不同时限单眼斜视和剥夺猫视觉系统神经元的凋亡抑制基因表达机理研究
作者：邵立功 郭静秋
单位：北京医科大学第一医院小儿眼科(100853)
关键词：斜视；剥夺；视觉系统；凋亡抑制基因
眼视光学杂志990402摘 要 目的：研究和探讨敏感期内、末不同时限单眼斜视和剥夺动物模型视觉系统凋亡调节抑制基因Bcl-2塑性变化的规律。方法：应用免疫细胞化学SABC技术染色和计算机图像分析了Bcl-2蛋白在N、MS1、MD1、MS2和MD2猫同侧视皮质17区Ⅳ层及外侧膝状体相应层的表达。结果：在正常发育幼猫的视皮质和外侧膝状体主要是在神经元核浆，呈深棕黑色免疫阳性反应，胞浆淡染。在MS1和MD1眼输入的同侧视皮质17区Ⅳ层及外侧膝状体相应层(A1)表现为Bcl-2蛋白表达的免疫阳性神经元数目减少，核浆染色淡，表明Bcl-2 mRNA表达水平降低。在同侧视皮质17区Ⅳ层表达浓度和数密度：N组与MS1和MD1组比较差异具有非常显著性(P<0.001)；N组与MS2和MD2组比较差异无显著性(P>0.05)。结论：MS1和MD1组幼猫实验眼同侧视皮质17区Ⅳ层及同侧外侧膝状体Al层神经元在视觉发育敏感期内，由于长期的斜视及形觉剥夺效应以致功能低下，对Bcl-2调节的敏感性降低，以及对NTs的营养保护及上调Bcl-2 mRNA表达水平应答能力降低，在双眼竞争的神经元发育及突触连接中处于劣势，使对侧眼形成优势循环。这也可能解释在敏感期内当对侧眼遮盖时暴露弱视眼所出现反转弱视的戏剧效应。Bcl-2与NTs有交互作用，它们协同促进神经元的分化，发育和连接重塑。在正常的视环境中，双眼视平衡发育，凋亡抑制基因Bcl-2起着删除细胞死亡程序并保护调节NGF家族的生物效能。
, http://www.100md.com
Expression of the apoptosis inhibitory gene Bcl-2 in the neurons of visual system of MS and MD kittens during visual development
Shao Ligong,Guo Jingqiu.Department of pediatric Ophthalmology,First Teaching Hospital of Beijing Medical University,General Hospital of the People's Liberation Army,Beijing 100853
Abstract Objective:To investigate plasticity changes in the regulation of the expression of apoptosis inhibitory gene bcl-2 in the visual systems of normal (N),monocularly strabismic(MS) and monocularly deprived(MD) kittens during the critical period of development.The product (bcl-2 protein) of bcl-2 gene expression is an important bioactivator.It mediates neurtrophine and protective action by the NGF family.The studies provide a basis for understanding the mechanisms and for finding effective methods to prevent and treat amblyopia due to strabismus and deprivation in children.Methods:Surgery was performed on kittens during the critical period (age 2～4 wks) to induce esotropic MS by sectioning the lateral rectus muscle of one eye and MD by lid suture.Before surgery,the animals were randomly divided into 3 groups:N,MS and MD.After the animals were reared for sixteen weeks under the same environmental conditions,they were examined with 6-Channel Pattern Visual Evoked Potentials (6CPVEP).Then,visual cortex area 17 was investigated with polyclonal antibodies for bcl-2,which was used to label the neurons of visual cortex area 17 using the immunocytochemical Streptavidin Biotin Peroxidase Complex(SABC) method.Data were analyzed from photographs from optical microscopy and Computer Image Analysis.Results:Gene expression level of bcl-2mRNA (numeric density and concentration of bcl-2 immunopositive neurons) in layer Ⅲ of the ipsilateral visual cortex area 17 and the laminas receiving ipsilateral geniculate input from the strabismic and deprived eyes are significantly lower than the input from the untreated eyes.Conclusion:Results indicate that the functional status of neurons in layer Ⅲ of visual cortex area 17 and the laminas receiving lateral geniculate input from the treated eyes during the critical period of visual development are greatly weakened in the long term in response to convergence strabismus and form deprivation.That is,the treated eyes are hyposensitive to bcl-2 regulation.Their ability to respond to neurotrophine and the protective action of NTs (neurotrophic factors) is also reduced,with causes the synaptic connections of neurons in layer Ⅲ of visual cortex area 17 and layer Al of ipsilateral geniculate input from the treated eyes to be underdeveloped because the susceptibility of neurons to bcl-2 determines whether neurons in the visual pathways are affected by the dominant during binocular viewing so that critical synaptic links develop normally.
