皮型临床表现为树枝状及地图状角膜炎，一般认为是由于单纯疱疹病毒直接破坏角膜上皮细胞所致。此时，泪液中病毒分离率为80%～90%。深基质层型表现为盘状角膜炎，一般认为是对单纯疱疹抗原的免疫反应，此时病毒已基本消失。本文中树枝状及地图状角膜炎泪液的PCR均为阳性，说明PCR方法具有较高的灵敏度, 与文献一致[4,5]。而盘状角膜炎PCR均为阴性，说明此时已不存在单纯疱疹病毒, 是一种免疫发病机制。
临床上依靠典型眼症及特征性角膜病变对单纯疱疹性角膜炎作出正确诊断并不困难，但当在疾病的早期或眼部病症不典型时，临床诊断就较为困难，本文共检测临床无典型症状或未定型角膜炎27例，7例PCR结果阳性，阳性率为26.3%，其中5例患者经无环鸟苷等相应的抗病毒治疗后痊愈，也说明确是单纯疱疹病毒感染，由此可见PCR技术对病毒诊断具有很高的特异性和敏感性，它可以避免漏诊、误诊，对临床治疗具有积极的指导意义。本文两例无环鸟苷治疗无效者其PCR阳性可能与药物本身有关.
, 百拇医药
另外，本组在霉菌性及细菌性角膜溃疡还各检出1例PCR阳性，可能是细菌、霉菌和病毒的混合感染。该结果提示在进行抗细菌及霉菌治疗的同时似应进行抗病毒治疗。
参考文献
[1]宋振英. 眼科诊断学. 北京：人民卫生出版社, 1992: 475
[2]林万明，杨瑞馥，黄尚志，等. PCR技术操作和应用指南. 北京：人民军医出版社， 1993: 300
[3]杨 钧. 现代眼科手册. 北京：人民卫生出版社, 1993: 59
[4]Crous CA, Pflugfelder SC, PereiraI, et al. Detection of herpes viral genomes in normal and diseased corneal epithalium. Curr Eye Tes, 1990;9:569
[5]Cleator GM, Klapper PE, Dennett C, et al. Corneal donor infection by herpes simplex virus DNA in donor cornea. Cornea, 1994;13:294
(收稿：1998-09-16 修回：1998-11-16), 百拇医药
单位：张慧茹 韩晓丽 福建医科大学附属第一医院眼科(福州 350005)； 侯丽枫 林发森 福建省眼科研究所
关键词：单纯疱疹病毒；角膜炎；聚合酶链反应
福建医科大学学报990138 单纯疱疹性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)主要由I型单纯疱疹病毒(HSV-I)引起，是主要的致盲性眼病之一。其临床诊断主要依靠典型眼症及特征性角膜病变，经典的病原学诊断主要依靠病毒分离培养及显微镜检查，虽然特异性强, 但费时费力、敏感性较低, 对临床即时诊断不利。笔者采用PCR方法检测患者的泪液抽提物，以期能对HSK作出早期、快速的特异性诊断。
1 材料与方法
1.1 标本采集 52例各种类型角膜炎，其中树枝状 4例，地图状6例，盘状5例，霉菌性角膜溃疡及细菌性角膜溃疡(金葡菌2例，肺炎球菌3例)各5例，临床无典型症状或未定型角膜炎27例，另取10名正常人为对照。以高压灭菌的1 ml吸管在内眦吸取泪液约0.1 ml，置无菌1.5 ml Eppendorf管，-80℃保存。临床诊断按HSK参考文献[1]。
, http://www.100md.com
Taq DNA聚合酶及缓冲液购自美国PE公司，dNTP、蛋白酶K、100 bp PCR Ladder Marker购自德国宝灵曼公司，SDS、Tris碱饱和酚(pH 8.0)购自上海Sangon公司，其余为国产分析纯试剂。
PCR引物参考文献[2],由Sangon公司合成，PAGE纯化。序列为：Primer 1:5'-CATCACCGACCCGGAGAAGGAGC-3' Primer 2: 5'-GGGCCAG-GCGCTTGTTGGTGTA-3'。该对引物可特异性扩增HSV(Ⅰ型或Ⅱ型)片段为92 bp。
1.2 方法