, 百拇医药
Key words Strabismus Deprivation Visual system Bcl-2
儿童弱视主要是在小儿视觉发育敏感期内，由于各种影响视觉发育的眼病和(或)视环境的不良，使双眼视长期紊乱、视觉系统神经元功能、形态和神经生化机制异常，临床表现有外眼及眼底检查无特殊变化，又不能完全矫正其低视力(≤0.8)、失立体视和形觉障碍等体征[1]。关于发病机理，近年来各国学者结合现代高技术对弱视形成的心理物理、神经病理生理和生化过程及变化特征进行了多方位的探讨和研究，为小儿眼科临床弱视防治工作提供了参考依据和新的途径，弱视动物模型能较客观地反映人类弱视形成的特点，其研究成果具有指导意义[2～4]。为了确定凋亡抑制基因bcl-2在敏感期内、末斜视和剥夺猫视觉系统中的作用和地位，我们应用组织学和免疫细胞化学技术对敏感期内、末斜视和剥夺猫模型视皮质和外侧膝状体神经元的bcl-2基因表达产物变化进行了观察和研究，从形态学、分子神经生物学角度探讨敏感期内和敏感期末单眼斜视(monocular strabismus,MS)和单眼剥夺(monocular deprivation,MD)模型猫视皮质神经元及其突触的可塑性变化机理。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验动物和试剂
1.1.1 动物采用实验用纯种虎皮猫共计32只。其中4～6wk龄幼猫24只，10～12wk龄幼猫8只。动物随机分为5组：①正常组(normal group,N);②单眼斜视一组(monocular strabismus1，MS1)；③单眼剥夺一组(monocular deprivation1，MD1)。上述三组每组8只为4～6wk龄，共计24只。④单眼斜视二组(MS2)；⑤单眼剥夺二组(MD2)。上述两组每组4只为10～12wk龄，共计8只。
1.1.2 试剂及仪器 常用试剂为市售纯化学分析试剂，由中国军事医学科学院基础医学研究所提供。主要试剂：SABC(Streptavidin Biotinperoxidae Complex)、正常羊血清和Bcl-2抗体(中山公司)。主要仪器：振动切片机、CQ-970型计算机图像分析仪、多导程图形视觉电生理仪(MPVEP)、Nikon双目自动照像显微镜和脑立体定位仪。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 单眼斜视和剥夺性弱视动物模型手术制作和饲养：单眼斜视组(MS)动物模型手术制作：在微量噻胺酮(Compound Ketamine)0.1ml/kg肌注麻醉下，结膜下注射少量利多卡因(0.5%)，沿角膜缘2mm处剪开球结膜并分离找出一眼外直肌群切除，然后再彻底分离周围结缔组织及外侧韧带，术后实验眼形成内斜视。手术眼共12只(左右眼各6只)其中8只眼为4～6wk幼猫(MS1)，4只眼为10～12wk猫(MS2)。
单眼剥夺组(MD)幼猫为剪除眼睑缘周围毛发后，自内眦到外眦剪除上下睑缘各1～1.5mm，皮下及皮肤分层缝合封闭实验眼形成单眼剥夺共12只(左眼、右眼各6只)。其中敏感期内(4～6wk)8只眼(MD1)，敏感期末4只眼(10～12wk，MD2)。动物的饲养环境是在宽敞饲养室内。N和MS1，MD1，MS2及MD2组实验猫共同在自然光线环境中散放喂养。
, 百拇医药
1.2.2 实验动物的灌注固定和取材：实验动物在饲养到第16周时进行MPVEPs检测，视觉电生理实验证实猫是否产生弱视后分批灌注固定动物并快速取材。(1)动物麻醉后行开胸术，剪开心包膜，右心室切开放出心血管系统血液，快速切开左心室并经左心室主动脉插管灌注生理盐水500ml冲洗心血管系统，接快灌注4℃冷固定液(4%多聚甲醛磷酸缓冲液，pH7.2)，再慢灌注100ml含4%多聚甲醛，0.5%戊二醛和0.2%苦味酸的4℃磷酸缓冲溶液(pH7.2)2小时。在4℃冰箱放置过夜后，标本块转至15%蔗糖溶液(PBS pH7.2)中浸泡12小时，待标本块下沉后行冰冻切片或振动切片。(2)标本取材顺序为：①开颅取脑，垂直脑矢状轴切取视皮质组块，部分切片为平行视皮质17区切取，免疫组织化学染色后选取Ⅳ层组织切片照相。②冠状切取同侧和对侧外侧膝状体组织。(3)行免疫细胞化学染色标本应用振动切片，组织片厚35～40μm。(4)免疫细胞化学SABC技术处理切片：①切片入PBS缓冲溶液(0.1mol/L,pH7.2)漂洗；②用甲醇加0.3%H2O2处理切片15～30分钟(室温)以封闭内源性过氧化酶的活性；③0.2%Tritonx-100液中10分钟(室温)；④以正常羊血清孵育15～25分钟(室温)，以封闭组织中的非特异性抗原；⑤滴加兔抗人第一抗体(1∶500)bcl-2抗体，湿盒内孵育1.5小时(室温)然后在4℃冰箱过夜。⑥PBS缓冲液充分冲洗，以去除切片上非特异吸附抗体；⑦再经0.3%tritonX-100/PBS漂洗2分钟后，依次加入生物素标记的羊抗兔IgG(1∶200)和SABC复合物(1∶100)中孵育30分钟(室温)；⑧PBS缓冲液漂洗，⑨用DAB-H2O2液显色；试剂组成为DAB50mg，0.05M的TB100ml，30%30～40μl；⑩将呈色后的组织切片置于流水中，以便终止呈色反应；11酒精梯度脱水，Hemo-De透明，DPX封固；12光镜下观察计算机图像分析。
, 百拇医药
1.2.3 计算机图像分析免疫细胞化学：(1)免疫细胞化学结果分析程序：参照细胞构筑学特点，将N，MS1，MD1，MS2和MD2组内每只幼猫同侧视皮质和外侧膝状体组织连续切片各5张，在QTM970型图像分析仪的10×40倍光镜视野下，测量其Bcl-2蛋白在上述解剖部位表达的单位面积内的积分光密度(IOD/Area)及数密度(Numberical Density)，数密度用：免疫阳性细胞数/视野内面积表示。每张切片选取5个视野。(2)统计学分析处理：应用美国SAS公司SAS6.04版PC统计软件包在P586计算机上进行t检验处理。
2 结果
本实验结果显示了不同时限单眼斜视及剥夺对凋亡调节抑制基因Bcl-2表达的影响，在正常组幼猫的视皮质和外侧膝状体Bcl-2蛋白的表达主要是在神经元核膜和胞浆，Bcl-2免疫阳性细胞核呈深棕色免疫阳性反应，胞浆淡染。可见在敏感期内所致MS1和MD1眼输入的同侧视皮质17区Ⅳ层及外侧膝状体相应层表现为Bcl-2免疫阳性神经元核浆染色变浅，数密度减少，Bcl-2蛋白表达水平降低[图1～8]。各组幼猫实验眼同侧视皮质17区Ⅳ层Bcl-2蛋白表达浓度及数密度经t-test检验比较：N组与MS1和MD1比较差异具有非常显著性(P<0.001)；N组与MS2和MD2组比较差异则无显著(P>0.05)。在外侧膝状体由N眼输入层与由MS1眼和MD1眼输入层比较其Bcl-2免疫阳性反应浓度及神经元数密度，结果具有差异非常显著性(P<0.01，P<0.001)，而N组与MS2和MD2组比较则差异无显著性(P>0.05)。本实验结果提示，MS1和MD1组幼猫在视觉发育敏感期内，由于长期的斜视及形觉剥夺效应以致其视觉系统神经元功能低下，对Bcl-2调节的敏感性降低，以及对NGF家族的营养保护和上调Bcl-mRNA表达水平的应答能力降低。在N组幼猫，因其双眼视平衡发育，其视皮质、皮质—外侧膝状突触连接及外侧膝状体神经元发育正常，凋亡抑制基因Bcl-2起着删除细胞死亡程序和调节NGF家族的生物效能作用。
, 百拇医药
图1 正常组猫视皮质的Bcl-2免疫细胞化学染色(x200)。可见Bcl-2免疫阳性神经元及免疫阳性反应主要分布在视皮质17区的II 、IV～VI层，在光镜下呈深棕褐色，神经元核浆浓染。
图2 正常发育猫视皮质17区的免疫细胞化学染色高倍视野(x400)。可见其IV层星形细胞着色强，Bcl-2免疫阳性神经元较多。
图3 MSl组猫视皮质17区IV层的Bcl-2免疫细胞化学染色(x400)。可见在视皮17区IV层的Bcl-2免疫阳性神经元及免疫阳性反应明显减弱在光镜下呈淡棕褐色，神经元核浆着染。
图4 MDl组猫视皮质17区IV层的免疫细胞化学染色高倍视野(x400)。可见其IV层星形细胞着色浅淡，Bcl-2免疫阳性神经元较少。
, 百拇医药
图5 N组猫外侧膝状体见A、Al和c层Bc-2蛋白免疫着色较强。
图6 外侧膝状体尼氐(Nissl)染色照片作为对照(xl00)。
图7 MSl组猫同侧外侧膝状体，可见由MSl眼输入的Al层Bcl-2蛋白免疫着色较淡(xl00)。
图8 MDl组猫同侧外侧膝状体见由MDl眼输入的Al层Bol-2蛋白免疫着色较浅(xl00)，对侧眼输入的A层Bc1-2蛋白免疫着色浓。
3 讨论
, 百拇医药
原癌基因Bcl-2是机体的一种凋亡抑制基因，在视觉系统发育敏感期内调节神经元存活[5]，并介导NGF、BDNF和NT-3的神经营养和保护作用[6]。Bcl-2基因定位于核染色体18q21上，其表达产物Bcl-2的作用为阻止细胞的凋亡，阻断细胞凋亡基因bax产物，并抑制IL-1β转化酶这一蛋白水解酶恰是细胞进入凋亡的关键蛋白[8]。本研究应用免疫细胞化学的方法探讨了正常发育，敏感期内及敏感期末单眼斜视和单眼剥夺猫视皮质及外侧膝状体神经元bcl-2表达变化规律。结果显示五组实验猫视皮质及外侧膝状体神经元都有Bcl-2蛋白表达，bcl-2免疫阳性反应存在于细胞核及胞浆中，阳性神经元轴树突不明显。在敏感期内单眼斜视和剥夺幼猫视皮质17区Ⅳ层神经元及外侧膝状体实验眼输入层神经节细胞Bcl-2免疫阳性反应浓度与正常对照相比降低，免疫阳性神经元数密度减少，而敏感期末所致单眼斜视及剥夺猫与正常对照猫比较上述指标则未见显著差异(P>0.05)，可见敏感期内单眼斜视和剥夺视觉系统神经元由于在发育中长期受斜视及形觉剥夺的影响以致功能低下，受Bcl-2调节的敏感性降低，以及对NTs的营养保护及上调Bcl-2mRNA表达水平的应答能力降低，在双眼竞争、交互抑制和神经元发育及突触连接等视觉系统塑性变化中未能占据有利位点并处于劣势，“用进废退”使对侧眼形成优势循环。这也可以解释在敏感期内当对侧眼遮盖，暴露弱视眼所出现的反转弱视的显著性效应。Bcl-2与NGF、BDNF和NT-3有交互作用，它们协同促进神经元的分化、发育、连接和重塑。而在正常视环境中，双眼视平衡发育，其视皮质、皮质—外侧膝状体突触连接、外侧膝状体神经元和视网膜神经节细胞发育正常，凋亡抑制基因Bcl-2起着删除细胞死亡程序并保护调节NGF家族的生物效能作用。有实验证明Bcl-2缺陷小鼠在出生时其交感、感觉和运动神经元的数量没有明显变化，并且可以通过外源性提供BDNF或CNTF(睫状神经营养因子)防止神经元的退行病变。引人注目的现象是在生理性细胞死亡期后，上述神经元开始发生退变并急剧减少。此项研究认为，Bcl-2在生后早期对于保持特殊的神经元群体存活具有决定作用[9]。也有人经实验发现BDNF对神经元的营养生存作用需要Bcl-2参与，因为在用了Bcl-2抗体后，虽然外源提供BDNF，但也不能阻止神经元的死亡[10]。在大脑皮质正常发育和经验诱导条件下，原癌基因Bcl-2编码一个可以删除细胞死亡程序的蛋白[11]，即Bcl-2蛋白。一般认为神经元死亡至少有两个途径，这可划分为他们对Bcl-2蛋白的敏感性和对内源性NTs的亲和力。就视觉系统发育讲，由于存在双眼竞争机制和视环境因素的影响，以此制约着视觉系统神经元的存活或凋亡。就本实验结果分析，可以认为在视皮质神经元发育、外侧膝状体—皮质纤维形成过程中Bcl-2蛋白调节其分化、连接、发育、生存或凋亡。Krajewski-S等[12]指出细胞凋亡在神经系统发育中是一种细胞生物学现象，广泛存在于诸多生理和病理过程中，许多研究表明多数细胞都具有程序死亡倾向，但由于存在内在和外界有利于生存因素的作用，使这种凋亡现象并未发生。而在视觉发育阶段由于自身病理生理和环境因素的诱导，使敏感期内单眼斜视和剥夺幼猫视觉系统由实验眼输入的视觉通路出现了退变现象。我们已知凋亡调节抑制基因Bcl-2在视觉系统发育中，可促进细胞有丝分裂信号传递使细胞进入生长周期并起着删除神经元死亡程序介导NTs的神经元保护、营养、调节生长和趋化作用，因此当敏感期内斜视和剥夺眼所支配的视觉系统神经元在与对侧眼占据突触位点竞争中处于劣势时，Bcl-2mRNA表达低下，Bcl-2蛋白及免疫阳性神经元减少并对Bcl-2的调节介导作用不敏感，以致得不到靶源性和旁分泌NTs，使其产生退变—弱视效应。反之，敏感期末手术的单斜视和剥夺是在视觉系统发育成熟之后所致，因而双眼向中枢传导的突触位点平衡，Bcl-2和NTs相交作用及调节机制完善未出现弱视效应。
, 百拇医药
本研究提示：(1)敏感期内所致单眼斜视和剥夺性弱视动物模型的视觉系统具有电生理、神经生物化学及分子生物学特征性变化。(2)敏感期内矫正斜视和剥夺可使弱视效应逆转，这是视觉经系统组织及神经分子生物学塑性变化的特征(神经生物模式形成早期)。(3)敏感期末所致斜视和剥夺短时程(本实验为16wk)的视环境破坏不能使视觉系统产生塑性(弱视)效应，这是由于在视觉发育敏感期内双眼已经形成了固有的向视中枢输入的正常连接方式、神经营养及受体分布模式。反之敏感期内所致斜视和剥夺的弱视效应在延至视觉发育敏感期后矫正时，由于双眼向中枢输入已经形成了异常的连接方式和神经营养及受体分布模式，因此可能使视觉神经系统逆转斜视和剥夺的塑性潜能降低。