1.2.1 PCR模板的制备 泪液0.1 ml于4000 r/min离心10 min，吸取上清弃沉淀，加入0.4 ml细胞裂解液(10 mmol/L Tris.Cl pH 8.0, 1 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl),混匀，再加入SDS(终浓度为2 mg/ml)及蛋白酶K(终浓度为0.5 mg/ml)55℃作用1 h。上述反应体系按顺序分别以等体积 Tris碱饱和酚(pH 8.0)、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。吸上清约0.4 ml，加入3 mol/L乙酸钠(pH 4.8)40 μl及无水乙醇0.8 ml,-20℃ 1 h，12000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀物以双蒸水10 μl溶解，此即为模板DNA。
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1.2.2 PCR扩增 在50 μl反应体系中，加入模板DNA 10 μl，上下游引物各10 pmol，10.缓冲液5 μl，Taq DNA聚合酶1U。置PE2400型DNA扩增仪扩增。PCR扩增条件为：先以94℃变性5 min，然后按94℃变性30 s，58℃退火30 s， 72℃延伸30 s,扩增25个循环，最后以72℃充分延伸7 min。取反应产物2 μl在2%琼脂糖凝胶电泳以观测结果。
2 结 果
受检测的52例各种类型角膜炎泪液中，19例出现特异性的92 bp扩增带。其中，4例树枝状及6例地图状角膜炎PCR结果全部为阳性，5例盘状角膜炎全部为阴性，在5例霉菌性及5例细菌性角膜溃疡中各有1例阳性，27例临床无典型症状或未定型角膜炎共有7例阳性,阳性率为26.3% 。PCR阳性结果见附图。
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附图 泪液标本PCR扩增结果
1：100 bp PCR Ladder 2：无模板之阴性对照 3：无Taq酶之阴性对照 4～6：阳性PCR产物 7: 正常对照
3 讨 论
单纯疱疹性角膜炎分为上皮型、深基质层型及晚期病变[3]。上皮型临床表现为树枝状及地图状角膜炎，一般认为是由于单纯疱疹病毒直接破坏角膜上皮细胞所致。此时，泪液中病毒分离率为80%～90%。深基质层型表现为盘状角膜炎，一般认为是对单纯疱疹抗原的免疫反应，此时病毒已基本消失。本文中树枝状及地图状角膜炎泪液的PCR均为阳性，说明PCR方法具有较高的灵敏度, 与文献一致[4,5]。而盘状角膜炎PCR均为阴性，说明此时已不存在单纯疱疹病毒, 是一种免疫发病机制。
临床上依靠典型眼症及特征性角膜病变对单纯疱疹性角膜炎作出正确诊断并不困难，但当在疾病的早期或眼部病症不典型时，临床诊断就较为困难，本文共检测临床无典型症状或未定型角膜炎27例，7例PCR结果阳性，阳性率为26.3%，其中5例患者经无环鸟苷等相应的抗病毒治疗后痊愈，也说明确是单纯疱疹病毒感染，由此可见PCR技术对病毒诊断具有很高的特异性和敏感性，它可以避免漏诊、误诊，对临床治疗具有积极的指导意义。本文两例无环鸟苷治疗无效者其PCR阳性可能与药物本身有关.
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另外，本组在霉菌性及细菌性角膜溃疡还各检出1例PCR阳性，可能是细菌、霉菌和病毒的混合感染。该结果提示在进行抗细菌及霉菌治疗的同时似应进行抗病毒治疗。
参考文献
[1]宋振英. 眼科诊断学. 北京：人民卫生出版社, 1992: 475
[2]林万明，杨瑞馥，黄尚志，等. PCR技术操作和应用指南. 北京：人民军医出版社， 1993: 300
[3]杨 钧. 现代眼科手册. 北京：人民卫生出版社, 1993: 59
[4]Crous CA, Pflugfelder SC, PereiraI, et al. Detection of herpes viral genomes in normal and diseased corneal epithalium. Curr Eye Tes, 1990;9:569
[5]Cleator GM, Klapper PE, Dennett C, et al. Corneal donor infection by herpes simplex virus DNA in donor cornea. Cornea, 1994;13:294
(收稿：1998-09-16 修回：1998-11-16), 百拇医药