从理论角度看，弱视发病机理研究属中枢神经系统发育和可塑性变化机制研究范畴，是一项既复杂又必须涉及多学科多种方法学的综合研究，单纯从哪一个方面谈论都具有一定的偏面性。从整体讲，弱视发病机理研究为脑视觉功能的学习记忆、神经元及突触的发育连接、机能状态、塑性变化、神经营养分子机制、生物活性因子及相关受体的分子机制、双眼竞争的神经生理生化机制及脑自身调节作用机制等等一系列矛盾过程的综合。本实验应用了整体电生理学、免疫细胞化学等方法从神经生理学及神经分子生物学角度探讨研究了敏感期内、末单眼斜视和剥夺动物模型视觉系统的塑性变化及弱视形成的凋亡抑制基因Bcl-2表达变化。而要较系统地阐明斜视及剥夺性弱视的发病机理，还是一项长期艰苦和充满希望的工作。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助课题
作者简介：邵立功现为解放军总医院眼科博士后研究生
参考文献
1 邵立功，郭静秋.弱视的基础与临床对比研究.眼科，1994，3(1)∶54～57
2 邵立功.弱视发病机理的多学科综合研究进展.国外医学眼科分册，1993，17(5)∶294～298
3 邵立功.视觉系统可塑性变化的分子神经生物学进展与弱视发病机制的研究.国外医学眼科分册，1999，23(1)∶25～32
4 邵立功，张应华，张东杲.弱视猫视皮质17区神经元c-fos基因表达特性的研究.中华眼科杂志，1993，29(6)∶366～369
, 百拇医药
5 Merry DE，Veis DJ，Hickey WF,et al.Bcl-2 protein expression is widespread in the developing neurons system and retained in the adult PNS.Development,1994,120(2)∶301～311
6 Allsopp TE,Wytt S,Paterson HF,et al.The proto-oncogene bcl-2 can selectively rescue neurotrophic factor-dependent neurons from apoptosis.Cell,1993,73(2)∶295～307
7 Monghan P,Robertson D,Amos TA,et al.Utrastructure localization of bcl-2 protein.J Histochem Cytochem,1992,40∶1819
, 百拇医药
8 Reed JC.Bcl-2 and the regulation of programmed cell death.J Cell Biol,1994,124∶1
9 Michaelidis TM,Sendtner M,Cooper JD,et al.Inactivation of Bcl-2 results in progressive degeneration of motoneurons,sympathetic and sensory neurons during early postnatal development.Neuron,1996,17(1)∶75～89
10 Allosopp E,Riselev S,Wyat S,et al.Role of Bcl-2 in the brain derived neurotrophic factor survival response.Eur J Neurosci,1995,7(6)∶1266～1272
, http://www.100md.com
11 Ferre I,Tortosa A,Condom E,et al.Increased expression of Bcl-2 immunoreactivity in the developing cerebral cortex of the rat.Neurosci.Lett,1994,179(1-2)∶13～16
12 Krajewski S,Krajewski M,Shabaik A,et al.Immunogistochemical determination of in vivo distribution of Bax,a dominant inhibitor of Bcl-2.Am J Pathol,1994,145(6)∶1323～1336
(收稿：1999-08-30), http://www.100md.com
单位：北京医科大学第一医院小儿眼科(100853)
关键词：斜视；剥夺；视觉系统；凋亡抑制基因
眼视光学杂志990402摘 要 目的：研究和探讨敏感期内、末不同时限单眼斜视和剥夺动物模型视觉系统凋亡调节抑制基因Bcl-2塑性变化的规律。方法：应用免疫细胞化学SABC技术染色和计算机图像分析了Bcl-2蛋白在N、MS1、MD1、MS2和MD2猫同侧视皮质17区Ⅳ层及外侧膝状体相应层的表达。结果：在正常发育幼猫的视皮质和外侧膝状体主要是在神经元核浆，呈深棕黑色免疫阳性反应，胞浆淡染。在MS1和MD1眼输入的同侧视皮质17区Ⅳ层及外侧膝状体相应层(A1)表现为Bcl-2蛋白表达的免疫阳性神经元数目减少，核浆染色淡，表明Bcl-2 mRNA表达水平降低。在同侧视皮质17区Ⅳ层表达浓度和数密度：N组与MS1和MD1组比较差异具有非常显著性(P<0.001)；N组与MS2和MD2组比较差异无显著性(P>0.05)。结论：MS1和MD1组幼猫实验眼同侧视皮质17区Ⅳ层及同侧外侧膝状体Al层神经元在视觉发育敏感期内，由于长期的斜视及形觉剥夺效应以致功能低下，对Bcl-2调节的敏感性降低，以及对NTs的营养保护及上调Bcl-2 mRNA表达水平应答能力降低，在双眼竞争的神经元发育及突触连接中处于劣势，使对侧眼形成优势循环。这也可能解释在敏感期内当对侧眼遮盖时暴露弱视眼所出现反转弱视的戏剧效应。Bcl-2与NTs有交互作用，它们协同促进神经元的分化，发育和连接重塑。在正常的视环境中，双眼视平衡发育，凋亡抑制基因Bcl-2起着删除细胞死亡程序并保护调节NGF家族的生物效能。
, http://www.100md.com
Expression of the apoptosis inhibitory gene Bcl-2 in the neurons of visual system of MS and MD kittens during visual development
Shao Ligong,Guo Jingqiu.Department of pediatric Ophthalmology,First Teaching Hospital of Beijing Medical University,General Hospital of the People's Liberation Army,Beijing 100853
Abstract Objective:To investigate plasticity changes in the regulation of the expression of apoptosis inhibitory gene bcl-2 in the visual systems of normal (N),monocularly strabismic(MS) and monocularly deprived(MD) kittens during the critical period of development.The product (bcl-2 protein) of bcl-2 gene expression is an important bioactivator.It mediates neurtrophine and protective action by the NGF family.The studies provide a basis for understanding the mechanisms and for finding effective methods to prevent and treat amblyopia due to strabismus and deprivation in children.Methods:Surgery was performed on kittens during the critical period (age 2～4 wks) to induce esotropic MS by sectioning the lateral rectus muscle of one eye and MD by lid suture.Before surgery,the animals were randomly divided into 3 groups:N,MS and MD.After the animals were reared for sixteen weeks under the same environmental conditions,they were examined with 6-Channel Pattern Visual Evoked Potentials (6CPVEP).Then,visual cortex area 17 was investigated with polyclonal antibodies for bcl-2,which was used to label the neurons of visual cortex area 17 using the immunocytochemical Streptavidin Biotin Peroxidase Complex(SABC) method.Data were analyzed from photographs from optical microscopy and Computer Image Analysis.Results:Gene expression level of bcl-2mRNA (numeric density and concentration of bcl-2 immunopositive neurons) in layer Ⅲ of the ipsilateral visual cortex area 17 and the laminas receiving ipsilateral geniculate input from the strabismic and deprived eyes are significantly lower than the input from the untreated eyes.Conclusion:Results indicate that the functional status of neurons in layer Ⅲ of visual cortex area 17 and the laminas receiving lateral geniculate input from the treated eyes during the critical period of visual development are greatly weakened in the long term in response to convergence strabismus and form deprivation.That is,the treated eyes are hyposensitive to bcl-2 regulation.Their ability to respond to neurotrophine and the protective action of NTs (neurotrophic factors) is also reduced,with causes the synaptic connections of neurons in layer Ⅲ of visual cortex area 17 and layer Al of ipsilateral geniculate input from the treated eyes to be underdeveloped because the susceptibility of neurons to bcl-2 determines whether neurons in the visual pathways are affected by the dominant during binocular viewing so that critical synaptic links develop normally.
, 百拇医药
Key words Strabismus Deprivation Visual system Bcl-2
儿童弱视主要是在小儿视觉发育敏感期内，由于各种影响视觉发育的眼病和(或)视环境的不良，使双眼视长期紊乱、视觉系统神经元功能、形态和神经生化机制异常，临床表现有外眼及眼底检查无特殊变化，又不能完全矫正其低视力(≤0.8)、失立体视和形觉障碍等体征[1]。关于发病机理，近年来各国学者结合现代高技术对弱视形成的心理物理、神经病理生理和生化过程及变化特征进行了多方位的探讨和研究，为小儿眼科临床弱视防治工作提供了参考依据和新的途径，弱视动物模型能较客观地反映人类弱视形成的特点，其研究成果具有指导意义[2～4]。为了确定凋亡抑制基因bcl-2在敏感期内、末斜视和剥夺猫视觉系统中的作用和地位，我们应用组织学和免疫细胞化学技术对敏感期内、末斜视和剥夺猫模型视皮质和外侧膝状体神经元的bcl-2基因表达产物变化进行了观察和研究，从形态学、分子神经生物学角度探讨敏感期内和敏感期末单眼斜视(monocular strabismus,MS)和单眼剥夺(monocular deprivation,MD)模型猫视皮质神经元及其突触的可塑性变化机理。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 实验动物和试剂
1.1.1 动物采用实验用纯种虎皮猫共计32只。其中4～6wk龄幼猫24只，10～12wk龄幼猫8只。动物随机分为5组：①正常组(normal group,N);②单眼斜视一组(monocular strabismus1，MS1)；③单眼剥夺一组(monocular deprivation1，MD1)。上述三组每组8只为4～6wk龄，共计24只。④单眼斜视二组(MS2)；⑤单眼剥夺二组(MD2)。上述两组每组4只为10～12wk龄，共计8只。
1.1.2 试剂及仪器 常用试剂为市售纯化学分析试剂，由中国军事医学科学院基础医学研究所提供。主要试剂：SABC(Streptavidin Biotinperoxidae Complex)、正常羊血清和Bcl-2抗体(中山公司)。主要仪器：振动切片机、CQ-970型计算机图像分析仪、多导程图形视觉电生理仪(MPVEP)、Nikon双目自动照像显微镜和脑立体定位仪。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 单眼斜视和剥夺性弱视动物模型手术制作和饲养：单眼斜视组(MS)动物模型手术制作：在微量噻胺酮(Compound Ketamine)0.1ml/kg肌注麻醉下，结膜下注射少量利多卡因(0.5%)，沿角膜缘2mm处剪开球结膜并分离找出一眼外直肌群切除，然后再彻底分离周围结缔组织及外侧韧带，术后实验眼形成内斜视。手术眼共12只(左右眼各6只)其中8只眼为4～6wk幼猫(MS1)，4只眼为10～12wk猫(MS2)。
单眼剥夺组(MD)幼猫为剪除眼睑缘周围毛发后，自内眦到外眦剪除上下睑缘各1～1.5mm，皮下及皮肤分层缝合封闭实验眼形成单眼剥夺共12只(左眼、右眼各6只)。其中敏感期内(4～6wk)8只眼(MD1)，敏感期末4只眼(10～12wk，MD2)。动物的饲养环境是在宽敞饲养室内。N和MS1，MD1，MS2及MD2组实验猫共同在自然光线环境中散放喂养。
, 百拇医药
1.2.2 实验动物的灌注固定和取材：实验动物在饲养到第16周时进行MPVEPs检测，视觉电生理实验证实猫是否产生弱视后分批灌注固定动物并快速取材。(1)动物麻醉后行开胸术，剪开心包膜，右心室切开放出心血管系统血液，快速切开左心室并经左心室主动脉插管灌注生理盐水500ml冲洗心血管系统，接快灌注4℃冷固定液(4%多聚甲醛磷酸缓冲液，pH7.2)，再慢灌注100ml含4%多聚甲醛，0.5%戊二醛和0.2%苦味酸的4℃磷酸缓冲溶液(pH7.2)2小时。在4℃冰箱放置过夜后，标本块转至15%蔗糖溶液(PBS pH7.2)中浸泡12小时，待标本块下沉后行冰冻切片或振动切片。(2)标本取材顺序为：①开颅取脑，垂直脑矢状轴切取视皮质组块，部分切片为平行视皮质17区切取，免疫组织化学染色后选取Ⅳ层组织切片照相。②冠状切取同侧和对侧外侧膝状体组织。(3)行免疫细胞化学染色标本应用振动切片，组织片厚35～40μm。(4)免疫细胞化学SABC技术处理切片：①切片入PBS缓冲溶液(0.1mol/L,pH7.2)漂洗；②用甲醇加0.3%H2O2处理切片15～30分钟(室温)以封闭内源性过氧化酶的活性；③0.2%Tritonx-100液中10分钟(室温)；④以正常羊血清孵育15～25分钟(室温)，以封闭组织中的非特异性抗原；⑤滴加兔抗人第一抗体(1∶500)bcl-2抗体，湿盒内孵育1.5小时(室温)然后在4℃冰箱过夜。⑥PBS缓冲液充分冲洗，以去除切片上非特异吸附抗体；⑦再经0.3%tritonX-100/PBS漂洗2分钟后，依次加入生物素标记的羊抗兔IgG(1∶200)和SABC复合物(1∶100)中孵育30分钟(室温)；⑧PBS缓冲液漂洗，⑨用DAB-H2O2液显色；试剂组成为DAB50mg，0.05M的TB100ml，30%30～40μl；⑩将呈色后的组织切片置于流水中，以便终止呈色反应；11酒精梯度脱水，Hemo-De透明，DPX封固；12光镜下观察计算机图像分析。
, 百拇医药
1.2.3 计算机图像分析免疫细胞化学：(1)免疫细胞化学结果分析程序：参照细胞构筑学特点，将N，MS1，MD1，MS2和MD2组内每只幼猫同侧视皮质和外侧膝状体组织连续切片各5张，在QTM970型图像分析仪的10×40倍光镜视野下，测量其Bcl-2蛋白在上述解剖部位表达的单位面积内的积分光密度(IOD/Area)及数密度(Numberical Density)，数密度用：免疫阳性细胞数/视野内面积表示。每张切片选取5个视野。(2)统计学分析处理：应用美国SAS公司SAS6.04版PC统计软件包在P586计算机上进行t检验处理。
2 结果
本实验结果显示了不同时限单眼斜视及剥夺对凋亡调节抑制基因Bcl-2表达的影响，在正常组幼猫的视皮质和外侧膝状体Bcl-2蛋白的表达主要是在神经元核膜和胞浆，Bcl-2免疫阳性细胞核呈深棕色免疫阳性反应，胞浆淡染。可见在敏感期内所致MS1和MD1眼输入的同侧视皮质17区Ⅳ层及外侧膝状体相应层表现为Bcl-2免疫阳性神经元核浆染色变浅，数密度减少，Bcl-2蛋白表达水平降低[图1～8]。各组幼猫实验眼同侧视皮质17区Ⅳ层Bcl-2蛋白表达浓度及数密度经t-test检验比较：N组与MS1和MD1比较差异具有非常显著性(P<0.001)；N组与MS2和MD2组比较差异则无显著(P>0.05)。在外侧膝状体由N眼输入层与由MS1眼和MD1眼输入层比较其Bcl-2免疫阳性反应浓度及神经元数密度，结果具有差异非常显著性(P<0.01，P<0.001)，而N组与MS2和MD2组比较则差异无显著性(P>0.05)。本实验结果提示，MS1和MD1组幼猫在视觉发育敏感期内，由于长期的斜视及形觉剥夺效应以致其视觉系统神经元功能低下，对Bcl-2调节的敏感性降低，以及对NGF家族的营养保护和上调Bcl-mRNA表达水平的应答能力降低。在N组幼猫，因其双眼视平衡发育，其视皮质、皮质—外侧膝状突触连接及外侧膝状体神经元发育正常，凋亡抑制基因Bcl-2起着删除细胞死亡程序和调节NGF家族的生物效能作用。
, 百拇医药
图1 正常组猫视皮质的Bcl-2免疫细胞化学染色(x200)。可见Bcl-2免疫阳性神经元及免疫阳性反应主要分布在视皮质17区的II 、IV～VI层，在光镜下呈深棕褐色，神经元核浆浓染。
图2 正常发育猫视皮质17区的免疫细胞化学染色高倍视野(x400)。可见其IV层星形细胞着色强，Bcl-2免疫阳性神经元较多。
图3 MSl组猫视皮质17区IV层的Bcl-2免疫细胞化学染色(x400)。可见在视皮17区IV层的Bcl-2免疫阳性神经元及免疫阳性反应明显减弱在光镜下呈淡棕褐色，神经元核浆着染。
图4 MDl组猫视皮质17区IV层的免疫细胞化学染色高倍视野(x400)。可见其IV层星形细胞着色浅淡，Bcl-2免疫阳性神经元较少。
, 百拇医药
图5 N组猫外侧膝状体见A、Al和c层Bc-2蛋白免疫着色较强。
图6 外侧膝状体尼氐(Nissl)染色照片作为对照(xl00)。
图7 MSl组猫同侧外侧膝状体，可见由MSl眼输入的Al层Bcl-2蛋白免疫着色较淡(xl00)。
图8 MDl组猫同侧外侧膝状体见由MDl眼输入的Al层Bol-2蛋白免疫着色较浅(xl00)，对侧眼输入的A层Bc1-2蛋白免疫着色浓。
3 讨论
, 百拇医药
原癌基因Bcl-2是机体的一种凋亡抑制基因，在视觉系统发育敏感期内调节神经元存活[5]，并介导NGF、BDNF和NT-3的神经营养和保护作用[6]。Bcl-2基因定位于核染色体18q21上，其表达产物Bcl-2的作用为阻止细胞的凋亡，阻断细胞凋亡基因bax产物，并抑制IL-1β转化酶这一蛋白水解酶恰是细胞进入凋亡的关键蛋白[8]。本研究应用免疫细胞化学的方法探讨了正常发育，敏感期内及敏感期末单眼斜视和单眼剥夺猫视皮质及外侧膝状体神经元bcl-2表达变化规律。结果显示五组实验猫视皮质及外侧膝状体神经元都有Bcl-2蛋白表达，bcl-2免疫阳性反应存在于细胞核及胞浆中，阳性神经元轴树突不明显。在敏感期内单眼斜视和剥夺幼猫视皮质17区Ⅳ层神经元及外侧膝状体实验眼输入层神经节细胞Bcl-2免疫阳性反应浓度与正常对照相比降低，免疫阳性神经元数密度减少，而敏感期末所致单眼斜视及剥夺猫与正常对照猫比较上述指标则未见显著差异(P>0.05)，可见敏感期内单眼斜视和剥夺视觉系统神经元由于在发育中长期受斜视及形觉剥夺的影响以致功能低下，受Bcl-2调节的敏感性降低，以及对NTs的营养保护及上调Bcl-2mRNA表达水平的应答能力降低，在双眼竞争、交互抑制和神经元发育及突触连接等视觉系统塑性变化中未能占据有利位点并处于劣势，“用进废退”使对侧眼形成优势循环。这也可以解释在敏感期内当对侧眼遮盖，暴露弱视眼所出现的反转弱视的显著性效应。Bcl-2与NGF、BDNF和NT-3有交互作用，它们协同促进神经元的分化、发育、连接和重塑。而在正常视环境中，双眼视平衡发育，其视皮质、皮质—外侧膝状体突触连接、外侧膝状体神经元和视网膜神经节细胞发育正常，凋亡抑制基因Bcl-2起着删除细胞死亡程序并保护调节NGF家族的生物效能作用。有实验证明Bcl-2缺陷小鼠在出生时其交感、感觉和运动神经元的数量没有明显变化，并且可以通过外源性提供BDNF或CNTF(睫状神经营养因子)防止神经元的退行病变。引人注目的现象是在生理性细胞死亡期后，上述神经元开始发生退变并急剧减少。此项研究认为，Bcl-2在生后早期对于保持特殊的神经元群体存活具有决定作用[9]。也有人经实验发现BDNF对神经元的营养生存作用需要Bcl-2参与，因为在用了Bcl-2抗体后，虽然外源提供BDNF，但也不能阻止神经元的死亡[10]。在大脑皮质正常发育和经验诱导条件下，原癌基因Bcl-2编码一个可以删除细胞死亡程序的蛋白[11]，即Bcl-2蛋白。一般认为神经元死亡至少有两个途径，这可划分为他们对Bcl-2蛋白的敏感性和对内源性NTs的亲和力。就视觉系统发育讲，由于存在双眼竞争机制和视环境因素的影响，以此制约着视觉系统神经元的存活或凋亡。就本实验结果分析，可以认为在视皮质神经元发育、外侧膝状体—皮质纤维形成过程中Bcl-2蛋白调节其分化、连接、发育、生存或凋亡。Krajewski-S等[12]指出细胞凋亡在神经系统发育中是一种细胞生物学现象，广泛存在于诸多生理和病理过程中，许多研究表明多数细胞都具有程序死亡倾向，但由于存在内在和外界有利于生存因素的作用，使这种凋亡现象并未发生。而在视觉发育阶段由于自身病理生理和环境因素的诱导，使敏感期内单眼斜视和剥夺幼猫视觉系统由实验眼输入的视觉通路出现了退变现象。我们已知凋亡调节抑制基因Bcl-2在视觉系统发育中，可促进细胞有丝分裂信号传递使细胞进入生长周期并起着删除神经元死亡程序介导NTs的神经元保护、营养、调节生长和趋化作用，因此当敏感期内斜视和剥夺眼所支配的视觉系统神经元在与对侧眼占据突触位点竞争中处于劣势时，Bcl-2mRNA表达低下，Bcl-2蛋白及免疫阳性神经元减少并对Bcl-2的调节介导作用不敏感，以致得不到靶源性和旁分泌NTs，使其产生退变—弱视效应。反之，敏感期末手术的单斜视和剥夺是在视觉系统发育成熟之后所致，因而双眼向中枢传导的突触位点平衡，Bcl-2和NTs相交作用及调节机制完善未出现弱视效应。
, 百拇医药
本研究提示：(1)敏感期内所致单眼斜视和剥夺性弱视动物模型的视觉系统具有电生理、神经生物化学及分子生物学特征性变化。(2)敏感期内矫正斜视和剥夺可使弱视效应逆转，这是视觉经系统组织及神经分子生物学塑性变化的特征(神经生物模式形成早期)。(3)敏感期末所致斜视和剥夺短时程(本实验为16wk)的视环境破坏不能使视觉系统产生塑性(弱视)效应，这是由于在视觉发育敏感期内双眼已经形成了固有的向视中枢输入的正常连接方式、神经营养及受体分布模式。反之敏感期内所致斜视和剥夺的弱视效应在延至视觉发育敏感期后矫正时，由于双眼向中枢输入已经形成了异常的连接方式和神经营养及受体分布模式，因此可能使视觉神经系统逆转斜视和剥夺的塑性潜能降低。
从理论角度看，弱视发病机理研究属中枢神经系统发育和可塑性变化机制研究范畴，是一项既复杂又必须涉及多学科多种方法学的综合研究，单纯从哪一个方面谈论都具有一定的偏面性。从整体讲，弱视发病机理研究为脑视觉功能的学习记忆、神经元及突触的发育连接、机能状态、塑性变化、神经营养分子机制、生物活性因子及相关受体的分子机制、双眼竞争的神经生理生化机制及脑自身调节作用机制等等一系列矛盾过程的综合。本实验应用了整体电生理学、免疫细胞化学等方法从神经生理学及神经分子生物学角度探讨研究了敏感期内、末单眼斜视和剥夺动物模型视觉系统的塑性变化及弱视形成的凋亡抑制基因Bcl-2表达变化。而要较系统地阐明斜视及剥夺性弱视的发病机理，还是一项长期艰苦和充满希望的工作。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助课题
作者简介：邵立功现为解放军总医院眼科博士后研究生
参考文献
1 邵立功，郭静秋.弱视的基础与临床对比研究.眼科，1994，3(1)∶54～57
2 邵立功.弱视发病机理的多学科综合研究进展.国外医学眼科分册，1993，17(5)∶294～298
3 邵立功.视觉系统可塑性变化的分子神经生物学进展与弱视发病机制的研究.国外医学眼科分册，1999，23(1)∶25～32
4 邵立功，张应华，张东杲.弱视猫视皮质17区神经元c-fos基因表达特性的研究.中华眼科杂志，1993，29(6)∶366～369
, 百拇医药
5 Merry DE，Veis DJ，Hickey WF,et al.Bcl-2 protein expression is widespread in the developing neurons system and retained in the adult PNS.Development,1994,120(2)∶301～311
6 Allsopp TE,Wytt S,Paterson HF,et al.The proto-oncogene bcl-2 can selectively rescue neurotrophic factor-dependent neurons from apoptosis.Cell,1993,73(2)∶295～307
7 Monghan P,Robertson D,Amos TA,et al.Utrastructure localization of bcl-2 protein.J Histochem Cytochem,1992,40∶1819
, 百拇医药
8 Reed JC.Bcl-2 and the regulation of programmed cell death.J Cell Biol,1994,124∶1
9 Michaelidis TM,Sendtner M,Cooper JD,et al.Inactivation of Bcl-2 results in progressive degeneration of motoneurons,sympathetic and sensory neurons during early postnatal development.Neuron,1996,17(1)∶75～89
10 Allosopp E,Riselev S,Wyat S,et al.Role of Bcl-2 in the brain derived neurotrophic factor survival response.Eur J Neurosci,1995,7(6)∶1266～1272
, http://www.100md.com
11 Ferre I,Tortosa A,Condom E,et al.Increased expression of Bcl-2 immunoreactivity in the developing cerebral cortex of the rat.Neurosci.Lett,1994,179(1-2)∶13～16
12 Krajewski S,Krajewski M,Shabaik A,et al.Immunogistochemical determination of in vivo distribution of Bax,a dominant inhibitor of Bcl-2.Am J Pathol,1994,145(6)∶1323～1336
(收稿：1999-08-30), http://www.100md.com